Imunologia básica

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REAÇÕES ANTÍGENO - ANTICORPO IN VITRO
• Essas reações, no laboratório, caracterizam os testes sorológicos (baseados na
pesquisa de anticorpos).
• São utilizados, geralmente, quando o microrganismo que causa uma infecção tem
algum problema para ser cultivado.
Exemplo: sífilis, hepatites, doenças causadas por vírus, etc.
• É também utilizado para determinação de doenças auto-imunes, determinação de
tipo sanguíneo e HLA.
A reação antígeno-anticorpo IN VITRO se processa em 2 estágios:
1. Há a combinação específica entre um determinante antigênico e o anticorpo
correspondente;
2. Ocorre o fenômeno visível como precipitação ou aglutinação que se caracteriza pela
formação de grumos.
Neste teste, os antígenos se encontram em solução.
O anticorpo liga-se às moléculas de antígeno em proporções variadas, mas a formação de um
agregado ou malha (ponto de precipitação ou insolubilização) só ocorre quando as
concentrações dos reagentes (antígenos e anticorpos envolvidos) forem equivalentes.
• TIPOS DE PRECIPITAÇÃO:
Reação de Precipitação em Meio Líquido
É obtida da seguinte maneira: em uma série de tubos, adiciona-se quantidade fixa de
anticorpo e quantidade crescente de antígeno, de onde resultam 3 zonas:
1. Zona de excesso de anticorpo ou pró-zona*:
- Todo o antígeno é precipitado e haverá anticorpo
livre no sobrenadante.
2. Zona de equivalência:
- Há formação de complexos insolúveis (Ag-Ac).
Malha de Precipitação.
3. Zona de excesso de antígeno
* O fenômeno PRÓ-ZONA pode ocorrer no teste laboratorial para diagnosticar sífilis (VDRL)
quando o paciente apresenta títulos de anticorpos muito elevados. A diluição do soro produz
um resultado positivo.
PRECIPITAÇÃO
• Difusão simples ou Imunodifusão radial de Mancini ou radial simples
É usado para medir IgG, IgM, componentes do complemento e outras substâncias
presentes no soro.
Metodologia:
- Incorpora-se no gel o anticorpo específico para determinado antígeno;
- Enche-se os orifícios do gel com 3 antígenos em concentrações padronizadas e outros
com o antígeno em concentração desconhecida;
- Há difusão radial a partir do orifício e, quando o antígeno estiver difundido,
verifica-se a opacificação em forma de circular em torno do orifício;
- Após o término da difusão, faz-se a leitura dos halos correspondentes aos de
precipitação dos padrões e dos desconhecidos e traça-se a reta:
- Lança-se em ordenadas as concentrações (mg ou UI) dos padrões contra os
quadrados dos diâmetros dos respectivos halos.
- Lê-se a concentração dos desconhecidos, a partir do quadrado do diâmetro sobre a
reta, a qual deve ser estabelecida para cada experimento.
Dupla difusão ou Imunodifusão radial dupla (Outcherlony)
Na dupla difusão, antígeno e anticorpo são colocados em diferentes poços no Agar e
difundem-se um contra o outro. Onde as proporções são ideais, formam-se linhas de
precipitação;
A curvatura estará dirigida sempre para o orifício em que se encontra a substância de maior
peso molecular;
Esse método indica se os antígenos são idênticos, relacionados, mas não idênticos, ou não
relacionados;
Formam-se linhas de precipitação:
- de identidade
- de não identidade
- de identidade parcial
• Imunoeletroforese
Uma amostra de soro é colocada em um poço em agar ou lâmina de vidro;
Uma corrente é passada pelo Agar e as proteínas movem-se no campo elétrico de acordo
com sua carga e tamanho;
Uma canaleta é cortada no Agar e preenchida com anticorpo;
Como o antígeno e o anticorpo difundem-se um em direção ao outro, formam uma série de
arcos de precipitados;
Indica ausência, presença ou padrões incomuns de proteínas do soro. Ex: proteína do
mieloma humano.
AGLUTINAÇÃO
Definição
• Ocorre entre antígeno particulado ou entre uma partícula inerte e recoberta de
antígeno solúvel e seu anticorpo específico
• A partícula inerte pode ser: látex ou hemácia
Classificação
• Aglutinação direta
• Detectam anticorpos contra antígenos celulares relativamente grandes como os da
superfície das bactérias e dos fungos.
Exemplos de exames:
Classificar sorotipos de Salmonellas: após o crescimento em agar e a devida identificação
das Salmonellas, pega-se um pouco da colônia crescida e, em uma lâmina, adiciona-se os
anti-soros correspondentes a cada sorotipo. O antisoro que aglutinar a colônia corresponde
ao sorotipo da bactéria.
Aglutinação Indireta
Usa-se partículas de látex ou hemácias.
Exemplos de aglutinação indireta usando látex: Inibição da aglutinação passiva: prova para o
diagnóstico imunológico da gravidez
Exemplo de aglutinação indireta usando hemácias: Coombs direto e indireto
O soro de Coombs é um anti-anticorpo
• Coombs direto
É um teste laboratorial praticado com hemácias já sensibilizadas IN VIVO, ou seja, hemácias
fetais que se quer saber se fixaram anticorpo materno;
Coloca-se as hemácias do bêbê em um tubo devidamente lavadas e adiciona-se o soro de
Coombs, que é um anti-anticorpo.
• Coombs indireto
O objetivo é a pesquisa de anticorpos no soro de mães sensibilizadas ou de pessoas Rh
negativas que receberam transfusão de sangue Rho (D).
Outros exemplos de reação de aglutinação:
Na classificação sanguínea, pacientes que apresentam antígeno D (Rh) em pequena
quantidade na superfície das hemácias são chamados D fraco;
Os anticorpos IgG terão dificuldade em aglutinar esses antígenos D e promover uma reação
com grumos visíveis;
A adição de um soro contendo anti-IgG (soro de Coombs) permite a aglutinação das
hemácias
REAÇÃO DE FIXAÇÃO DE COMPLEMENTO
Pode ser usado para detectar quantidades muito pequenas de anticorpo;
Anticorpos que não produzem uma reação visível na precipitação ou aglutinação podem
ser evidenciados por fixarem o complemento durante a reação antígeno-anticorpo;
A fixação do complemento foi usada antigamente para o diagnóstico da sífilis (teste de
Wasserman) e ainda é utilizada para diagnosticar determinadas doenças virais, fúngicas e
causadas por Riquétsias;
Quando se forma um complexo Ag-Ac, há possibilidade que haja fixação de
complemento;
Somente os anticorpos IgM, IgG 1, 2, 3 são bons fixadores de complemento;
O sistema indicador de fixação do complemento é hemácia de carneiro conjugadas nas
proporções ideais ao seu anticorpo específico preparado em coelhos (hemolisina);
Se o soro não contém anticorpo para o antígeno em estudo ou se há anticorpo, mas o
antígeno correspondente está ausente, não há fixação de complemento e ao misturar-se
o sistema indicador (EA), o complemento determina a hemólise;
Quando, para o antígeno em questão, o soro contém Anticorpo, o Complemento é fixado
e, ao se adicionar o sistema indicador, não ocorrerá hemólise.
IMUNOFLURESCÊNCIA
A técnica de imunofluorescência combina corantes fluorescentes, como o isotiocianato
de fluoresceína, com anticorpos para que fluoresçam quando expostos à luz ultravioleta;
São de 2 tipos:
Imunofluorescência direta
Imunofluorescência indireta
IMUNOFLURESCÊNCIA DIRETA
São usados geralmente para identificar um microrganismo em uma amostra clínica;
Durante o procedimento, a amostra contendo o antígeno a ser identificado é fixada sobre
uma lâmina;
São, então, adicionados anticorpos marcados com fluoresceína e a lâmina é incubada por um
período curto sendo, a seguir, lavada para remover os anticorpos não ligados ao antígeno e,
então, examinada ao microscópio de fluorescência para detecção de fluorescência
amarelo-esverdeada.
IMUNOFLURESCÊNCIA INDIRETA
É usado para detectar a presença,no soro, de anticorpos específicos após a exposição a
um microrganismo;
O procedimento consiste na fixação de um antígeno conhecido a uma lâmina;
Adiciona-se então o soro a ser testado e, se algum anticorpo específico contra o
microrganismo estiver presente, esse vai reagir com o antígeno formando um complexo;
Para que o complexo seja visualizado adiciona-se à lâmina uma antiimunoglobulina séria
humana marcado com fluoresceína;
A antiimunoglobulina vai se ligar somente se o anticorpo específico estiver formando
complexocom o seu antígeno;
Depois da incubação a lâmina é lavada para remover o anticorpo não ligado e é
examinada ao microscópio de fluorescência;
Se o antígeno fixado à lâmina aparece fluorescente, significa que o anticorpo específico
está presente no soro;
No microscópio de imunofluorescência, filtros adequados para evitar a passagem, pela
ocular,de luz de baixo comprimento de onda,protegendo assim os olhos do observador.
ELISA
Anticorpos ou antígenos podem também ser ligados à enzima de maneira que, ao ser
adicionado à reação o substrato da enzima, é gerado um produto colorido que poderá ser
medico por espectrofotometria;
A reação é desenvolvida em placas de plástico contendo séries de pocinhos onde são
depositados os reagentes;
Antígenos ou anticorpos, dependendo do objetivo do método, são adsorvidos à placa
que, usualmente, é feita de poliestireno ou polivinil, materiais que possibilitam à maioria
dos antígenos, adsorção adequada;
METODO INDIRETO
Usado para a detecção e medida de anticorpos;
Nesse caso, o antígeno é adsorvido à placa;
Após lavagem, é adicionado o soro problema que supostamente contém anticorpos
específicos ao antígeno da reação;
Depois do período de incubação e lavagem adiciona-se o substrato;
O desenvolvimento de cor significa presença de anticorpos no soro problema;
A variação de cor significa presença de anticorpos no soro problema;
A variação de cor está relacionada à quantidade de anticorpo neste soro.
METODO SANDUICHE
Usado para detecção e medida de antígenos;
Nesse método, o anticorpo específico é adsorvido à placa;
Após lavagem, é adicionada a solução problema;
Depois da incubação e lavagem aplicam-se anticorpos específicos marcados com a enzima;
Após a incubação e lavagem, coloca-se o substrato;
A variação de cor é proporcional à quantidade do antígeno na solução problema.
METODO COMPETITIVO
Usado para a detecção e medida de antígenos;
O anticorpo específico é adsorvido à placa;
Após lavagem para remoção de proteínas não fixadas, é adicionada a solução problema que
supostamente contém o antígeno;
O antígeno marcado com a enzima pode ser colocado após breve período ou então ser
mistuado à solução problema;
Depois do período de incubação e lavagem, é adicionado o substrato;
Os poços contendo apenas o antígeno marcado (controle) desenvolvem cor;
A inibição do desenvolvimento de cor nos poços que contêm as amostras da solução
problema é proporcional à quantidade de antígenos nessas amostras.
WESTERN- BLOT
Método padrão confirmatório de positividade de HIV;
O DNA ou RNA de um agente etiológico é tratado com endonucleases para criar fragmentos
de tamanhos diferentes;
Os fragmentos do ácido nucléico são separados por eletroforese em gel e depois transferidos
para papel de nitrocelulose;
Este papel depois é colocado em contato com o soro do paciente suspeito de apresentar
anticorpos contra um determinado microrganismo