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Métodos Imunológicos

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1 
Métodos Imunológicos 
Guido Lenz 
Biofísica, 2004 
1. Introdução 
 Ter como função proteger um organismo de qualquer componente externo num mundo 
de miriades de componentes internos e de uma imensidão de prováveis invasores fez do 
sistema imunológico, ao longo da evolução, um dos sistemas biológicos mais complexas. 
 Pela sua importância vital e talvez pela sua transparente complexidade, o sistema 
imunológico sempre produziu um grande fascínio sobre os cientistas, fascínio este 
comparável ao dedicado ao sistema nervoso, talvez por suas semelhanças no que se refere à 
memória, comunicação e inteligência (para usar os termos cunhados para este, mas 
certamente úteis naquele). 
 O conhecimento adquirido sobre o sistema imunológico, principalmente sobre a produção 
de anticorpos, conduziu a uma revolução nas técnicas usadas nas ciências biológicas. 
Atualmente uma grande parte dos métodos bioquímicos e histológicos lança mão desta 
poderosa ferramenta chamada anticorpo para alcançar os seus objetivos. Acredito que os 
métodos imunológicos, ao lado da biologia molecular, estão entre os maiores avanços em 
termos metodológicos conseguidos nos últimos 10 ou 20 anos. 
 Duas afirmações podem ser citadas para argumentar porque os métodos imunológicos 
são um conhecimento imprescindível na formação de estudantes das áreas biológicas: 1. o 
envolvimento direto com estes métodos, para estudantes que irão usá-los em trabalhos 
experimentais e 2. melhor compreensão de assuntos que usam estes métodos, que são 
largamente encontrados em todas os ramos das ciências biológicas. 
 Estes argumentos, aliás, valem para o estudo dos métodos como um todo, pois, para que 
se possa analisar de forma crítica um texto científico, é necessário ter conhecimento dos 
métodos usados para produzir os resultados, sem o qual a análise se torna no mínimo 
superficial. 
2. Anticorpos 
 Anticorpos são proteínas que reconhecem um antígeno de forma específica e com alta 
afinidade. Discutiremos a seguir como estas proteínas são produzidas nos organismos pelos 
linfócitos e como isto pode ser manipulado para fins específicos. 
 
 
2 
2.1 Produção 
 A descoberta dos mecanismos de produção de anticorpos é, sem sombra de dúvida, uma 
das grandes vitórias das ciências biológicas neste século, devido a sua complexidade, mas 
principalmente pelos benefícios que representa para a humanidade. Discutiremos apenas 
superficialmente os mecanismos que levam à geração de anticorpos, pois a complexidade 
deste assunto não permite a sua análise aprofundada neste texto (certamente isto será feito 
em disciplinas específicas). 
2.1.1 Mecanismo de Síntese de Anticorpos 
 Os anticorpos são produzidos pelos linfócitos B, que se originam na medula, sendo 
distribuídos pelo organismo inteiro através do sistema linfático. A quantidade de linfócitos no 
corpo humano é estimado em cerca de dois trilhões (2 x 1012), sendo esta quantidade elevada 
fundamental para o perfeito funcionamento do sistema imunológico, como veremos a seguir. 
 O funcionamento do sistema imunológico, e conseqüentemente da produção de 
anticorpos é explicada pela teoria de seleção clonal. Esta teoria afirma que no embrião 
sejam produzidos, por recombinação genética,1 uma imensa variedade de linfócitos cada qual 
contendo um receptor diferente 2. No período embrionário, os receptores dos linfócitos que 
reagirem com algum antígeno serão eliminados, fazendo com que os linfócitos que 
respondem a componentes do próprio organismo morram. Se neste período estiverem 
presentes antígenos externos, não se desenvolverá nenhuma imunidade contra este 
antígeno. Por outro lado, se algum antígeno do organismo não puder ser “encontrado”, 
futuramente este antígeno será interpretado como estranho e se desenvolverá uma reação 
autoimune. 
 Quando um antígeno ingressa em um organismo adulto, o(s) linfócito(s) que tiver(em) o 
receptor para este antígeno se reproduzem, e se diferenciam, voltando toda a sua atividade 
para a síntese de anticorpos (o mesmo anticorpo que eles possuem como receptor - ou seja, 
aquele que reage com o antígeno). Desta forma, um certo período após o antígeno ter 
entrado em contato com o organismo, inicia-se um grande produção de anticorpos, que 
poderá então precipitar o antígeno, tirando-o de circulação (Figura 1). 
 
1 acredita-se que genes altamente variáveis possam se recombinar de inúmeras formas para produzir 
uma variedade extremamente grande de anticorpos. 
2 este receptor na realidade é um anticorpo produzido somente por este linfócito que pode se 
comunicar com o interior, sinalizando tanto a morte (no embrião) como a proliferação (no adulto) 
 
 
3 
 
 É necessário destacar que o sistema imunológico produz uma diversidade tão grande de 
anticorpos que ligará em virtualmente tudo e depois seleciona o que é próprio e o que é 
estranho, o que significa que os linfócitos são selecionados e não moldam o anticorpo de 
acordo com o antígeno3. 
 Linfócitos imaturos quando ativados pelo antígeno se diferenciam em linfócitos maduros, 
produtores de anticorpos e também linfócitos de memória, que, numa segunda exposição ao 
antígeno, se ativam muito mais rapidamente do que as células virgens fazendo com que a 
segunda resposta imunológica seja muito mais intensa e rápida do que a primeira. 
2.1.2 Tipos 
 Um certo antígeno pode ser reconhecido por vários linfócitos, levando a ativação de 
vários clones de linfócitos B. Cada qual destes clones reconhece uma parte diferente ou se 
liga de uma forma diferente ao antígeno, através de uma parte do antígeno denominada 
epitopo, que é a parte do antígeno efetivamente reconhecida pelo anticorpo para que a 
interação antígeno-anticorpo possa ocorrer. Até antígenos pequenos como a grupo dinitrofenil 
podem ser reconhecidos por vários linfócitos, ou seja, possuem vários epitopos. Desta forma, 
 
3 embora o anticorpo, após a seleção do linfócito B que o produz, pode ser alterado afim de produzir 
um aumento na sua afinidade, o que parece ser um forma de moldagem antígeno específica. 
 
Figura 1. Produção de anticorpos pelos linfócitos B. 
 
 
4 
um antígeno grande, como uma proteína, pode possuir inúmeros epitopos, cada qual 
induzindo a produção de um anticorpo específico. 
2.1.2.1 Policlonais 
 Anticorpos policlonais (como diz o nome) possuem vários clones, ou seja, se originam de 
diferentes linfócitos B, o que significa que reagem com vários epitopos do antígeno (por 
exemplo, várias partes de uma proteína). 
2.1.2.2 Monoclonais 
 Este tipo de anticorpo provém de somente um linfócito B, selecionado artificialmente e 
replicado diversas vezes como um clone. Desta forma, este anticorpo liga somente a um 
epitopo de uma única forma. 
2.1.3 Produção de Anticorpos Policlonais 
2.1.3.1 Antígeno 
 O primeiro passo para a produção de um anticorpo é a purificação do antígeno. Isto pode 
ser realizado de diversas formas, usando técnicas de purificação como cromatografia e 
eletroforese. Com o desenvolvimento e o barateamento da síntese de peptídeos, muitos 
anticorpos são produzidos usando-se peptídeos de 10 a 14 aminoácidos acoplados a uma 
proteína carreadora. 
2.1.3.2 Imunização 
 A imunização é realizada aplicando-se no animal (coelho, camundongo, cabra etc.) o 
antígeno juntamente com conjunto de substâncias que ativam o sistema imunológico, 
denominados de coadjuvantes, como por exemplo o coadjuvante de Freud. Após alguns dias, 
o sangue do animal é recolhido e, através de centrifugação, é separado o plasma sanguíneo 
(soro), na qual se encontram os anticorpos. 
2.1.3.3 Purificação 
 Algumas vezesé possível utilizar o soro, pois a grande maioria de anticorpos ali 
presentes são os anticorpos sintetizados contra o antígeno injetado, mas geralmente é 
importante separar a fração das imunoglobulinas ou de preferência do anticorpos específico. 
Isto geralmente é realizado com cromatografia por afinidade, na qual se usa a a proteína A 
(ver Pontes item 2.3.1) ou o próprio antígeno como fase estacionária numa coluna de 
afinidade, sendo que o anticorpo purificado é liberado da coluna através do uso de uma 
solução com pH 2,5. 
 
 
5 
2.1.4 Produção de Anticorpos Monoclonais 
 A Figura 2 mostra um esquema da produção 
de anticorpos monoclonais. Após imunizar o animal 
(como descrito no item anterior), retira-se linfócitos 
do baço e funde-se estas células com mielomas 
(ver legenda da Figura 2) o que produz hibridomas 
imortalizados. Após selecionar as células com um 
meio de cultura que permite o crescimento 
somente de hibridomas, estas são colocadas em 
placas de cultura a uma densidade de uma célula 
por poço, fazendo com que as células de cada 
poço sejam descendentes de somente uma célula 
de hibridoma, ou seja, um clone. Estes hibridomas 
iniciarão a produção de anticorpos, que estarão 
presentes no meio de cultura. O(s) clone(s) que 
produzirem os anticorpos com maior afinidade e 
mais específicos podem ser selecionados através 
de testes usando técnicas imunológicas como a 
imunodetecção. 
 Uma descoberta crucial para a produção de 
anticorpos monoclonais foi a imortalização dos 
linfócitos, fazendo com que, uma vez feito este 
processo, se possa produzir anticorpos por um 
tempo indeterminado. 
 * 1. Injetar o rato com a proteína X; 2. Células de mieloma imortalizadas (tipo de cançer) e 
inaptas de crescer em um meio HAT (meio que contém certos inibidores que afetam somente estas 
células); 3. retirar alguns linfócitos do baço do rato, sendo que alguns destes produzirão o anticorpo 
desejado; 4. misturar e fundir as células e passar para um meio HAT; 5. células não fundidas 
morrerão pois não são imortalizadas (linfócitos) ou não resistem ao HAT; 6. hibridomas crescem e se 
multiplicam; 7. células únicas são cultivadas em poços individuais; 8. testar o sobrenadante de cada 
poço contra a proteína X. 
 
2.2 Estrutura 
 Os anticorpos, coletivamente denominados imunoglobulinas (Ig), são formados por 
quatro subunidades ligadas entre si por quatro pontes dissulfeto, como mostra a Figura 3. 
Camundongo 
Imunizado com antígeno X 
 
 
Linfócitos do baço que produzem 
AC contra X são isolados. 
 
 
Linfócitos são fundidos com 
mielomas (imortais) 
 
 
Células híbridas são selecionadas 
(mieloma/linfócito) 
 
 
Células são clonadas 
 
 
 
AC é produzido no meio de cultura 
e este meio é testado. 
 
 
 
Linhagem que produz o melhor AC 
é crescida e o AC é purificado. Por 
serem células imortais, isto pode 
ser realizado indefinidamente. 
 
Figura 2. Produção de anticorpos 
monoclonais* 
 
 
6 
Estas quatro subunidades são constituídas de duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias 
leves (L). A forma dos anticorpos se assemelha a de um 
“Y”, sendo que na parte de “cima” se encontram dois 
sítios idênticos de ligação ao antígeno, o que possibilita a 
ligação cruzada entre eles, podendo desta forma produzir 
uma malha antígeno/anticorpo, isto é, um precipitado. 
 Os anticorpos são classificados em IgA, IgD, IgE, IgM 
e IgG, sendo que o IgG representa 75% das Ig totais e 
devido a isso é tão largamente utilizado nas técnicas 
envolvendo anticorpos. 
 O sítio de reconhecimento dos antígenos está 
localizado onde as partes variáveis de H e L se 
encontram, fazendo com que variações tanto de H como 
de L alterem este sítio, sendo que o responsável pela imensa variedade de anticorpos 
possíveis parece ser a combinação das variações destes dois sítios. 
2.3 Conjugados 
 Como foi discutido acima, os anticorpos têm como principal característica a 
especificidade pelo antígeno. Para que estes possam ser usados na detecção de antígenos 
específicos num universo de milhares, é necessário que os anticorpos estejam conjugados, 
isto é, ligados, geralmente de forma covalente, a compostos que permitam a separação 
(esferas de agarose) ou a detecção (peroxidase, flouróforos, ouro). A seguir, analisaremos as 
características dos conjugados mais utilizados. 
 No caso da agarose, geralmente usa-se o brometo de cianogênio (NCBr), que reage com 
os grupos OH da agarose formando a agarose ativada (contendo o grupo (-O-C(=NH2)-Br)). 
Este grupo reage com aminas primárias, como é o caso do aminoácido lisina. Pode ocorrer 
que esta forma de ligação não funcione adequadamente devido ao impedimento estérico (isto 
é, a lisina da proteína não consegue atingir a agarose ativada). Para contornar este problema, 
pode utilizar-se agarose ativada por grupos epoxi ligadas à agarose por espaçadores (por 
exemplo contendo 12 carbonos). Estes grupos epoxi podem ligar-se a vários grupos químicos 
como NH2, COOH, SH e OH, facilitando em muito a ligação da agarose ao anticorpo. 
2.3.1 Pontes 
 A modificação de anticorpos é um processo bastante trabalhoso. Devido a isso, 
geralmente usa-se vários anticorpos, sendo o primeiro (que reconhece o antígeno - ver Figura 
7), sem nenhuma modificação, reconhecido por um segundo anticorpo, que nada mais é do 
 
Figura 3. Estrutura geral dos 
anticorpos. 
 
 
7 
que um anticorpo contra a imunoglobulina do animal no qual foi produzido o primeiro 
anticorpo, sendo este anticorpo ligado a alguma molécula de detecção, como por exemplo a 
peroxidase ou moléculas fluorescentes. 
2.3.2 Separação 
 Para que se possa separar um antígeno do restante de componentes de um 
homogeneizado, é necessário que o anticorpo específico para este antígeno esteja ligado a 
algo facilmente separável. Geralmente liga-se o anticorpo a esferas de agarose que é um 
material inerte e pode ser utilizado tanto em colunas cromatográficas como pode ser 
facilmente separado por centrifugação (como no caso da imunoprecipitação). A ponte entre 
as esferas de agarose e o anticorpo é geralmente feita pela proteína A, um polipeptídeo de 42 
kDa, isolado do Stphylococcus aureus, que se liga fortemente à região Fc das 
imunoglobulinas de várias espécie. Esta propriedade é muito útil para separar 
imunoglobulinas, especialmente do tipo IgG, através de cromatografia de afinidade ou na 
imunoprecipitação. 
2.3.3 Detecção 
 Para a detecção do anticorpo são utilizados diversos métodos, escolhidos de acordo com 
a técnica. 
2.3.3.1 Peroxidase 
 A peroxidase é uma enzima que usa o H2O2 para oxidar os seus substratos. Estes 
substratos são desenhados de tal forma que a sua oxidação possa ser detectada pela 
liberação de luz (luminol), pela formação de uma precipitado colorido (DAB) ou então pela 
transformação de um composto incolor num 
composto colorido e que possa ser determinado 
quantitativamente por espectroscopia. 
 O luminol, na presença de H2O2 e 
peroxidase emite luz, que pode ser captada por 
filmes de raio-X, sendo principalmente usada na imunodetecção. 
 A diaminobanzidina (DAB), na presença de H2O2 e peroxidase, forma um polímero de cor 
marrom, precipitando no local no qual se encontra a peroxidase, sendo principalmente 
utilizada em estudos de imunocitoquímica. Existe uma grande variedade de compostos que 
podem ser utilizados como cromóforos, fornecendo as mais variadas cores, utilizáveis na 
técnica de ELISA, sendo o ABTS (2, 2'-azino-di(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate) um exemplo 
de corante que se torna verde-azulado na presença de peroxidase. 
NH
NH
O
O
NH2
O-
N2
H2O2
PeroxidaseNH2
O
O
O- Luz+ +
 
Figura 4. Reação do luminol 
 
 
8 
2.3.3.2 Fosfatase alcalina 
 A fosfatase alcalina é uma enzima que hidrolisa ligações fosfato. Desta forma, os 
cromóforos são compostos que possuem grupos fosfato, e que com a perda deste grupo 
fosfato adquiram cor, como é o caso do p-Nitrofenil-fosfato, que se torna amarelo ao perder o 
grupo fosfato. 
2.3.3.3 Fluoróforo 
 Fluoróforo é um composto que emite luz de uma certo comprimento de onda (λ) 
(coloração) quando excitado por uma luz de um outro λ. A tabela abaixo mostra alguns 
fluoróforos: 
Tabela 1. Fluoróforos com os seus λs de excitação, emissão e coloração. 
Fluoróforo λ de excitação (nm) λ de emissão (nm) Coloração 
Fluoresceína 495 525 verde 
Rhodamina 552 570 vermelho 
 
 Fluoróforos com características diferentes torna possível marcar antígenos diferentes 
com cores diferentes em um mesmo tecido ou célula, permitindo a observação simultânea de 
dois ou mais componentes. 
2.3.4 Metais pesados 
 O principal metal pesado conjugado a anticorpos é ouro. Isto permite localizar antígenos 
através da microscopia eletrônica, permitindo o estudos citológicos bastante específicos. 
2.4 Amplificação do sinal 
 Uma das características mais importantes dos métodos imunológicos de detecção é a 
sua alta sensibilidade. Para que isto seja possível, utiliza-se vários “truques” que amplificam o 
sinal. Quando se utiliza uma enzima para a detecção, esta amplificação provém do fato de 
que aquela enzima poderá produzir vários sinais (fótons de luz, cromóforos, etc), pois a 
enzima continuará ativa enquanto tiver substrato. 
3. Técnicas 
3.1 Purificação 
 
 
9 
 Como discutido anteriormente, uma das principais características dos anticorpos é a sua 
especificidade pelo substrato. Parece óbvio que este especificidade possa ser utilizada para a 
purificação de proteínas. Neste item abordaremos duas técnicas que utilizam anticorpos como 
forma de purificação, a imunoprecipitação e a cromatografia por afinidade. 
3.1.1 Imunoprecipitação 
 Na imunoprecipitação usa-se um anticorpo 
ligado à minúsculas esferas agarose (que é uma 
resina) para precipitar o antígeno. Geralmente esta 
ligação entre anticorpo e agarose é feita através de 
uma proteína A, mas também pode ser feita através 
de outras pontes como a biotina/estreptoavidina (ver 
Ponte 2.3.1). 
 Nesta técnica é importante mencionar que o 
lisado deve ser feito em um meio que permite a 
ligação antígeno/anticorpo, isto é, contendo 
reduzidas concentrações de detergentes não-
iônicos e condição de pH e força iônica adequadas. 
 A este lisados, adiciona-se o anticorpo contra o 
antígeno que se deseja separar e depois a proteína 
A ligada à agarose. Como as esferas de agarose 
possuem um tamanho imenso quando comparadas com os componentes celulares 
encontrados no lisado, pode-se precipitá-las com facilidade usando uma centrifugação a 
baixa velocidade. Após esta centrifugação pode-se dissolver o precipitado (no qual está o 
antígeno ligado à agarose) em uma solução de eletroforese para que esta antígeno possa ser 
analisado através da técnica eletroforética. 
3.1.2 Cromatografia por Afinidade 
 A principal característica que se busca na fase estacionária de uma cromatografia é que 
esta ligue de forma diferenciada os compostos a serem separados. Vários compostos podem 
produzir esta ligação diferencial baseados principalmente em propriedades químicas dos 
compostos. Os anticorpos tem como principal vantagem não ligar apenas de forma 
diferenciada a certos compostos, mas sim selecionar de forma específica um composto. Para 
conseguir isto, ligando-se um anticorpo a uma fase estacionária e se faz passar o lisado que 
contém o antígeno. 
 
Figura 5. Imunoprecipitação. A esquerda uma 
sepação das proteínas da célula. A 
direita uma imunoprecipitação com 
anticorpo específico, que reconhece o 
antígeno e um outro um um anticorpo 
inespecífico 
 
 
10 
 Após lavar a coluna cromatográfica por um certo período de tempo para retirar os 
componentes não ligados, se elui o antígeno purificado com uma solução contendo condições 
que diminuam a interação antígeno/anticorpo, como, força iônica mais elevada, pH diferente 
do pH fisiológico, detergentes ou solventes apolares. 
 Quando comparado com outras cromatografias, a de afinidade geralmente é a que tem 
um poder de purificação mais elevado. 
3.2 Quantificação e análise 
3.2.1 Imunodetecção 
 A imunodetecção (também denominada “imunoblotting”) é uma técnica que possibilita 
reconhecer e quantificar antígenos a partir de um gel de eletroforese, geralmente SDS-PAGE. 
3.2.1.1 Transferência para a Membranas 
 O gel de eletroforese é um meio pouco apropriado para a imunodetecção, isto é, não é 
um bom suporte para as ligações antígeno/anticorpo. Assim sendo, utiliza-se membranas 
constituídas geralmente de papel, isto é, de celulose, alterada quimicamente. Como exemplo 
pode-se citar a nitrocelulose, que possui grupos nitro ligados à celulose produzindo desta 
forma um suporte com alta afinidade 
por proteínas, fazendo com que 
estas permaneçam presas a sua 
superfície. 
 Para transferir o antígeno do 
gel de eletroforese para a 
membrana utiliza-se um campo 
elétrico (mesmo princípio da 
eletroforese). Neste método, coloca-
se a membrana sobre o ânodo (+) coberto por vários papeis filtro e em seguida o gel, que 
entrará em contato com o cátodo (-), também através de papéis filtro, fazendo com que as 
proteínas, ainda embebidas em SDS (-), possam migrar para o ânodo. Este “sanduíche” é 
mostrado na Figura 6. 
 Um método alternativo, denominado “dot”, permite o uso do lisado celular para a 
detecção do antígeno. Neste caso, não é necessário separar as proteínas por eletroforese, 
sendo uma pequena quantidade do lisado celular (~0,3µl) pingado diretamente sobre a 
membrana. 
 
Figura 6. Transferência das proteínas para a membrana. 
 
 
11 
3.2.1.2 Bloqueio 
 Como a membrana possui uma alta afinidade por proteínas é necessário bloqueá-la, pois 
ao contrário os anticorpos se ligariam a toda a superfície da membrana e não, como 
desejado, especificamente ao antígeno. 
 Para bloquear a membrana geralmente se usa leite em pó desnatado, mas polímeros 
sintéticos como a poli-vinil-pilorridona (PVP) também podem ser usados, principalmente em 
casos nos quais os componentes do leite prejudicam a ligação antígeno/anticorpo. 
3.2.1.3 Primeiro anticorpo 
 Feito isto, adiciona-se o primeiro anticorpo, ou seja, aquele que se ligará ao antígeno. 
Este anticorpo é adicionado em uma solução que mimetiza a solução na qual ele foi 
sintetizado, ou seja, o meio extracelular nos quais os linfócitos B estão embebidos na hora de 
se ligarem ao antígeno e serem selecionados para produzí-lo (um tampão com pH 7,5 e força 
iônica em torno de 1 0sm - 500mM NaCl). A diluição (título) e o tempo de reação, quando não 
especificado pelo fabricante (no caso de anticorpos comerciais) precisam ser determinados 
empiricamente. 
3.2.1.4 Segundo anticorpo 
 
Figura 7. Componentes da imunodetecção 
 
 
12 
 Muitas vezes o primeiro anticorpo já possui um componente que possa ser detectado 
(dispensando o presente item e o seguinte) ou uma molécula ponte que se ligue a uma 
molécula de detecção, dispensando o segundo anticorpo. Quando isto não é o caso, o 
segundo anticorpo se faz necessário. Este anticorpo é desenvolvido contra o IgG do animal 
no qual foi desenvolvido o primeiro anticorpo. 
 Por exemplo: se o primeiro anticorpo foi desenvolvido 
em camundongo, precisaremos neste passo um anticorpo 
anti-IgG de camundongo (obviamente desenvolvido em 
outro animal). 
 Este segundoanticorpo possui ou um componente do 
tipo ponte ou um componente detectável. Mas por que da 
existências deste passo, se estes componentes podem ser 
colocados diretamente nos primeiros anticorpos? Isto está 
principalmente relacionado com a dificuldade de se 
modificar um anticorpo, ou seja, colocar nele algum 
componente. Usando o segundo anticorpo, dispensa a 
modificação do primeiro anticorpo, sendo possível desta 
forma produzir primeiros anticorpos contra vários antígenos 
e modificar somente o segundo anticorpo. A montagem de 
todos os componentes da imunodetecção pode ser vista na 
Figura 7. 
 A detecção pode ser feita de várias formas, como discutido no item 2.3.3. 
3.2.2 Imunocitoquímica 
 A imunocitoquímica usa o mesmo princípio da imunodetecção, isto é, a ligação 
específica do anticorpo detectável ao antígeno. A única diferença está na apresentação do 
antígeno, que em vez de estar sobre uma membrana se encontra no tecido fixado. Este 
método tem uma precisão menor quando comparado com a imunodetecção, mas tem como 
principal vantagem mostrar a localização cito e histológica do antígeno. 
 Os sistemas de detecção nesta técnica geralmente são a peroxidase / DAB 
(diaminobenzidina) + H2O2 ou então os fluoróforos discutidos no item 2.3.3.3. Usando 
diversos fluoróforos ligados a diferentes anticorpos é possível determinar em um mesmo 
tecido a colocalização de dois ou mais antígenos, fato muito importante para a pesquisa em 
biologia celular. 
 
Figura 8. Especificidade da 
imunodetecção. Somente a 
proteína específica é 
reconhecida. 
 
 
13 
 
Figura 9. Imunocitoquímica utilizando dois anticorpos. Foto da esquerda: Imunocitoquímica com um 
anticorpo contra uma cinase (verde) sendo o DNA corado com DAPI (azul); figura do meio: a 
mesma célula, corado com um anticorpo que reconhece γ-tubulina (vermelho), um 
componente do centrosomo. Figura da direita, sobreposição das outras duas imagens, 
mostrando a co-localização no centrosomo. 
3.2.3 Radioimunoensaio 
 Este método usa o antígeno marcado radioativamente e anticorpos para determinar a 
concentração de antígenos com uma precisão bastante elevada, sendo bastante usada para 
a determinação da concentração de hormônios. 
 Este método se baseia basicamente na reação reversível antígeno anticorpo. Como 
podemos ver na Figura 10 o antígeno marcado (At*) 
compete pelo anticorpo (Ac) com o antígeno não marcado 
(At) para formar o complexo AcAt (marcado ou não). 
Quando se adiciona o antígeno não marcado (cuja 
concentração é desconhecida) a reação Ac + At* em 
equilíbrio com AcAt* será deslocada para a esquerda, pois a concentração de um dos 
reagentes, isto é Ac, diminuiu, fazendo com que a concentração de AcAt* também diminua 
(segundo a lei de equilíbrio de Le Chatelier). Assim sendo, isolando-se o complexo AcAt 
(marcado ou não) e medindo-se a radiaoatividade deste complexo (com isso somente 
detectando AcAt*) será possível determinar At, que é justamente a concentração de antígeno 
que se pretende determinar. 
 Como em outros métodos quantitativos, estes métodos também exigem que se faça uma 
curva padrão (usando concentrações conhecidas de At) e comparar estes valores com os 
encontrados nas amostras desconhecidas. 
 Alguns variantes desta técnica podem usar, ao invés do antígeno marcado, anticorpo 
marcado, sendo o procedimento experimental bastante semelhante. 
 
Figura 10. Radioimunoensaio 
 
 
14 
3.2.4 ELISA 
 Esta técnica usa um princípio semelhante à imunodeteção, com a diferença que na 
ELISA o antígeno é preso a uma superfície (geralmente de poliestireno) através de um 
anticorpo. Uma vez o antígeno ligado ao anticorpo imobilizado, este complexo pode ser 
reconhecido por um outro anticorpo, desta vez ligado a uma enzima que possa produzir um 
composto facilmente detectável. 
 A grande vantagem desta técnica é que, como a detecção é uma reação enzimática, 
torna possível a detecção de quantidades muito reduzidas de antígeno pois permitindo que a 
reaão ocorra por um tempo elevado cosegue-se produzir uma quantidade considerável de 
alguma molécula detectável (fluoróforo). Um exemplo é a detecção do hormônio placental 
ganadotrofina corínica, um teste de gravidez bastante confiável. 
4. Conclusão 
 Os métodos imunológicos estão distribuído amplamente tanto na pesquisa como na 
análise bioquímica. Dentre as diversas vantagens destas técnicas, duas parecem ser as mais 
importantes para o grande sucesso destes métodos: A grande especificidade facilmente 
conseguida com os anticorpos e a grande sensibilidade destes métodos além da imensa 
diversidade e maleabilidade destas técnicas, uma vez que praticamente todos os 
componentes usados nestes métodos podem ser interligados, basta utilizar as pontes 
adequadas. 
 Estas características fizeram dos métodos imunológicos de grande utilidade em várias 
áreas das ciências biológicas e médicas, sendo o seu conhecimento fundamental tanto nas 
ciências básicas como nas aplicadas. 
5. Referências 
Alberts, B, Dennis, B., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Watson, J. D., Molecular Biology of the 
Cell, 3rd Ed. Garland Publ. New York. (1995). 
Voet, D. Voet, J., Biochemistry, 2nd Ed. John Wiley & Sons, New York, (1995). 
Roitt, I., Brostoff, J., Male, D., Immunology, 2nd Ed. Gower Med. Publishing, London, (1989).

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