PCR real time

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PCR real-time 
Reação em cadeia da polimerase (PCR): 
uma das tecnologias mais utilizadas na biologia 
molecular. 
Na PCR, sequências específicas dentre de um 
template de DNA ou cDNA são copiadas e 
amplificadas, gerando de milhares a milhões de 
cópias da mesma sequência - amplicons. 
P a ra a amp l i fi c a ção s ã o u t i l i z a d o s 
oligonucleotídeos sequência-específicos, DNA 
polimerase termoestável e um termociclador. 
O DNA é amplificado exponencialmente, 
dobrando a quantidade de produto-alvo a cada 
ciclo. 
Na PCR tradicional (endpoint), a detecção e 
quantificação do amplificado são realizadas no 
final da reação, após o último ciclo. Para isso, 
geralmente são utilizados métodos como 
eletroforese em gel e análise de imagem. 
A PCR tradicional é utilizada, principalmente, 
para clonagem e sequenciamento de sequências 
específicas. 
Na PCR em real-time, ou também chamado de 
PCR quantitativo (qPCR), o amplificado é 
quantificado em cada ciclo. 
 PCR real-time x RT-PCR 
Real-time: quantificação acontecendo durante a 
reação de PCR. 
RT-PCR: com transcriptase reversa, possui passo 
adicional para converter RNA em cDNA. 
qPCR: PCR quantitativo, aplica-se para os dois 
exemplos anteriores. 
Para essa quantificação, são util izados 
marcadores fluorescentes que fornecem um sinal 
fluorescente que aumenta proporcionalmente ao 
número de amplicons gerados. 
Podem ser utilizados corantes que se ligam a 
DNA dupla-fita (ds-DNA), moléculas 
corantes acopladas aos primers, ou probes 
que hibrideza com produtos de PCR durante 
a amplificação. 
Pelo monitoramento da reação na fase 
exponencial, é possível determinar a quantidade 
do alvo no início da reação. 
A fluorescência é plotada junto com o número 
do ciclo de reação, gerando um gráfico de 
amplificação que representa o acúmulo de 
produto pela duração do tempo da reação 
completa de PCR: 
VANTAGENS DE PCR real-time 
Habilidade de monitorar o progresso da reação 
em tempo real. 
Capacidade de medir precisamente a 
quantidade de amplicon em cada ciclo, 
permitindo a quantificação do material no início 
da reação. 
Amplificação e detecção no mesmo tubo, 
eliminando manipulações pós-PCR. 
PCR Real-Time: PASSOS 
1. Desnaturação: incubação em temperatura 
alta para que o DNA dupla-fita seja 
“desmanchado" em fitas simples e para 
afrouxar estruturas secundárias nessas fitas 
simples. Geralmente é utilizada a maior 
temperatura que a enzima DNA polimerase 
consegue aguentar (normalmente 95oC). O 
tempo de desnaturação pode ser aumentado 
se o DNA molde tem um conteúdo GC alto. 
2. Anelamento: sequências complementares 
(pr imers e DNA molde) vão sof rer 
hibridização. Uma temperatura apropriada é 
utilizada a partir do cálculo da temperatura 
de meeting (Tm) dos primers (tipicamente 5oC 
abaixo da Tm do primer). 
3. Extensão: a 70-72oC, a atividade da DNA 
polimerase é ótima, e a extensão dos primers 
ocorre em taxas de até 100 bases por 
segundo. Quando um amplicon na RT-PCR é 
pequeno, esse passo é geralmente combinado 
com o passo de anelamento, usando 60oC 
como temperatura. 
qRT-PCR em dois passos (Two-step) 
Começa com a transcrição reversa do RNA 
total ou RNA poli(A) em cDNA por uma 
enzima transcriptase reversa. 
A primeira fita da reação de síntese de 
cDNA pode ser feita com primers aleatórios, 
oligo(dT) ou primers específicos para genes 
(GSPs). 
Para dar uma representação real para todos 
os alvos e para evitar o bias 3’ de primers 
oligo(dT), pesquisadores utilizam primers 
aleatórios ou mistura de aleatórios e 
oligo(dT). 
A temperatura utilizada para síntese de 
cDNA depende da enzima transcriptase 
reversa escolhida. 
Após a transcrição reversa, aproximadamente 
10% do cDNA é transferido para um tubo 
separado para a reação de PCR real-time. 
qRT-PCR em um passo (One-step) 
Combina a reação de síntese da primeira fita 
de cDNA e a reação de PCR real-time em 
um mesmo tubo, simplificando o processo e 
reduzindo a possibilidade de contaminação. 
Primers específicos para genes (GSP) são 
necessários. Isso se deve pelo fato que 
oligo(dT) ou primers aleatórios geram 
produtos não-específicos na reação com um 
passo, e reduzem a quantidade do produto 
de interesse. 
COMPONENTES DE PCR REAL-TIME 
DNA polimerase 
Determina a performance da PCR. 
Taq DNA polimerase possui atividade 
residual em temperaturas baixas - primers 
podem se anelar de maneira não-específica e 
a polimerase gera produtos não-específicos 
em temperaturas menores. 
Enzima hot-start: garante que a DNA 
polimerase não está ativa antes do passo de 
extensão. 
Transcriptase Reversa 
Importante escolher uma com grande 
rendimento de cDNA completo, mas também 
com boa atividade em altas temperaturas. 
Performance em alta temperatura também é 
importante para a desnaturação de RNA 
com estrutura secundária. 
Em RT-PCR one-step, uma TR que mantém 
sua atividade em alta temperatura permite 
que GSP com alta Tm seja usada, 
aumentando a especificidade e diminuindo 
background. 
dNTPs 
Maior sensibilidade quando são utilizados 
dNTPs e DNA polimerase do mesmo 
fabricante. 
Concentração de magnésio 
Cloreto ou sulfato de magnésio são 
geralmente utilizados na concentração final 
de 3mM. 
A concentração ótima para um alvo 
especifico pode variar de 3 a 6 mM. 
Boa técnica experimental 
Uso de ponteiras com barreira de aerosol e 
tubos com tampas rosqueáveis pode diminui 
problemas de contaminação cruzada. 
Preparar uma mistura master com todos os 
componentes menos a amostra para reduzir o 
número de pipetagens e, consequentemente, 
contaminação cruzada de poços e outros 
erros. 
Template 
Usar de 10 a 1000 cópias de ácido nucleico 
template para cada reação de PCR real time 
- equivalente a 100 pg a 1ug de DNA 
genômico, ou cDNA gerado de 1pg a 100 
nm de RNA total. 
Excesso de template pode diminuir a 
eficiência da PCR por trazer contaminantes. 
Dependendo da especificidade dos primers 
para o cDNA, pode ser necessário o 
tratamento dos templates de RNA para 
reduzir a contaminação deles por DNA com 
DNaseI. 
RNA puro e intacto é necessário para síntese 
de cDNA de alta qualidade e importante 
para quantificação de mRNA precisa. 
RNA deve ser livre de contaminação com 
RNase. 
Isolamento de mRNA geralmente não é 
necessário, mas pode melhorar condições 
para cDNA específicos. 
DESIGN DE PRIMERS 
Um dos parâmetros mais importantes para 
PCR. 
Devem ter de 18 a 24 nucleotídeos. 
Devem ser específicos para a sequência-alvo 
e livres de estruturas secundárias. 
Evitar sequências homopoliméricas ou 
motivos repetidos, que podem hibridizar de 
forma inapropriada. 
O par de primers deve ter temperaturas de 
melting compatíveis - dentro de 1oC e devem 
conter aproximadamente 50% de conteúdo 
GC. 
Primers com alto conteúdo de GC podem 
formar híbridos imperfeitos estáveis. 
Já um alto conteúdo de AT diminui a Tm de 
híbridos perfeitamente compatíveis. 
Se possível, o terminal 3’deve ser rico em GC 
para melhorar o anelamento no terminal em 
que será estendido. 
Analisar a sequência do por para verificar se 
não haverá complementaridade entre eles, 
possibilitando hibridização e formação de 
primers-dímeros. 
Para qRT-PCR, criar primers que anelam em 
éxons nos dois lados de um íntron para 
permitir diferenciação entre a amplificação 
do cDNA e contaminação potencial de DNA 
genômico pela análise de curva de melting. 
Para confirmar a especificidade dos primers, 
fazer uma busca no BLAST. 
Resultados ótimos podem precisar de 
titulação do primer em concentrações de 50 
a 500 nM. 
Uma concentração final de 200 nM para 
cada primer é efetiva para a maioria das 
reações. 
ANÁLISE DE PCR REAL-TIME 
BASELINE 
Refere-se ao nível de sinal durante os ciclos 
iniciais do PCR, geralmente entre ciclos 3 e 
15, no qual há pouca mudança nosinal 
fluorescente. 
O baixo sinal de baseline pode ser 
considerado o background ou ruído da 
reação. 
A baseline é determinada empiricamente 
para cada reação, por análise pelo usuário 
ou análise automática do gráfico de 
amplificação. 
A determinação de baseline deve considerar 
ciclos suficientes para eliminar o background 
encontrado em ciclos iniciais, mas não deve 
incluir ciclos em que a amplificação do sinal é 
maior que o background. 
Para comparar reações ou experimentos 
diferentes de PCR real-time, a baseline deve 
ser definida da mesma maneira para cada. 
THRESHOLD 
É o nível de sinal que reflete um aumento 
estatisticamente significativo sobre o sinal de 
baseline calculado. 
Representa um sinal de amplificação 
relevante. 
Geralmente, o software do equipamento 
determina o threshold no valor de 10 vezes o 
desvio padrão do valor de fluorescência da 
baseline. 
No en tan to , o th re sho ld pode se r 
determinado em qualquer ponto da fase 
exponencial da PCR. 
Ct - CICLO DE THRESHOLD 
É o número do ciclo em que o sinal de 
fluorescência ultrapassa o threshold. 
O Ct é utilizado para calcular o número 
inicial de cópias de DNA pois ele é 
inversamente relacionado a quantidade inicial 
do alvo. 
Por exemplo, comparando resultados de 
amostras contendo quantidades diferentes de 
um alvo, a amostra com o dobro de 
quantidade inicial vai gerar um Ct um ciclo 
antes que uma amostra com 1x de alvo. 
A medida que o template diminui, o número 
do c ic lo em que uma ampl ificação 
significativa é vista aumenta. Com uma 
diluição de 10x, os valores de Ct ficam a 3,3 
ciclos de distância. 
CURVA-PADRÃO 
Uma diluição em série de um template com 
concentração conhecida de alvo é utilizada 
para fazer uma curva. 
Assim, a concentração inicial de uma amostra 
desconhecida pode ser calculada a partir 
desta curva. 
COEFICIENTE DE CORRELAÇÃO (R2) 
Medida da linearidade da curva padrão. 
Idealmente R2 = 1 mas o valor máximo 
geralmente é 0.999. 
INTERSECÇÃO-Y 
Corresponde ao limite teórico de detecção da 
reação, ou o valor de Ct esperado para o 
menor valor de alvo que consegue apresentar 
um aumento estatisticamente significativo de 
amplificação. 
Teoricamente, a PCR é capaz de detectar 
uma única cópia de um alvo, no entanto, um 
número de cópias entre 2 e 10 é o limite 
mínimo que pode ser confiavelmente 
quantificado por PCR. 
Medida direta de sensibilidade. 
Útil para comparar diferentes sistemas e 
alvos. 
FASE EXPONENCIAL 
A quantificação do alvo é feita na parte 
inicial da fase exponencial. 
Nessa parte, os reagentes ainda estão em 
excesso, a DNA polimerase ainda é 
altamente eficiente e o produto de 
amplificação (ainda em baixa concentração) 
não compete com os pr imers para 
anelamento. 
SLOPE 
É a fase log- l i near da reação de 
amplificação. 
Medida de eficiência de reação. 
Para resultados precisos e reprodutíveis, a 
eficiência deve ser próxima a 100%, o que 
equivale a uma slope de -3.32. 
EFICIÊNCIA 
Eficiência = 10 (-1/slope) - 1 
Idealmente, deveria ser 100%, o que significa 
que o template dobra a cada ciclo na 
amplificação exponencial. 
Fatores experimentais como comprimento, 
estrutura secundária, e conteúdo GC do 
amplicon podem influenciar a eficiência. 
Outras condições que influenciam: uso de 
reagentes em concentrações não-ótimas, 
qualidade da enzima, presença de inibidores 
de PCR (pode aumentar para mais de 110%). 
RANGE DINÂMICO 
Range no qual um aumento na concentração 
inicial do material resulta em um aumento 
correspondente no produto de amplificação. 
Deve ser em 7-8 ordens de magnitude para 
DNA plasmidial e pelo menos 3-4 log para 
cDNA e DNA genômico. 
QUANTIFICAÇÃO ABSOLUTA 
Descreve um experimento de PCR real-time 
no qual a expressão do gene de interesse em 
uma amostra (por exemplo, amostra tratada) 
é comparada com a expressão do mesmo 
gene em outra amostra (não-tratada). 
Um gene normalizador, como a B-actina, é 
usado como controle para variabilidade 
experimental.