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Espectrofotometria de Absorção Molecular

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DA PARAÍBA 
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE –CCBS
CURSO DE FARMÁCIA
ESPECTOFOTOMETRIA DE ABSORÇÃO MOLECULAR 
Campina Grande –PB
2018 
1 INTRODUÇÃO 
Em química, a espectrofotometria é a medida quantitativa das propriedades de reflexão ou transmissão de um material em função do comprimento de onda. Sabia-se desde a Antiguidade que a luz solar pode ser decomposta nas cores do arco-íris, mas foi Newton, no século XVII, que pela primeira vez descreveu de forma adequada o fenômeno da decomposição da luz por um prisma, assim como de sua recomposição por um segundo prisma. O conjunto das cores obtidas com o prisma é conhecido como espectro, e varia do vermelho, numa extremidade, ao violeta, na outra. Além das chamadas sete cores do arco-íris, o espectro solar também apresenta radiações invisíveis ao olho humano.
Sabe-se que o cloreto de prata é um sólido branco que escurece por ação da luz. Este é o princípio da fotografia em preto e branco. A reação que ocorre é a redução dos íons de prata, promovida pela luz e pelo processo de revelação, originando o metal finamente dividido, que é preto. Em 1777 o químico sueco Carl Wilhelm Scheele resolveu pôr amostras de cloreto de prata em cada uma das diferentes regiões coloridas do espectro solar obtido com um prisma. Percebeu, então, que o escurecimento do material se processava mais intensamente quanto mais próximo da extremidade violeta. Isto devia significar que a luz violeta era a mais energética do espectro, pois era a que mais acelerava a reação. Em 1801, o alemão Johann Wilhelm Ritter decidiu pôr uma amostra de sal de prata na região escura além do violeta. Qual não foi sua surpresa ao verificar que a reação de redução da prata se dava com mais facilidade ainda.
O astrônomo inglês William Herschel, em 1800, experimentou colocar o bulbo de um termômetro em cada uma das regiões coloridas do espectro solar. O resultado observado foi que a temperatura do mercúrio aumentava pela incidência da luz, mas esse era mais rápido quanto mais próximo da extremidade vermelha. Ao testar a região não iluminada depois do vermelho, Herschel descobriu que a temperatura subia ainda mais rapidamente. A radiação invisível que provocava este efeito foi então denominada de infravermelho. Estava assim demonstrado que a luz.
O jovem construtor de instrumentos ópticos alemão Joseph Fraunhofer, usando inicialmente prismas e depois grades de difração, constatou que o espectro solar na realidade contém milhares de linhas negras sobre as cores. O químico Robert Wilhelm Bunsen, inventor do queimador de gás comum de laboratório, associou-se em 1859 ao físico Gustav Robert Kirchhoff na criação do espectroscópio.
 Imagem 1- O espectroscópio de Bunsen e Kirchhof. 
	A espectroscopia possibilitou a descoberta, em poucos anos, de inúmeros elementos químicos, em especial muitos dos que correspondiam às lacunas presentes na tabela periódica que seria publicada por Dmitri Mendeleiev em 1869. Também os lantanídeos, de separação extremamente difícil, foram prontamente identificados pela espectroscopia. Em 1868 identificou-se também pelo astrônomo francês Pierre Janssen os espectros de emissão de vários elementos, sendo o hidrogênio o principal. O hélio também foi identificado com o auxílio de um espectrofotômetro, sendo primeiramente identificado no sol, pelo astrônomo inglês Joseph Norman Lockyer que o deu esse nome em homenagem ao deus grego do sol, na Terra o hélio foi descoberto pelo químico escocês William Ramsay em 1895.
	Atualmente uso de espectrofotômetros abrange vários campos científicos, como física, ciência dos materiais, química, bioquímica e biologia molecular. Eles são amplamente utilizados em muitas indústrias, incluindo semicondutores, fabricação de laser e óptica, impressão e exame forense, bem como em laboratórios para o estudo de substâncias químicas. A espectrofotometria é frequentemente usada em medições de atividades enzimáticas, determinações de concentrações proteicas, determinações de constantes cinéticas enzimáticas e medidas de reações de ligação de ligantes. Em última análise, um espectrofotômetro é capaz de determinar, dependendo do controle ou calibração, quais substâncias estão presentes em um alvo e exatamente quanto através de cálculos de comprimentos de onda observados.
2 INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS ESPECTROMÉTRICOS 
A espectroscopia é o termo utilizado para referir-se a ciência que estuda a interação dos diferentes tipos de radiação com a matéria. A espectrofotometria é uma das técnicas analíticas mais utilizadas para determinações quantitativas de espécies químicas. A técnica baseia-se na absorção de radiações de determinados comprimentos de onda por moléculas e íons. Quando um feixe de luz monocromática passa através de uma cubeta de vidro contendo um líquido, a radiação emergente será menos intensa, pois parte dela será absorvida. Quando a luz atravessa uma substância, parte da energia é absorvida (absorbância): a energia radiante não pode produzir nenhum efeito sem ser absorvida. A cor das substâncias se deve a absorção (transmitância) de certos comprimentos de ondas da luz branca que incide sobre elas, deixando transmitir aos nossos olhos apenas aqueles comprimentos de ondas não absorvidos.
O tratamento quantitativo da absorção de energia radiante pela matéria depende da lei de Beer, a qual mostra que adições sucessivas de moléculas de igual poder de absorção situadas no percurso de um feixe de radiação monocromática absorvem iguais frações de energia radiante que os atravessa. 
3 PROPRIEDADES GERAIS DA ONDA 
A luz é uma onda eletromagnética, isto é, possui dois componentes, um componente elétrico e outro magnético, posicionados a um ângulo de 90º um em relação ao outro. Todo movimento oscilatório possui um comprimento de onda, que é a distância entre dois máximos de onda. Podendo então ser considerada como uma forma de energia radiante que é propagada como ondas transversas.
Imagem 2- Propagação da radiação eletromagnética
 
E = campo elétrico; H = campo magnético; λ = comprimento de onda.
Muitos experimentos realizados em laboratório são melhor interpretados partindo da ideia de que a radiação se propaga na forma de ondas. Estas ondas são caracterizadas com respeito a algumas propriedades, tais como frequência, comprimento de onda e número de onda. O comprimento de onda (λ) refere-se à distância entre dos pontos equivalentes de ondas subsequentes, por exemplo, duas cristas adjacentes.
O recíproco do comprimento de onda é denominado número de onda ν. Outra característica importante de uma onda eletromagnética é a sua frequência (ν), ou seja, o número de unidades completas de comprimentos de onda que passam por um ponto fixo por unidade de tempo. Isto decorre do fato de a onda se propagar a uma velocidade constante. Comprimento de onda, número de onda e frequência estão relacionadas com a velocidade da luz no vácuo ( c, cerca de 3xm ).
 
A teoria ondulatória da radiação eletromagnética explica muitos fenômenos óticos, tais como a reflexão, a refração e a difração. No entanto, em alguns casos é conveniente considerar que a radiação é constituída de partículas portadoras de energia chamadas fótons. Assim, torna-se útil pensar no feixe de luz como sendo constituído por um “conjunto de fótons”. Cada fóton possui uma energia (E) característica, que está relacionada à frequência da radiação, através de equações:
 
Dessa forma, a cada comprimento de onda está associado uma quantidade definida de energia. A intensidade de um feixe de radiação é proporcional ao número 3 de fótons e independe da energia de cada fóton.
3.1 ESPECTRO ELETROMAGNÉTICO 
Dá-se o nome de espectro eletromagnético ao conjunto de radiações eletromagnéticas divididas em função do comprimento de onda ou (energia), as quais recebem as denominações. A região relativamente estreita do espectro cujas radiações são perceptíveis pelo olho humano é chamada de região visível. Dependendo da região do espectroeletromagnético considerada, diferentes unidades são empregadas para caracterizar as radiações. Para as regiões do visível (Vis) e ultravioleta (UV), o comprimento de onda é geralmente expresso em nanômetros (nm). 
Imagem 3- Representação do espectro eletromagnético 
As radiações ultravioleta são mais energéticas que a luz( possuem menor comprimento de onda ); o que explica sua penetração mais profunda na pele que resulta em queimaduras quando se tem uma maior exposição à radiação solar. A banda de raios X é mais energética que a ultravioleta e mais penetrante; isso explica porque é utilizada em medicina para produzir imagens do interior do corpo humano. As radiações da banda infravermelha são geradas em grande quantidade pelo sol, devido à sua temperatura elevada; entretanto podem também ser produzidas por objetos aquecidos (como filamentos de lâmpadas).
3.2 ABSORÇÃO MOLECULAR 
Quando um feixe atravessa a camada de um sólido, líquido ou gás, radiações de certas frequências podem ser seletivamente absorvidas. Neste processo de absorção, a energia é transferida aos átomos, moléculas ou íons presentes na amostra. Como resultado, as espécies passam de um estado de baixa energia para estados mais energéticos (estado excitado). O estado de energia mais baixa é denominado estado fundamental. As consequências da absorção de radiação por espécies químicas dependem da quantidade de energia absorvida e, portanto, do comprimento de onda da radiação. Sendo a energia E inversamente proporcional ao comprimento de onda, radiações com menores λ provocam alterações mais significativas nas espécies absorventes. 
Enquanto os raios γ são suficientemente energéticos para promover alterações nos núcleos atômicos, radiações na região das micro-ondas, com comprimentos de onda muito maiores, alteram somente o estado rotacional das moléculas. Radiações eletromagnéticas das regiões UV-Vis apresentam comprimentos de onda com dimensões comparáveis às de vírus e bactérias (40 – 700 nm). Estes comprimentos de onda correspondem a energias suficientes para promover rotação, vibração e transições eletrônicas em espécies absorventes.
Somente radiações ultravioleta com λ < 250 nm são suficientemente energéticas para quebrar ligações químicas. Em espectrometria UV-Vis, somente radiações com λ > 200 nm encontram aplicações práticas, visto que radiação com comprimentos de onda menores pode ser absorvida pela água ou por outras espécies presentes no ar.
Moléculas e íons são caracterizados por um número muito grande de níveis energéticos que decorrem das variações em suas energias eletrônicas, vibracionais e rotacionais.
Imagem 4 – Diagrama de níveis de energia para uma molécula 
Os níveis referem-se a três níveis eletrônicos, cada um deles com três níveis vibracionais; os níveis rotacionais também estão associados ao nível vibracional. A absorção de radiação na região visível do espectro eletromagnético é responsável pela coloração das soluções.
4 LEI DE BEER
A lei de Beer-Lambert, também conhecida como lei de Beer ou lei de Beer-Lambert Bouguer é uma relação empírica que, na Óptica, relaciona a absorção de luz com as propriedades do material atravessado por esta.
Quando um feixe de radiação de comprimento de onda definido (i.e. de energia apropriada) e de intensidade Io incide sobre uma amostra , uma parte desta energia é absorvida (), uma parte é transmitida () e outra é refletida ou espalhada (), de forma que:
Imagem 5- Cubeta com solução absorvente.
O e correspondem às intensidades de radiação incidente e emergente ( transmitida) , b é a largura interna da cubeta (caminho óptico) e o fluido contem teor C da espécie absorvente. A Lei de Beer pode ser aplicada com sucesso somente para descrever o comportamento da absorção de soluções diluídas. Em altas concentrações, a absortividade sofre pequena alteração em função de interações intermoleculares. Em soluções muito concentradas, desvios determinados pela variação da absortividade com o índice de refração da solução também podem ocorrer. Na prática, recomendase a diluição da amostra para superar estes efeitos de forma que a absorbância seja inferior a 1,000 (10% de transmissão), visando minimizar erros associados às medidas instrumentais de . Outras limitações à aplicabilidade da Lei de Beer são devidas a características instrumentais e às reações químicas envolvidas.
Desvios da Lei de Beer :
· A lei é válida somente para baixas concentrações; Em altas concentrações há interações entre as moléculas o que afeta a distribuição de carga, alterando o coeficiente de absortividade molar.
· Podem surgir desvios químicos quando um analito se dissocia, se associa ou reage com um solvente para dar um produto que tem espectro de absorção diferente. Exemplo:
4 ESPECTROFOTÔMETROS 
Os equipamentos para medidas espectrofotométricas são denominados espectrofotômetros. Como o próprio nome indica, espectrofotômetros de feixe único (também denominados de simples feixe) são instrumentos que operam com um único feixe de radiação, o qual vai da fonte ao detector, passando diretamente pelo sistema de seleção de comprimento de onda e pela amostra, ou vice-versa. Desta forma, espectrofotômetros de feixe único são equipamentos perfeitamente adequados para as análises quantitativas, quando um único comprimento de onda é utilizado, face à razão sinal/ruído mais favorável.
Os espectrofotômetros de duplo feixe têm seu feixe de radiação original dividido em dois, um dos quais passa pela referência (cubeta com o solvente) e o outro pela amostra.
4.1 FONTES DE RADIAÇÃO 
Necessita-se de uma fonte contínua cuja potência não varie bruscamente em uma faixa considerável de comprimento de onda.
· Lâmpadas de filamento de tungstênio: Estas lâmpadas consistem de um filamento de tungstênio, que se torna incandescente pela passagem de corrente elétrica (aquecimento resistivo). Útil na região de comprimentos de onda entre 350 e 2500nm.
· Lâmpadas de deutério e hidrogênio: Um espectro contínuo na região do ultravioleta é produzido por excitação elétrica de deutério ou hidrogênio em baixa pressão.
· Lâmpadas de arco de xenônio: Produz radiação intensa pela passagem de corrente em uma atmosfera de xenônio. O espectro é contínuo na faixa entre 200 e 1000nm.
4.2 MONOCROMADOR
Alguns espectrofotômetros ainda possuem um prisma como monocromador, porém os mais modernos possuem dispositivos eletrônicos que transformam a luz incidida em vários comprimentos de onda, em um só comprimento, ou seja, a luz monocromática.
4.1 RECIPIENTES DE AMOSTRA 
Recipientes de amostra ou cubeta é o recipiente propício para conter a amostra que será utilizada na análise, as cubetas podem ser de quartzo, vidro e acrílico, porém recomenda-se que seja usada uma cubeta de quartzo por que o vidro e o plástico absorvem UV e causa a reflexão da luz visível.
4.2 DETECTOR 
O detector é um dispositivo que detecta a fração de luz que passou pela amostra e transfere para o visor e para o computador acoplado ao aparelho.
5 TIPOS DE ESPECTROFOTOMETRIA 
 5.1 ESPECTROSCOPIA ASTRONÔMICA 
Os astrônomos utilizam redes de difração para estudar o espectro de energia da radiação eletromagnética dos astros coletada nos telescópios. A rede de difração é o artefato que substitui o antigo prisma óptico na pesquisa científica. Sua qualidade se mede pelo poder de separação de duas linhas de absorção ou de emissão do espectro eletromagnético de uma estrela, isto é, pela sua resolução espectral.
5.2 ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO ATÔMICA 
É o método de análise usado para determinar qualitativamente e quantitativamente a presença de metais. O método consiste em determinar a presença e quantidade de um determinado metal em uma solução qualquer, usando como princípio a absorção de radiação ultravioleta por parte dos elétrons que, ao sofrerem um salto quântico depois de devidamente excitados por uma chama de gás acetileno a 3000 graus celsius, esses devolvem a energia recebida para o meio, voltando assim para a sua camada orbital de origem. A energia devolvida na forma de umfóton de luz, por sua vez, absorve a radiação ultravioleta emitida pela fonte específica (cátodo ôco) do elemento químico em questão. Dessa forma, elétrons que estão contidos na solução, e que sofrem também um salto quântico e que não pertencem ao mesmo elemento que constitui o cátodo ôco que está sendo usado no momento, não serão capazes de causar uma interferência, isso porque eles absorverão apenas radiação com comprimento de onda referente ao elemento químico do qual fazem parte.
A espectroscopia de absorção é usada geralmente em análise química, assim como no ensaio de proteína de análise onde luz ultravioleta visível é testada contra uma solução aquosa para obter a concentração de proteína. Isto funciona porque todas as proteínas absorvem a luz em comprimentos de onda específicos e, através da utilização de fórmulas exclusivas, a quantidade de luz que é absorvida pode ser calculada através da detecção da quantidade de luz que é refletida a partir da solução, permitindo assim, que os cientistas determinem a quantidade de proteína. Na quantificação de proteínas, um espectrofotômetro de absorção produz luz e, em seguida, a reduz em um único comprimento de onda usando um componente chamado de monocromador. A luz monocromática está fixada a um comprimento de onda que não é absorvida pelo recipiente no qual a amostra é mantida porque isso afetaria negativamente a capacidade do espectrofotômetro de medir a refletância.
5.3 ESPECTROSCOPIA NO INFRA-VERMELHO 
Os compostos orgânicos também absorvem radiações na região do infravermelho (IV) do espectro . A radiação infravermelha não tem energia suficiente para excitar os elétrons e provocar transições eletrônicas, mas ela faz com que os átomos ou grupos de átomos vibrem com maior rapidez e com maior amplitude em torno das ligações covalentes que os unem. Estas vibrações são quantizadas e, quando ocorrem, os compostos absorvem energia IV em certas regiões do espectro. Nas vibrações, as ligações covalentes comportam-se como se fossem pequenas molas unindo os átomos. Quando os átomos vibram, só podem oscilar com certas frequências, e as ligações sofrem várias deformações. Quando a ligação absorve energia, ela sofre alterações e, ao retornar ao estado original, libera essa energia, que então é detectada pelo espectrômetro. 
As moléculas podem vibrar de muitos modos. Dois átomos unidos por uma ligação covalente podem efetuar vibrações de estiramento dessa ligação, como se fosse uma mola que estica e retorna ao tamanho original. Três átomos também podem efetuar diferentes vibrações de estiramento e alteração dos ângulos de ligação, em vários planos do espaço. No entanto, as vibrações de estiramento são as mais importantes.
6 CONCLUSÕES 
A espectrofotometria é usada para quantificar as propriedades reflexivas e transmissivas de um material, em termos de comprimentos de onda de luz a que ele está exposto. Uma vez que existem muitos tipos de luz, como a luz visível e infravermelha, existem vários tipos de espectrofotometria e cada uma corresponde a uma das regiões específicas do espectro de luz. 
Há também diferentes tipos de espectrofotômetros, cada um com capacidades específicas que servem para diferentes usos e tipos de análise. Entre os diferentes tipos de espectrofotometria, existem dois principais métodos utilizados; espectrofotometria de absorção, que está relacionada com a absorção de radiação e espectros específico de luz, e espectrofotometria com faixa ultravioleta visível, que está relacionada com a refletância do espectro específico de uma dado material. Cada um destes métodos de análise tem usos específicos e ferramentas correspondentes, que são específicos para este tipo de análise.
Atualmente espectrofotometria é uma técnica utilizada em muitas áreas, como engenharia; química, tendo em vista que a mesma viabilizou a descoberta de muitos dos elementos químicos presentes hoje na tabela periódica; fazendo-se presente também, desde o seu princípio, na astronomia, onde a mesma possibilitou descobertas importantes na área. 
É um método óptico muito utilizado em investigações biológicas e físico-químicas. Esta técnica tornou-se fundamental para a determinação de diagnósticos laboratoriais, pois inúmeras doenças puderam ser diagnosticadas pelo uso de técnicas principalmente colorimétricas específicas, possibilitando também compreender a fisiopatologia de enfermidades.
REFERÊNCIAS 
Espectroscopia . Disponível em : < http://www.astronoo.com/pt/artigos/espectroscopia.html >. Acesso em 29 de Novembro de 2018.
Espectrofotometria no Ultravioleta e Visível. Disponível em :< https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/4275863/mod_resource/content/1/Apostila-espectrofotometria.pdf > . Acesso em: 29 de Novembro de 2018 
Introdução aos métodos espectrométricos. Disponível em:< http://www.ufjf.br/nupis/files/2010/10/aula-5-UV-VIS.pdf> . Acesso em 29 de Novembro de 2018.
Espectrofotometria. Disponível em: < https://www.infoescola.com/quimica/espectrofotometria/ >. Acesso em 29 de Novembro de 2018.
Espectrofotometria de absorção: princípios gerais. Disponível em: < http://www.foa.unesp.br/include/arquivos/foa/dpto/files/espectrofotometria-de-absorcao.pdf >. Acesso em 29 de Novembro de 2018.
A Espectroscopia e a Química. Disponível em: < http://qnesc.sbq.org.br/online/qnesc03/historia.pdf >. Acesso em 30 de Novembro de 2018.
Espectrofotometria. Disponível em: < https://hisour.com/pt/spectrophotometry-27058/ >. Acesso em 30 de Novembro de 2018.
Espectrofotometria de absorção versus Espectrofotometria com faixa ultravioleta visível. Disponível em: < http://sensing.konicaminolta.com.br/2013/11/espectrofotometria-de-absorcao-versus-espectrofotometria-com-faixa-ultravioleta-visivel/ >. Acesso em 30 de Novembro de 2018

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