Adição de polímeros sintéticos durante a vitrificação de folículos ovarianos

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Adicão de polímeros sintéticos durante a vitrificacão de folículos ovarianos: 
Análises de sobrevivência e viabilidade
Aluno: Israel Levi Nascimento Silva
Universidade Estadual do Ceará – UECE
Faculdade de Veterinária – FAVET
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Criopreservação 
Biotécnica reprodutiva:
Preservação de gametas femininos
Recuperação da população folicular 
Folículos Pré-antrais
Folículos Antrais
(Bedaiwy; Falcone, 2004)
INTRODUÇÃO 
A criopreservação do tecido ovariano é uma biotécnica reprodutiva que permite preservar gametas femininos sendo capaz de contribuir para a recuperação da fertilidade humana e/ou animal (BEDAIWY; FALCONE, 2004). Além disso, este método permite a recuperação da população folicular mantida no ovário, classificados em folículos pré-antrais (primordiais, transição, primários e secundários) e antrais (terciários e pré-ovulatórios). 
(Norma: Colocar os acentos na classificação dos folículos; Acho que seria interessante você tentar separar quais são os pré-antrais e quais os antrais)
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Vitrificação 
Congelação lenta
Minimiza a formação de cristais de gelo
Rápido
Prático
Acessível
Desenvolvimento folicular 
Viabilidade e formação de antro
Oócitos em metáfase II
(Arav et al, 2010)
(Leal et al, 2017) 
(Lunardi et al., 2017) 
INTRODUÇÃO 
Resultados anteriores demonstraram que é possível promover o desenvolvimento folicular após a vitrificação do tecido ovariano seguido de cultivo de folículos pré-antrais isolados na espécie caprina (LEAL et al., 2017) e ovina (LUNARDI et al., 2017), além de manter as taxas de viabilidade e formação de antro (LEAL et al., 2017; LUNARDI et al., 2017), bem como atingir oócitos em estágio de metáfase II na espécie ovina (LUNARDI, et al., 2017). 
(Norma: Você em algum momento vai correlacionar a congelação lenta e o processo de vitrificação? Porque segundo sua fala, não tem algo estabelecido sobre isso... Tentar manter um padrão nas referências; AMEI a transição)
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Ainda não foi possível maturar oócitos provenientes do cultivo in vitro de folículos ovarianos caprinos vitrificados.
Avaliar a integridade e sobrevivência (azul de trypan e fluorescência) de folículos ovarianos secundários e antrais iniciais utilizando polímeros sintéticos (Supercool X-1000, Supercool Z-1000 e PVP-K12) na solução de vitrificação e posterior cultivo in vitro de 6 dias.
OBJETIVO
PROBLEMA
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No entanto, apesar desses resultados serem considerados promissores, ainda não foi possível maturar oócitos provenientes do cultivo in vitro de folículos ovarianos caprinos vitrificados, sendo necessários mais estudos para averiguar a qualidade dos folículos vitrificados após cultivo. 
Portanto, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a integridade e sobrevivência (azul de trypan e fluorescência) de folículos ovarianos secundários e antrais iniciais utilizando polímeros sintéticos (Supercool X-1000, Supercool Z-1000 e PVP-K12) na solução de vitrificação e posterior cultivo in vitro de 6 dias.
(Norma: Colocar problemática não ficaria mais formalizado? Talvez na sua introdução você deva mencionar alguma sobre os polímeros, porque assim, fora o título os polímeros caíram muito de para-quedas aqui)
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METODOLOGIA
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Álcool 70%
(2x) MEM-HEPES com antibióticos 
Período de 1 h
4°C
(N=80)
METODOLOGIA 
Para tanto, ovários (n = 80) foram coletados de cabras mestiças em abatedouro. Imediatamente, foram lavados em álcool 70% (1x) e em Meio Essencial Mínimo-MEM (2x) suplementado com HEPES e antibióticos, sendo posteriormente, os ovários transportados ao laboratório por um período de 1h à temperatura de 4°C.
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Ovário fragmentado
Folículos secundários (250µm) e antrais iniciais (350µm) isolados
Não vitrificados
Vitrificados
6 dias de cultivo
Parâmetros avaliados: Morfologia e viabilidade folicular (azul de trypan e fluorescência). 
METODOLOGIA 
No laboratório, os ovários foram fragmentados e os folículos secundários (250 µm) e antrais iniciais (350 µm) foram isolados manualmente com auxílio de agulhas de insulina (26G) e separados em dois grupos: não vitrificados e vitrificados. Posteriormente os folículos dos dois grupos foram cultivados por 6 dias. Durante e após o cultivo, foram avaliados os seguintes parâmetros: morfologia e viabilidade folicular (azul de trypan e fluorescência). 
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Soluções de Equilíbrio
MEM-HEPES 
Soro fetal bovino – 15% 
Ácido ascórbico– 1µl/ml
Glicerol – 5, 15, 30%
Etilenoglicol - 5, 15, 30%
Solução de Vitrificação
Solução de equilíbrio
 +
Polivinilpirrolidona – 20%
Supercool X-1000 – 20%
Supercool Z-1000 – 40%
Vitrificação
7 dias
Sacarose (1, 0,75, 0,50, 0,25, 0 M)
METODOLOGIA 
Em relação a vitrificação, os folículos secundários e antrais iniciais foram expostos a soluções de equilíbrio (SE), as quais incluíam MEM-HEPES adicionado de 15% de soro fetal bovino, 1 μl/mL de ácido ascórbico e concentrações crescentes dos crioprotetores glicerol e etilenoglicol (5, 15, 30%). Em seguida, foram expostos a solução de vitrificação, de mesma composição da SE adicionada de polímeros sintéticos (20% de Polivinilpirrolidona, 20% de Supercool X-1000 e 40% de Supercool Z-1000). Só então, os folículos foram submetidos a vitrificação em palhetas e posteriormente armazenadas em NL2 por 7 dias. Após esse período, os folículos foram submetidos ao aquecimento em quatro soluções contendo MEM-HEPES e doses decrescentes de sacarose (1 M, 0,75 M, 0,50 M, 0,25 M, 0 M). 
(Norma: essas letras da sacarose tu não acha que estão muito pequenas?)
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MEM-HEPES 
Albumina sérica bovina – 3mg/ml
Insulina recombinante humana – 10µl/ml
Transferrina – 5µl/ml
Selênio – 5ng/ml
Ácido ascórbico - 50µl/ml
Glutamina – 2mM
Hipoxantina – 2mM
MEM-HEPES 
Hormônio do crescimento (GH) – 50ng/ml
Insulina recombinante humana – 10ng/ml
Cultivo
38,5°C em 7,5% de CO2 
METODOLOGIA 
Quanto ao cultivo, os folículos pré-antrais foram cultivados em placas contendo 250 µL de α-MEM suplementado com as seguintes substâncias (3 mg/mL albumina sérica bovina (BSA), 10 μg/mL insulina recombinante humana (IRH), 5,5 µg/mL transferrina, 5 ng/mL selênio, 50 μg/mL ácido ascórbico, 2 mM glutamina e 2 mM hipoxantina). Já os folículos antrais iniciais foram cultivados em placas (100x 60mm) contendo gotas de 100 µL de meio com suplementação semelhante ao dos pré-antrais diferindo apenas na adição de 50 ng/mL hormônio do crescimento (GH) e 10 ng/mL de IRH. O cultivo foi realizado nas seguintes condições (38,5°C em 7,5% de CO2) por 6 dias. 
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Folículos Normais
Membrana basal íntegra
Células da granulosa brilhantes e homogêneas
Ooplasma homogêneo 
Folículos Degenerados
Membrana basal rompida
Escurecimento dos oócitos e células adjacentes
Diminuição do diâmetro folicular
Classificação folicular
METODOLOGIA 
Nos dias 0 e 6, os folículos foram classificados como normais quando possuíam membrana basal íntegra, células da granulosa brilhantes e homogêneas, bem como o ooplasma homogêneo. Já os folículos degenerados foram definidos quando apresentaram membrana basal rompida, escurecimento dos oócitos e das células adjacentes assim como a diminuição do diâmetro. 
(Norma: Como tem muita informação, não seria bom colocar uma transição aí? Primeiro os folículos normais e depois os degenerados? Não somente a transição das imagens)
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Análise de Viabilidade
VIÁVEL
DEGENERADOS
Calceína / Etídio
Azul de trypan
METODOLOGIA 
Quanto às análises de viabilidade, os folículos foram incubados com calceína e etidio homodímero para avaliação sob microscópio de fluorescência. Os folículos foram considerados viáveis quando o citoplasma do oócito e das células da granulosa foi marcado com calceína-AM (verde) e degenerados quando a cromatina foi marcada com etidio homodímero (vermelho). 
Para avaliação de viabilidade por azul de trypan, os folículos foram avaliados em estereomicroscópio e classificados como viáveis quando não corados ou não viáveis quando corados com azul de trypan. 
(Norma: Eu preferia aquela tuaimagem de calceína e etídio do artigo com a rutina. Por falar em rutina, quando vamos ver seu artigo?)
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Análise Estatística
Teste Qui-quadrado
Teste de Fisher
ANOVA
Teste t de Student
Porcentagem
Média
P < 0,05
METODOLOGIA 
As análises estatísticas para as variáveis apresentadas como porcentagem foram avaliadas pelo teste qui-quadrado e teste de Fisher. A comparação das médias foi avaliada por ANOVA , seguida pelo teste t de Student. Os valores são apresentados como porcentagem e considerados significativos em P <0,05.
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RESULTADOS
(Norma: Tu não acha melhor sem transição?)
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	 Tratamentos	Folículos cultivados (n)	Folículos intactos 
(%)
	FOPA não-vitrificado	90	91.1 ᴬᴮ
	FOPA vitrificados	97	84.5 ᴬᴮ
	FOA não-vitrificado	87	78.1 ᴮ
	FOA vitrificado	82	78.0 ᴮ
Tabela 1. Percentual de folículos intactos pré-antrais e antrais caprinos vitrificados e não vitrificados após cultivo in vitro. A, B Diferentes letras indicam diferenças significativas 
 (P < 0,05)
FOPA: Folículos Pré-antrais
FOA: Folículos Antrais
RESULTADOS 
Ao final do período de cultivo (dia 6) para ambas categorias (folículos secundários e antrais iniciais), foi observada uma redução significativa no percentual de folículos morfologicamente normais (tabela 1). No entanto, não houve diferença significativa entre o grupo de folículos não-vitrificados quando comparado com os folículos vitrificados. Ao comparar as categorias foliculares, o grupo de folículos antrais iniciais (vitrificados e não vitrificados) apresentou um menor percentual de folículos morfologicamente normais quando comparado ao grupo de folículos secundários não vitrificados (P<0,05). 
(Norma: melhor deixar justificado a legenda das tabelas, você não acha?)
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Tratamentos	Folículos avaliados por calceína (n)	Folículos viáveis por calceína 
(%)	Folículos avaliados por trypan (n)	Folículos viáveis por trypan (%)
	FOPA não-vitrificado	45	82.2 ᴬ	45	100.0 ᴬ
	FOPA vitrificados	47	82.9 ᴬ	50	86 ᴮ
	FOA não-vitrificado	41	63.4 ᴮ	46	93.5 ᴬᴮ
	FOA vitrificado	41	63.4 ᴮ	41	56.0 C
Tabela 1. Percentual de viabilidade de folículos pré-antrais e antrais caprinos vitrificados e não vitrificados após cultivo in vitro. A, B Diferentes letras indicam diferenças significativas 
 (P < 0,05)
FOPA: Folículos Pré-antrais
FOA: Folículos Antrais
RESULTADOS 
Quanto à viabilidade por fluorescência para as duas categorias foliculares, não foi observada diferença significativa entre os grupos (folículos não vitrificados vs folículos vitrificados) quanto ao percentual de folículos viáveis (P>0,05, tabela 1). Por outro lado, quando comparadas às duas categorias foliculares, o grupo de folículos antrais iniciais (não vitrificados e vitrificados) apresentou um maior percentual de folículos degenerados (36,5%) (P < 0,05). No tocante à avaliação de viabilidade por azul de trypan nas duas categorias foliculares, os folículos vitrificados apresentaram uma redução no percentual de folículos viáveis quando comparados aos folículos não-vitrificados (tabela 1). Além disso, o grupo de folículos antrais iniciais vitrificados apresentaram uma maior taxa de degeneração quando comparado com os demais grupos das duas categorias (P < 0,05). 
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	 Tratamentos	Folículos cultivados (n)	Folículos intactos 
(%)	Folículos avaliados por calceína (n)	Folículos viáveis por calceína 
(%)	Folículos avaliados por trypan (n)	Folículos viáveis por trypan (%)
	FOPA não-vitrificado	90	91.1 ᴬᴮ	45	82.2 ᴬ	45	100.0 ᴬ
	FOPA vitrificados	97	84.5 ᴬᴮ	47	82.9 ᴬ	50	86 ᴮ
	FOA não-vitrificado	87	78.1 ᴮ	41	63.4 ᴮ	46	93.5 ᴬᴮ
	FOA vitrificado	82	78.0 ᴮ	41	63.4 ᴮ	41	56.0 C
(CARVALHO et al., 2011; LEAL et al., 2017)
(SHAW et al., 1996; KAGAWA et al., 2009) 
Tabela 1. Percentual de folículos intactos e viabilidade de folículos pré-antrais e antrais caprinos vitrificados e não vitrificados após cultivo in vitro. A, B Diferentes letras indicam diferenças significativas 
 (P < 0,05)
DISCUSSÃO 
Os resultados do presente estudo divergem dos resultados anteriores da nossa equipe (CARVALHO et al., 2011; LEAL et al., 2017), os quais demonstraram que a vitrificação causa danos foliculares. O uso de polímeros sintéticos como o Supercool X-1000 na solução de vitrificação pode explicar o resultado obtido, uma vez que essa macromolécula é altamente eficaz inibindo o crescimento de cristais de gelo (ZACHARIASSEN et al., 2000), favorecendo a sobrevivência de folículos ovarianos vitrificados após cultivo in vitro.
Estudos prévios demonstraram que folículos pré-antrais são mais resistentes aos danos provenientes do procedimento de criopreservação (SHAW et al., 1996; KAGAWA et al., 2009), tornando essa categoria uma alternativa promissora para a preservação da fertilidade feminina. Além disso, o presente estudo mostrou a importância de uma determinação mais precisa da qualidade folicular através de análises de viabilidade, uma vez que o percentual de folículos viáveis no grupo de folículos vitrificados (secundários e antrais iniciais) foi inferior ao grupo de folículos não vitrificados, como demonstrado pela análise por azul de trypan. O teste com este corante vital é, portanto, um método rápido, prático e confiável para a avaliação de viabilidade folicular.
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Folículos secundários e antrais iniciais isolados e vitrificados podem manter sua morfologia e sobreviver após um período de cultivo de 6 dias, apresentando boas taxas de viabilidade.
CONCLUSÃO
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Em conclusão, folículos secundários e antrais iniciais isolados e vitrificados podem manter sua morfologia e sobreviver após um período de cultivo de 6 dias, apresentando boas taxas de viabilidade.
(Norma: Por meio dessa conclusão, o que seu trabalho é capaz de melhorar no futuro? Qual a inovação dele? Será que essas análises são suficientes para determinar a viabilidade dos folículos pré-antrais e antrais? Porque foram cultivados apenas por 6 dias? Você sugeriria algo diferente? Você entende a diferença do trypan para a calceína e o etídio?)
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OBRIGADO
 
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