Aula 4 - Isolamento e Identificação de Streptococcus spp

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ISOLAMENTO E 
IDENTIFICAÇÃO 
DE ESTREPTOCOCCUS E 
ENTEROCOCCUS
PROFESSORA CRISTINA 
MEIRELES
ESTREPTOCOCOS
 O gênero Streptococcus é composto por bactérias 
Gram-positivas, esféricas (cocos), podem se 
apresentar em pares ou cadeias (diplococos). As 
colônias são discóides, mucóides, opacas ou 
brilhantes. 
 Esses microrganismos são considerados 
fastidiosos, pois exigem condições especiais para o 
cultivo, tais como meios enriquecidos com sangue 
ou soro, microaerofilia e altas concentrações de 
dióxido de carbono (capnofílico). 
 Os estreptococos são imóveis, não esporulados, 
mesófilos e a grande maioria anaeróbios 
facultativos. Além disso são fermentadores de 
carboidratos e apresentam perfil negativo para o 
teste da catalase, diferenciando-os 
dos Staphylococcus (MURRAY et al., 2009).
ESTREPTOCOCUS
 Trata-se de importantes patógenos humanos, com diferentes 
espécies dentro do grupo, sendo responsável por diversas 
patologias, como fasciíte necrosante (gangrena estreptocócica), 
impetigo, escarlatina, erisipela, síndrome do choque tóxico 
estreptocócico entre outras. 
 Há três formas de diferenciar e classificar as bactérias desse 
gênero:
✓ A primeira é por propriedades sorológicas que são os grupos de 
Lancefield, apresenta uma classificação de A até W. 
✓ A segunda é por perfil hemolítico (hemólise), podendo ser 
hemólise completa (beta-β), hemólise incompleta (alfa-α) e 
ausência de hemólise (gama-γ). 
✓ E a terceira classificação se baseia em características 
bioquímicas (MURRAY et al., 2009).
HEMÓLISE E 
ESTREPTOCOCOS
 Estudos mostraram que estreptococos isolados de doenças infecciosas 
de garganta e de pele freqüentemente provocam lise completa das 
células vermelhas do sangue (hemólise). Este fenômeno era identificado 
em meio ágar sangue como uma zona clara ao redor das colônias. 
 Outros estreptococos provocavam um tipo de lise incompleta, na qual as 
células vermelhas se retraem e se tornam esverdeadas (ocorre somente 
na presença de oxigênio devido à redução da hemoglobina). 
 A hemólise incompleta é denominada alfa hemólise e os estreptococos 
que a produzem foram denominados Streptococcus viridans, enquanto 
que a lise completa das células vermelhas foi denominada beta 
hemólise e os organismos que a provocam foram denominados 
Streptococcus hemolyticus. 
 Atualmente sabemos que esses nomes são inaequados e que existem 
muitas espécies que causam hemólise alfa, outras causam hemólise 
beta e algumas espécies produzem os dois tipos de hemólise 
dependendo da cepa e das condições de crescimento.
 Existem também muitos estreptococos que não são hemolíticos, os 
chamados de estreptococos gama.
TAXONOMIA
 A partir da caracterização da 
amostra como CG+ através da 
coloração de Gram, a 
determinação da família é feita 
pela prova da catalase. 
CLASSIFICAÇÃO 
DE LANCEFIELD
 Um segundo tipo de designação, também muito empregado, 
baseia-se nas características antigênicas de um polissacarídeo de 
composição variável, chamado carbohidrato C, localizado na 
parede da célula, que pode ser detectado por diferentes técnicas 
imunológicas.
 Tomando por base este polissacarídeo, os estreptococos foram 
divididos em 20 grupos sorológicos (grupos de Lancefield), 
designados por letras do alfabeto (A, B, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, 
O, P, Q, R, S, T, U e V).
STREPTOCOCCUS 
PYOGENES
 O Streptococcus pyogenes é 
caracterizado pela presença 
do polissacarídeo do grupo A 
de Lancefield que é um 
polímero de 
Nacetilglicosamina e 
ramnose. Ele pode ser 
dividido em grupos 
sorológicos graças à 
presença de duas proteínas 
na sua parede celular, a 
proteína M e a proteína T.
STREPTOCOCCUS 
PYOGENES
 Patologias associadas:
➢ Faringite - O Streptococcus pyogenes é responsável por mais de 
90% das faringoamigdalites bacterianas.
➢ Piodermite - Fazem parte do grupo das piodermites 
estreptocócicas a erisipela, o impetigo e a ectima.
➢ Febre Reumática - Febre Reumática: caracteriza-se por lesões 
inflamatórias não supurativas envolvendo coração, articulações, 
tecido celular subcutâneo e sistema nervoso central. Os 
indivíduos que sofrem um episódio de febre reumática são 
particularmente predispostos a outros episódios, em 
conseqüência de infecções estreptocócicas subsequentes das 
vias aéreas superiores.
Erisipela Ectima
STREPTOCOCCUS 
PNEUMONIAE
 Essa espécie é composta por 
cocos Gram-positivos com 
forma de chama de vela, 
agrupados aos pares. 
 Os pneumococos, em geral, 
possuem a cápsula composta 
de polissacarídeos, cujas 
diferenças antigênica 
permitem caracterizar 84 tipos 
sorológicos distintos. 
TIPOS DE 
INFECÇÕES
 O Streptococcus pneumoniae é um dos agentes bacterianos 
mais frequentemente associados a infeções graves como 
pneumonia, sinusite, meningite, septicemia e otite média. 
 Os pneumococos também têm sido relacionados a infeções 
oculares e, ocasionalmente, isolados de fluido peritoneal, urina, 
secreção vaginal, exsudatos de feridas entre outros espécimes 
clínicos.
ESTREPTOCOCOS 
DO GRUPO D
 Os estreptococos possuidores de antígeno do grupo D eram, 
antigamente, divididos em duas categorias: os enterococos e os 
não enterococos. Com a alocação dos enterococos em uma 
novo gênero, os estreptococos do grupo D são, atualmente, em 
termos de importância médica, representados pelo 
Streptococcus bovis.
 Apresentam suceptibilidade à antimicrobianos , sendo 
encontrados normalmente no trato gastro intestinal. Existe uma 
tendência de se encontrar o S. bovis associado ao câncer de 
intestino grosso embora não haja evidência de qualquer relação 
etiopatogênica.
IDENTIFICAÇÃO
 A identificação do estreptococo isolado em cultura é baseada na morfologia 
bacteriana e coloração de Gram, características do crescimento e reação 
hemolítica em placas de ágar sangue de carneiro a 5%, ausência de catalase 
e lise em presença de optoquina e de desoxicolato de sódio.
 A partir do crescimento em ágar chocolate, primo isolamento ou amostra 
transportada a outro laboratório:
• Semear em ágar sangue de carneiro 5% para obtenção de colônias isoladas;
• Efetuar picadas na superfície do meio para observar a hemólise sensível ao 
oxigênio;
• Incubar a 35±2ºC por 18 - 24 h;
• Observar as características do crescimento: as colônias devem ser lisas, 
pequenas, brilhantes, acinzentadas, elevadas, podendo apresentar 
concavidade central, rodeadas por halo de hemólise parcial, com aspecto 
esverdeado. Um esfregaço corado pelo Gram deverá confirmar as 
características de diplococos com pontas em forma de lança, Gram-positivos.
IDENTIFICAÇÃO
• Repicar colônia bem isolada para ágar chocolate 10% e incubar 
a 35±2ºC por 18 - 24 horas;
• Preparar esfregaço e corá-lo pelo Gram para verificar a pureza 
da cultura;
• Proceder às provas de identificação (optoquina e solubilidade 
em bile). A prova da catalase deve ser feita para caracterizar o 
gênero.
Teste da catalase
Finalidade:
A presença da catalase permite separar os estreptococos catalase negativa de outros cocos Gram-positivos 
produtores de catalase, por exemplo, estafilococos. A enzima catalase converte o peróxido de hidrogênio em 
oxigênio e água. A liberação do oxigênio se observa pela formação de bolhas.
Procedimento:
•Colocar sobre uma placa de Petri, ou uma lâmina, uma porção do isolado de uma cultura 18 - 24 horas, 
evitando tocar no meio de cultura. Repetir o procedimento com cepas controle positivo e negativo;
•Adicionar uma gota de peróxido de hidrogênio a 3%;
•Observar a formação de bolhas de ar, indicativo de teste positivo para catalase.
Interpretação:
Não havendo formação de bolhas, o teste é negativo e indicativo de Streptococcus.
Prova da optoquina
Finalidade:
A optoquina (etil-hidrocupreína hidroclorídrica) é uma droga solúvel em água que se difunde rapidamente 
em meio de cultura sólido. Para este teste, em geral,utiliza-se o disco de optoquina de 6 mm contendo 5 
µg da droga. O teste tem sensibilidade maior que 95%, sendo considerado de baixo custo e simples de ser 
realizado.
Procedimento:
•Preparar uma suspensão do isolado em solução salina a 0,85% estéril com densidade ótica de 0,08 a 0,1 
ao comprimento de onda de 625 nm, ou correspondente a 0,5 da escala de McFarland;
•Semear a suspensão em uma placa de ágar sangue de carneiro 5% de forma a obter crescimento 
confluente;
•Após a absorção da suspensão pelo meio de cultura, colocar um disco de optoquina na superfície do meio 
semeado, com o auxílio de uma pinça;
•Incubar a 35±2ºC e 5 - 7% de CO2 por 18 - 24 h;
•Fazer a leitura do halo de inibição do crescimento bacteriano.
Interpretação:
Presença de halo ≥ 14 mm indica que a cultura é sensível à optoquina, sendo identificado 
para Streptococcus pneumoniae.
Teste da solubilidade em bile (desoxicolato de sódio a 2%)
Finalidade:
Detergentes fracos, como os sais biliares desoxicolato de sódio ou taurocolato de 
sódio têm a capacidade de lisar seletivamente o S. pneumoniae em fase 
logarítmica do crescimento. Estes sais ativam as enzimas autolíticas (autolisinas) 
produzidas pelo pneumococo, acelerando a reação lítica natural da bactéria. O 
teste da bile-solubilidade pode ser realizado tanto em meio de cultura líquido 
como sólido. A turvação produzida por uma suspensão de pneumococo ficará 
completa ou parcialmente límpida ao se adicionar os sais biliares. Em meio 
sólido, as colônias bile-solúveis “desaparecem” em contato com algumas gotas 
de solução destes sais e o teste é um pouco mais difícil de ser visualizado. 
Quando se utiliza crescimento de cultura em caldo, deve-se ajustar o pH do meio 
para 7, para evitar reações falso-negativas devido à precipitação do desoxicolato
de sódio em pH ácido (pH ≥ 6,5).
Atenção: Se após 2 h não houver diferença entre os tubos, o teste é negativo e 
identifica Streptococcus do grupo viridans
TESTE DA SOLUBILIDADE EM BILE (DESOXICOLATO DE SÓDIO A 2%)
 Procedimento:
• Preparar uma suspensão bacteriana densa a partir da cultura recente, que não tenha ultrapassado 18 - 24 horas de incubação;
• Separar dois tubos de ensaio com transparência adequada para observar a presença de suspensão bacteriana. Marcar um com “C” 
(tubo controle) e outro com “T” (tubo teste);
• Adicionar solução de desoxicolato de sódio a 2% ao tubo “T” e solução salina a 0,85% ao tubo “C”. Os volumes em cada tubo devem 
ser iguais, pequenos, mas suficientes para fazer a leitura, por exemplo, 0,5 mL. Adicionar a cada tubo o mesmo volume, por exemplo, 
0,5 mL da suspensão bacteriana;
• Homogeneizar e fazer a leitura imediatamente, após 1 h e até 2 h de incubação a 35±2ºC.
 Interpretação:
A leitura é feita de preferência contra um anteparo escuro, observando a turvação do tubo T em relação ao tubo C. Verificar se o tubo 
C apresenta uma suspensão homogênea da cultura em solução salina. Compará-lo com o conteúdo do tubo teste, contendo a cultura 
em desoxicolato de sódio. Se o tubo T apresentar turvação visivelmente menor que o controle ou estiver límpido, o teste é positivo e 
identifica Streptococcus pneumoniae; e confirmada a positividade, os tubos podem ser desprezados conforme
Teste de PYR (pyrrolidonil arilamidase)
Finalidade:
O teste de PYR determina a atividade da enzima pyrrolidonil arilamidase produzida pelo S. 
pyogenes, mas não pelos demais estreptococos β-hemolíticos. Colônias β-hemolíticas de 
enterococos podem ser confundidas com S. pyogenes, pois ambas apresentam positividade neste 
teste.
Procedimento:
•Com auxílio de uma pinça, retirar um disco de PYR do frasco e colocá-lo sobre uma lâmina ou 
placa de Petri vazia;
•Pingar uma gota de água destilada estéril (não utilizar salina, pois torna a reação mais lenta e 
menos intensa);
•Realizar um esfregaço com a bactéria a ser testada, recém-isolada, sobre o disco de PYR 
umidecido;
•Aguardar alguns minutos e colocar uma gota do reagente PYR. A reação ocorrerá em até 1 minuto.
Interpretação:
•Teste de PYR positivo apresenta o desenvolvimento de cor vermelha;
•O aparecimento de coloração amarela ou alaranjada indica resultado negativo;
•S. pyogenes e Enterococcus spp. são PYR positivos.
Teste de sensibilidade à bacitracina
Finalidade:
O teste tem a finalidade de diferenciar S. pyogenes de outras cepas do grupo A ou de outras 
espécies com colônias β-hemolíticas PYR positivas.
Procedimento:
•Um disco de 0,04 U de bacitracina é aplicado a uma placa de ágar sangue de carneiro que 
tenha um inóculo com 4 ou 5 colônias puras de Streptococcus spp., a ser testado.
•Incubar 12 horas (overnight) a 35± 2ºC.
Interpretação:
A presença de qualquer halo de inibição ao redor do disco é interpretado como sensibilidade a 
bacitracina e indicativo de S. pyogenes.
ENTEROCOCCUS
 É a maior e mais heterogênea família de bactérias Gram negativas 
de importância médica. 
 São considerados atualmente: 27 gêneros / 102 espécies / 08 
grupos indefinidos.
 Independente da complexidade, mais de 95% das amostras 
implicadas em caso clínicos são colocadas em 25 espécies, sendo 
possivel o isolamento de enterobactérias de qualquer amostra 
clínica. 
 São bacilos Gram negativos, não esporulados, com motilidade 
variável, oxidase negativos, e que crescem em meios básicos (caldo 
peptona), meios ricos (ágar sangue, ágar chocolate e CLED), meios 
seletivos (Mac Conkey, EMB). 
 São anaeróbios facultativos (crescem em aerobiose e anaerobiose), 
fermentam a glicose com ou sem produção de gás, são catalase 
positivos, e reduzem nitrato a nitrito. 
ENTEROCOCCUS
 E. faecalis mais frequente (85-90%); E. faecium (5- 10%) 
 As colônias podem apresentar perfil hemolítico, sendo α-
hemolíticas, β-hemolíticas ou γ-hemolíticas 
 Grupo D de Lancefield
 Epidemiologia - Habitante do tubo digestivo, vagina e cavidade oral 
 Transmitidos de pessoa a pessoa pelas mãos do pessoal hospitalar
ENTEROCOCCUS
 Mecanismos de petogenicidade
 Tem poucos factores de virulência conhecidos 
 Produzem bacteriocinas 
 Muito resistentes à terapeutica – pressão seletiva
DOENÇAS POR 
ENTEROCOCCUS
 Dentre as espécies descritas, os E. faecalis e E. 
faecium são os mais associados a manifestações clínicas. 
Outras espécies como E. gallinarum, E. casseliflavus, E. 
durans e E. avium são clinicamente de menor 
importância.
A associação deste gênero com endocardite bacteriana é 
classicamente conhecida. Por outro lado, denota-se 
atualmente o isolamento destas bactérias, em diversos 
sítios, causando infecções relacionadas à assistência à 
saúde, como:
• Infecções do trato urinário (ITU);
• Infecções da corrente sanguínea (ICS);
• Infecções de sítio cirúrgico e intra-abdominais.
 No trato urinário, além de infecção, podem representar 
colonização ou bacteriúria assintomática.
DOENÇAS POR 
ENTEROCOCCUS
 Mais raramente, são descritas pneumonias em pacientes 
debilitados, bem como empiema em portadores de doença 
hepática, mesmo na ausência de outras manifestações 
respiratórias.
 As meningites também são apontadas como infecções 
infreqüentes, ocorrendo na presença de fatores predisponentes, 
como o período neonatal, alterações do sistema nervoso, 
incluindo defeitos anatômicos e procedimentos neurocirúrgicos, 
doenças crônicas de base e, em dados mais recentes, em 
pacientes portadores da síndrome da imunodeficiência humana 
(AIDS).
DIAGNÓSTICO 
LABORATOTRIAL
 Gram 
 Em Cultura são nutritivamente exigentes- Vit, bases de ácidos 
nucléicos, glicose e são anaeróbios facultativos -
 São capazes de crescer na presença de concentrações 
elevadas de NaCl e sais biliares, essas características são 
utilizadas para distinguir enterococos de outros cocos Gram-
positivos catalase negativos
 Identificação bioquímica
MEIOS DE CULTURA
 As diferentes espécies de enterococos multiplicam-se bem em ágar Müeller-Hinton acrescidos ou não desangue, ou ainda com outras bases como Brain Heart Infusion (BHI) e outros meios enriquecidos. 
 O ágar azida é um exemplo de meio enriquecido bastante utilizado para o isolamento destas bactérias, 
principalmente quando existe a possibilidade da amostra conter concomitantemente bacilo Gram-negativo.
 Em ágar sangue, as colônias, após 24 h de crescimento, têm aproximadamente 1 a 2 mm de diâmetro.
 Aproximadamente um terço dos Enterococcus faecalis apresentam-se com beta-hemólise em ágar contendo 
sangue humano, coelho ou cavalo, mas são não-hemolíticas em sangue de carneiro. As outras espécies são 
usualmente não-hemolíticas.
 A temperatura adequada de crescimento é de 35±2ºC e, apesar de algumas cepas crescerem melhor em 
concentrações aumentadas de CO2 não existe necessidade de atmosfera especial.
PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
 Apesar de não haver características fenotípicas que 
diferenciem totalmente o gênero Enterococcus de outros 
gêneros relacionados, a presença de cocos Gram-positivos 
dispostos aos pares ou em cadeias, catalase negativa com 
prova de PYR positiva, crescimento em caldo de NaCl a 
6,5% e hidrólise da esculina são provas presentes na maioria 
das espécies do gênero Enterococcus. 
 Com provas de PYR positivo
 Hidrólise da esculina positiva 
 Crescimento em caldo de NaCl a 6,5% são provas presentes 
na maioria das espécies do gênero Enterococcus.
NaCl 6,5%
Princípio:
Capacidade do microrganismo crescer em altas concentrações de 
sal. Tem por finalidade diferenciar Enterococcus spp. 
de Streptococcus spp.
Procedimento:
•Inoculam-se 2 a 3 colônias a serem testadas em um caldo BHI 
suplementado com 6,0% de NaCl (com ou sem indicador);
•Incubam-se a 35±2ºC por até 72 h.
Interpretação:
A turvação ou mudança de cor (no caso de adição de indicador) é 
indicativa de crescimento bacteriano.
BILE ESCULINA
Ágar bile-esculina
Princípio:
Esculina presente no meio é hidrolizada, formando esculetina e 
dextrose. A esculetina reage com sais de ferro presentes no meio 
tornando-o enegrecido. Tem por finalidade 
diferenciar Enterococcus spp. e Streptococcus 
bovis (Streptococcus do grupo D) de Streptococcus spp.
Procedimento:
•Inoculam-se 2 a 3 colônias a serem testadas em base contendo 
bile-esculina;
•Incubam-se a 35±2ºC por até 72 h.
Interpretação:
Presença de cor enegrecida no meio é indicativa da presença de 
hidrólise, isto é, uma prova positiva
 Existem diversos testes convencionais que 
levam à identificação das espécies 
de Enterococcus e gêneros relacionados, 
classificando-o em cinco diferentes grupos 
fisiológicos. 
 Estes incluem a hidrólise da arginina, a 
detecção da produção de ácido a partir de 
diferentes carboidratos: arabinose, sorbitol, 
manitol, rafinose, sorbose e sacarose, 
utilização do piruvato de sódio, motilidade e 
produção de pigmento. 
TESTES COMERCIAIS
A produção de ácido a partir de metil-a-D-glucopiranosídeo (MGP) auxilia na 
diferenciação do E. faecium, E. gallinarum e E. casseliflavus. Considerando 
que para fins de controle e prevenção de infecções, as espécies de E. 
faecium e E. faecalis necessitam rapidamente ser distinguidas de E. 
gallinarum e E. casseliflavus, a fermentação da xilose é outro teste de valor. 
Apesar de todos os enterococos fermentarem a xilose, pelo fato de os E. 
gallinarum possuírem a enzima pré-formada, a reação para esta espécie 
ocorre com maior rapidez, permitindo leitura em duas horas.
Alguns testes comerciais, baseados em características bioquímicas, têm 
utilização para o diagnóstico e identificação das espécies dos enterococos 
como o API 20 STREP (bioMérieux), o sistema BD BBL Crystal (Becton 
Dickinson Cockeysville) e identificação de enterococos (PROBAC® do Brasil). 
MÉTODOS AUTOMATIZADOS
 Os métodos automatizados também são usualmente utilizados para a
identificação e detecção rápida da resistência antimicrobiana dos 
enterococos. Dentre os mais utilizados destacam-se o Vitek system® e 
Vitek® (bioMerieux), MicroScan® (Siemens) e Phoenix® (BD).
 O desempenho dos métodos automatizados vem sendo constantemente 
observado, incluindo diversas alterações nos painéis e cartões, além de 
adaptações no software. A acurácia tem-se mostrado melhor para E.
faecalis, oferecendo maior dificuldade para E. faecium e outras espécies.
 Para detecção de resistência, podem ser utilizados os métodos manuais 
qualitativos (disco-difusão) e quantitativos com micro ou macrodiluição. Do 
ponto de vista de rotina diária no laboratório de microbiologia, uma opção é 
a metodologia epsilométrica do E-test® (AB Biodisk, Solna, Sweden).
TERAPIA E 
RESISTÊNCIA 
ANTIMICROBIANA
O principal obstáculo que o clínico enfrenta no tratamento de infecções 
enterocócicas é que esses organismos são intrinsecamente resistentes a 
vários antibióticos e também têm a capacidade de ampliar a resistência a
antibióticos.
Esses problemas terapêuticos têm sido reconhecidos há muito tempo e, no 
passado, cerca de 60% das falhas no tratamento da endocardite enterocócica 
ocorreram quando a penicilina foi usada como monoterapia nessas infecções. 
A terapia bactericida é necessária para taxas de cura ótimas na endocardite e 
outras infecções endovasculares. Portanto, a terapêutica combinada deve ser 
administrada nessas situações.
O aparecimento de resistência a vários agentes antimicrobianos coloca 
enormes problemas clínicos porque o objetivo da terapia bactericida não pode 
ser alcançado. A combinação de ß-lactâmicos e aminoglicósidos ou 
cefalosporinas é útil, pois apresenta efeitos sinérgicos; assim, em infecções 
graves, endocardites ou meningites, uma combinação de dois antibióticos é 
recomendada.