Relatório, coloração de Gram e análise morfológica de microrganismos.

Prévia do material em texto

ANÁLISE MORFOLÓGICA DE MICRORGANISMOS: APLICAÇÃO DA
TÉCNICA COLORAÇÃO DE GRAM E ANÁLISE MORFOLÓGICA DE
FORMAS INFECTANTES DE PROTOZOÁRIOS
1 INTRODUÇÃO
A Microbiologia é definida como a ciência que estuda os organismos
“demasiado pequenos” para serem observados a olho nu, ou seja, os microrganismos.
Entre estes microrganismos estão as bactérias, constituídas, normalmente, por uma
parede celular, que contém em sua composição polissacarídeos, proteínas e também
lipídios. Internamente à parede celular, encontra-se a membrana plasmática, que é
lipoprotéica e o citoplasma. O cromossomo encontra-se no citoplasma e possui forma
circular. É constituído por uma molécula de DNA que está ligado a uma membrana de
proteína (TORTORA; CASE; FUNK, 2016).
Quanto à morfologia, microbiologicamente o termo morfologia trata da forma
celular, onde os principais organismos se apresentam como: coco, bacilo, espirilo,
espiroqueta, bactérias com brotamento e apendiculares e bactérias filamentosas. As
bactérias com menor tamanho são as denominadas pleomorficas, medindo 0,2
micrometros, já os maiores destes organismos são os cocos em cadeias como exemplo a
Thiomargarita namibiense, que chega a medir 750 micrômetros (BROCK et al., 2016).
A estrutura responsável por conferir a morfologia das bactérias é a parede
celular, que fica ao redor da membrana plasmática e tem como principais funções
garantir a proteção celular e dar formato à célula bacteriana. Segundo a composição
majoritária da parede celular, teremos dois grupos: Gram-positivas e Gram-negativas,
onde as Gram-positivas possuem parede celular com uma única e espessa camada de
peptidoglicanos. Por outro lado, as Gram-negativas possuem parede celular mais
delgada e apresentam uma segunda membrana lipídica, diferente da membrana
plasmática (TRABULSI, ALTERTHUM, 2008).
A coloração de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista
dinamarquês Hans Christian Gram. Ela é um dos procedimentos de coloração mais
úteis, pois classifica as bactérias em dois grandes grupos: gram-positivas e
gram-negativas (BROCK et al., 2016).
Trata-se de um importante teste realizado nos laboratórios de microbiologia,
sendo um recurso auxiliar no diagnóstico de doenças bacterianas. A partir de um
determinado perfil tintorial as bactérias coram-se de roxo ou de rosa e
consequentemente são classificadas como Gram-positivas ou Gram-negativas,
respectivamente (TRABULSI; ALTERTHUM, 2008).
A coloração de Gram envolve uma série de procedimentos antes de chegar à
etapa final de leitura da lâmina preparada: envolve a confecção do esfregaço, sua
fixação e passa pela coloração propriamente. Nesta, o corante Cristal Violeta adsorve-se
nas células, forma um complexo com o iodo (Lugol) e após a etapa diferencial, com
álcool-acetona, as células são contra-coradas com Fucsina de Gram. Neste estudo
avaliou-se a influência de variações na referida coloração considerando os tempos de
exposição aos corantes Cristal Violeta e a Fucsina de Gram e o emprego ou não de
lavagens com água entre as etapas. Os resultados obtidos mostraram que as diferenças
nos procedimentos aplicados em cada técnica testada não alteraram o resultado quando
comparados a lâminas padrão (FREITAS; PICOLI, 2007).
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Analisar a morfologia de bactérias utilizando a coloração de Gram.
2.2 Objetivos específicos
● Preparar esfregaço contendo microrganismos;
● Submeter os esfregaços a coloração pela técnica de gram.
● Analisar o material obtido após coloração por microscopia óptica.
● Documentar e esquematizar o visualizado no microscópio.
3 MATERIAIS E MÈTODOS
3.1 Local do estudo
O presente estudo foi realizado nos laboratórios didáticos de Microbiologia e
Parasitologia, Centro de Ciências Biológicas da Universidade Estadual da Paraíba,
Campus I – Campina Grande.
3.2 Materiais
Para o presente estudo foram utilizados:
● Alças.
● Bico de Bunsen.
● Placas de Petri.
● Pipetas.
● Lâmina.
● Lamínula.
● Violeta Genciana.
● Lugol.
● Álcool.
● Fucsina Simples.
3.3 Métodos
a) Preparação do esfregaço microbiano
Inicialmente, procedeu-se a aplicação de solução fisiológica salina sobre lâminas
microscópicas para posterior deposição das amostras microbianas. Feito isso, foi
realizado a flambagem da alça e procedeu-se a coleta de pequenas amostras de
microrganismos cultivadas previamente em culturas microbiológicas em placas de Petri
contendo como meio de cultura Ágar.
A amostra coletada foi depositada na solução fisiológica salina estéril já presente na
lâmina e sequencialmente procedeu-se a realização de um esfregaço: foi posicionado o
lado da lâmina com o qual foi feito o esfregaço microbiano num ângulo de 45° com a
face superior da lâmina, em seguida com a lâmina preparada procedeu-se um rápido
movimento para trás até encostar-se à amostra, deixando então, que a solução
fisiológica salina se difundisse uniformemente, ao longo de toda borda por capilaridade.
Após difusão da solução, a lâmina preparada foi escorregada de uma só vez para frente
de modo que ela carregasse toda a amostra, que se estendeu numa camada delgada e
uniforme. Logo após, as lâminas foram incubadas a temperatura ambiente para
secagem.
b) Coloração de esfregaços microbianos
Após a secagem do esfregaço realizou-se a coloração de gram. Inicialmente, o
esfregaço foi coberto com o corante violeta de genciana por 1 minuto, que é o tempo
estimado para as células absorverem a solução e ficarem coradas de púrpura. Após
retirada do excesso do corante mencionado anteriormente, foi aplicado uma solução de
iodo (mordente) por 1 minuto, que é o tempo que as células ficam azul escuras depois
do contato com a solução. Passando-se o tempo de 1 minuto, procedeu-se a lavagem dos
esfregaços com agente descorante (álcool absoluto) por aproximadamente 15 segundos.
Após a etapa de lavagem, os esfregaços foram submetidos a uma nova etapa de
coloração utilizando fucsina, e após 1 minuto foram analisados em microscopia ótica e
através de lápis foram esquematizadas as observações em folhas de papel sulfite
tamanho A4.
c) Análise morfológica de cistos o ovos de protozoários
A análise morfológica de cistos e ovos de protozoários foram realizadas a partir de
lâminas preparadas previamente pertencentes ao acervo do Laboratório Didático de
Parasitologia sendo gentilmente disponibilizadas para o estudo.
Procedeu-se então a análise de lâminas já presentes nos microscópios do respectivo
laboratório, e através de lápis foram esquematizadas as observações em folhas de papel
sulfite tamanho A4.
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 Identificação de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas
Os cocobacilos se coloram em rosa pela fucsina por caráter estrutural de
membrana, estes apresentam também parede celular que se localiza abaixo de uma
membrana adicional, parecida com a membrana plasmática típica deste grupo de
bactérias, onde não ocorre absorção, mede entre 2-11μm, o mesmo ocorre com
leveduriformes que medem de 5 a 40μm. Os bacilos apresentam formato de bastão
medindo 2μm e os cocobacilos se apresentam como um bastão curto, com formato
parecido com cocos, enquanto as leveduras apresentam um formato mais assimétrico,
semelhante a uma exclamação, pois além de um bastonete também tem uma estrutura
próxima com formato arredondado.
Os observados cocos apresentavam coloração violeta, pois os mesmos possuem
uma parede externa formada por peptidioglicano que permite a absorção do composto
violeta, medem cerca de 2μm. Os cocos se agrupavam em quatro, se assemelhando à
quatro bolinhas paralelas e foram visualizados com aumento de 1000 vezes.
Os cistos de Entamoeba histolytica apresentam 4 núcleos em sua forma madura
estavam no microscópio com aumento de
400x, onde foram observados dois cistos com media de 12μm cada. Já os cistos de
Entamoeba coli também com aumento de 400 vezes apresentam de 6 à 8 núcleos,
visualizou-se apenas um cisto na lamina com média 17μm. Na observação docisto de
Giardia lambia com aumento também de 400x observou-se uma estrutura apenas com
14μm. Com um aumento de 100x visualizou-se ovos de áscaris lumbricoides com um
tamanho médio de 50μm, relativamente maior que os outros parasitos dispostos.
REFERÊNCIAS
MADIGAN, M.T.; MARTINKO, J.M.; DUNLAP, P.V.; CLARK, D.P. Microbiologia
de Brock. 12. ed., Porto Alegre: Artmed, 2010. 1160 p.
FREITAS, V. R.; PICOLI, S. U. A coloração de Gram e as variações na sua execução.
Newslab, v. 82, p. 124-128, 2007.
MADIGAN, Michael T. et al. Microbiologia de Brock-14ª Edição. Artmed Editora,
2016.
ALBINI, C. A.; SOUZA, HAPHM; STINGHEN, AEM. Coloração de Gram: como
fazer, interpretar e padronizar. Coloração de Gram: como fazer, interpretar e
padronizar, 2003.
TRABULSI, Luiz Rachid; ALTERTHUM, Flavio. Microbiologia. In: Microbiologia.
2008.
TORTORA, Gerard J.; CASE, Christine L.; FUNKE, Berdell R. Microbiologia-12ª
Edição. Artmed Editora, 2016.