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Métodos Imunológicos

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é possível utilizar o soro, pois a grande maioria de anticorpos ali 
presentes são os anticorpos sintetizados contra o antígeno injetado, mas geralmente é 
importante separar a fração das imunoglobulinas ou de preferência do anticorpos específico. 
Isto geralmente é realizado com cromatografia por afinidade, na qual se usa a a proteína A 
(ver Pontes item 2.3.1) ou o próprio antígeno como fase estacionária numa coluna de 
afinidade, sendo que o anticorpo purificado é liberado da coluna através do uso de uma 
solução com pH 2,5. 
 
 
5 
2.1.4 Produção de Anticorpos Monoclonais 
 A Figura 2 mostra um esquema da produção 
de anticorpos monoclonais. Após imunizar o animal 
(como descrito no item anterior), retira-se linfócitos 
do baço e funde-se estas células com mielomas 
(ver legenda da Figura 2) o que produz hibridomas 
imortalizados. Após selecionar as células com um 
meio de cultura que permite o crescimento 
somente de hibridomas, estas são colocadas em 
placas de cultura a uma densidade de uma célula 
por poço, fazendo com que as células de cada 
poço sejam descendentes de somente uma célula 
de hibridoma, ou seja, um clone. Estes hibridomas 
iniciarão a produção de anticorpos, que estarão 
presentes no meio de cultura. O(s) clone(s) que 
produzirem os anticorpos com maior afinidade e 
mais específicos podem ser selecionados através 
de testes usando técnicas imunológicas como a 
imunodetecção. 
 Uma descoberta crucial para a produção de 
anticorpos monoclonais foi a imortalização dos 
linfócitos, fazendo com que, uma vez feito este 
processo, se possa produzir anticorpos por um 
tempo indeterminado. 
 * 1. Injetar o rato com a proteína X; 2. Células de mieloma imortalizadas (tipo de cançer) e 
inaptas de crescer em um meio HAT (meio que contém certos inibidores que afetam somente estas 
células); 3. retirar alguns linfócitos do baço do rato, sendo que alguns destes produzirão o anticorpo 
desejado; 4. misturar e fundir as células e passar para um meio HAT; 5. células não fundidas 
morrerão pois não são imortalizadas (linfócitos) ou não resistem ao HAT; 6. hibridomas crescem e se 
multiplicam; 7. células únicas são cultivadas em poços individuais; 8. testar o sobrenadante de cada 
poço contra a proteína X. 
 
2.2 Estrutura 
 Os anticorpos, coletivamente denominados imunoglobulinas (Ig), são formados por 
quatro subunidades ligadas entre si por quatro pontes dissulfeto, como mostra a Figura 3. 
Camundongo 
Imunizado com antígeno X 
 
 
Linfócitos do baço que produzem 
AC contra X são isolados. 
 
 
Linfócitos são fundidos com 
mielomas (imortais) 
 
 
Células híbridas são selecionadas 
(mieloma/linfócito) 
 
 
Células são clonadas 
 
 
 
AC é produzido no meio de cultura 
e este meio é testado. 
 
 
 
Linhagem que produz o melhor AC 
é crescida e o AC é purificado. Por 
serem células imortais, isto pode 
ser realizado indefinidamente. 
 
Figura 2. Produção de anticorpos 
monoclonais* 
 
 
6 
Estas quatro subunidades são constituídas de duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias 
leves (L). A forma dos anticorpos se assemelha a de um 
“Y”, sendo que na parte de “cima” se encontram dois 
sítios idênticos de ligação ao antígeno, o que possibilita a 
ligação cruzada entre eles, podendo desta forma produzir 
uma malha antígeno/anticorpo, isto é, um precipitado. 
 Os anticorpos são classificados em IgA, IgD, IgE, IgM 
e IgG, sendo que o IgG representa 75% das Ig totais e 
devido a isso é tão largamente utilizado nas técnicas 
envolvendo anticorpos. 
 O sítio de reconhecimento dos antígenos está 
localizado onde as partes variáveis de H e L se 
encontram, fazendo com que variações tanto de H como 
de L alterem este sítio, sendo que o responsável pela imensa variedade de anticorpos 
possíveis parece ser a combinação das variações destes dois sítios. 
2.3 Conjugados 
 Como foi discutido acima, os anticorpos têm como principal característica a 
especificidade pelo antígeno. Para que estes possam ser usados na detecção de antígenos 
específicos num universo de milhares, é necessário que os anticorpos estejam conjugados, 
isto é, ligados, geralmente de forma covalente, a compostos que permitam a separação 
(esferas de agarose) ou a detecção (peroxidase, flouróforos, ouro). A seguir, analisaremos as 
características dos conjugados mais utilizados. 
 No caso da agarose, geralmente usa-se o brometo de cianogênio (NCBr), que reage com 
os grupos OH da agarose formando a agarose ativada (contendo o grupo (-O-C(=NH2)-Br)). 
Este grupo reage com aminas primárias, como é o caso do aminoácido lisina. Pode ocorrer 
que esta forma de ligação não funcione adequadamente devido ao impedimento estérico (isto 
é, a lisina da proteína não consegue atingir a agarose ativada). Para contornar este problema, 
pode utilizar-se agarose ativada por grupos epoxi ligadas à agarose por espaçadores (por 
exemplo contendo 12 carbonos). Estes grupos epoxi podem ligar-se a vários grupos químicos 
como NH2, COOH, SH e OH, facilitando em muito a ligação da agarose ao anticorpo. 
2.3.1 Pontes 
 A modificação de anticorpos é um processo bastante trabalhoso. Devido a isso, 
geralmente usa-se vários anticorpos, sendo o primeiro (que reconhece o antígeno - ver Figura 
7), sem nenhuma modificação, reconhecido por um segundo anticorpo, que nada mais é do 
 
Figura 3. Estrutura geral dos 
anticorpos. 
 
 
7 
que um anticorpo contra a imunoglobulina do animal no qual foi produzido o primeiro 
anticorpo, sendo este anticorpo ligado a alguma molécula de detecção, como por exemplo a 
peroxidase ou moléculas fluorescentes. 
2.3.2 Separação 
 Para que se possa separar um antígeno do restante de componentes de um 
homogeneizado, é necessário que o anticorpo específico para este antígeno esteja ligado a 
algo facilmente separável. Geralmente liga-se o anticorpo a esferas de agarose que é um 
material inerte e pode ser utilizado tanto em colunas cromatográficas como pode ser 
facilmente separado por centrifugação (como no caso da imunoprecipitação). A ponte entre 
as esferas de agarose e o anticorpo é geralmente feita pela proteína A, um polipeptídeo de 42 
kDa, isolado do Stphylococcus aureus, que se liga fortemente à região Fc das 
imunoglobulinas de várias espécie. Esta propriedade é muito útil para separar 
imunoglobulinas, especialmente do tipo IgG, através de cromatografia de afinidade ou na 
imunoprecipitação. 
2.3.3 Detecção 
 Para a detecção do anticorpo são utilizados diversos métodos, escolhidos de acordo com 
a técnica. 
2.3.3.1 Peroxidase 
 A peroxidase é uma enzima que usa o H2O2 para oxidar os seus substratos. Estes 
substratos são desenhados de tal forma que a sua oxidação possa ser detectada pela 
liberação de luz (luminol), pela formação de uma precipitado colorido (DAB) ou então pela 
transformação de um composto incolor num 
composto colorido e que possa ser determinado 
quantitativamente por espectroscopia. 
 O luminol, na presença de H2O2 e 
peroxidase emite luz, que pode ser captada por 
filmes de raio-X, sendo principalmente usada na imunodetecção. 
 A diaminobanzidina (DAB), na presença de H2O2 e peroxidase, forma um polímero de cor 
marrom, precipitando no local no qual se encontra a peroxidase, sendo principalmente 
utilizada em estudos de imunocitoquímica. Existe uma grande variedade de compostos que 
podem ser utilizados como cromóforos, fornecendo as mais variadas cores, utilizáveis na 
técnica de ELISA, sendo o ABTS (2, 2'-azino-di(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate) um exemplo 
de corante que se torna verde-azulado na presença de peroxidase. 
NH
NH
O
O
NH2
O-
N2
H2O2
Peroxidase

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