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Fatores físicos: 1. Temperatura: faixa de crescimento. Psicrófitos: baixa temperatura Mesófilos: temperatura moderada Termofilos: alta temperatura 1. Ph: Bactérias: 6,5 e 7,5 Fungos: 5 e 6 2. Pressão osmótica: a perda de água causa plasmólise ou perca/diminuição da membrana plasmática da célula. O sódio retira a água da célula impedindo o crescimento. Fatores químicos C,H,O,P,N,S, elementos traços e fatores de crescimento são importantes para a formação de compostos orgânicos, proteínas, DNA,RNA,ATP,COFATORES etc. Oxigênio: a quantidade de O2é capaz de identificar diferentes tipos de bactérias. Meio de cultura Preparações químicas que possuem nutrientes, entre outras substâncias, que provém as condições necessárias para que os microrganismos multipliquem-se. Cada meio possui os nutrientes e condições indicados para cada tipo de microrganismo específico. Ou seja, eles não crescem em qualquer meio. No meio deve conter: Nutrientes [fonte de energia, C, N, S, P, fatores de crescimento, água, pH ajustado, quantidade certa de oxigênio (ou ausência)], ágar (dá consistência para o meio, sem valor nutricional), deve estar estéril e à temperatura adequada. É um meio quimicamente definido e complexo. Existem microrganimos fastidiosos, que são aquele que tem requerimento nutricional elevado, como o Lactobacillus. Meios e metodologia para crescimento de anaeróbios O cultivo de bactérias anaeróbias apresenta um problema especial, já que o oxigênio pode causar sua morte. • Assim, é necessário um meio redutor, que contém reagentes que se ligam ao oxigênio dissolvido e o eliminam do meio. • Para estas bactérias, são usadas jarras especiais que garantem seu crescimento em uma atmosfera livre de oxigênio. Técnicas especiais de cultivos: • Para a bactéria Mycobacterium leprae, cobaias são utilizadas. • Já algumas linhagens da Treponema pallidum crescem em laboratório. Meio seletivo Favorece o crescimento de bactérias de interesse e impede o de outras. Como por exemplo: Verde brilhante para a Salmonella Meio diferencial: • É de fácil identificação da colônia da bactéria de interesse quando tem outras junto. • Exemplo: Ágar sangue para o Streptococcus pyogenes. • Pode ser combinado com o meio seletivo, criando, por exemplo, o Manitol salgado para Staphylococcus aureus. De enriquecimento: • Isola bactérias que estão presentes em pequenas quantidades no meio de muitas outras (fezes e solo). Este meio é geralmente líquido. Obtenção de culturas puras: • Quando uma única bactéria dá origem a uma colônia em meio sólido. • Pus, escarro, fezes, urina, solo, água ou alimentos contém muitas bactérias e, por isso, é necessário isolar a de interesse. • A distribuição uniforme das bactérias é essencial para que se possa ter uma boa visualização delas. • O método mais comum a ser feito é a semeadura por esgotamento. Preservando culturas bacterianas: Congelamento : • Utilizam-se culturas puras, que com o uso de um líquido de suspensão, são congeladas rapidamente em temperaturas de –50ºC a – 95°C. Desse modo, elas podem ser mantidas durante anos. Liofilização: • Através de uma suspensão microbiana, esta é rapidamente congelada em temperaturas de –54ºC a –72 ºC. • Após isso, há uma imediata remoção da água por alto vácuo (sublimação), formando ampolas com pó que são seladas por uma chama de alta temperatura. Também podem ser mantidas por anos. Crescimento das culturas bacterianas: A divisão bacteriana é realizada através de duas formas: • Fissão binária: a maioria se divide desta forma, onde o DNA de uma célula sofre replicação, e esta forma um septo e paredes celulares separadas, onde se divide em duas células. • Brotamento: ocorre na minoria das bactérias, onde se forma uma pequena região que inicia um crescimento (broto), que, ao atingir o tamanho aproximado da célula parenteral, se separa. Exemplo: Streptomyces. O tempo de geração é o tempo necessário para uma célula se dividir e sua população dobrar de tamanho, no tempo de uma a três horas. Esse tempo varia e depende do microrganismo e das condições ambientais, como a temperatura. Geralmente se expressa em potência. As fases de crescimento se dividem em quatro: 1) LAG: não há crescimento ainda (crescimento linear), apenas o reconhecimento do meio de cultura, a duplicação do DNA e o metabolismo ativo. 2) LOG: ocorre multiplicação celular intensa, com crescimento exponencial, e o tempo de geração atinge um valor constante. 3) Estacionária: os nutrientes estão acabando e as bactérias vão consumindo o oxigênio e produzindo metabólitos que impedem o crescimento da cultura. O número de células novas é equivalente ao número de células que estão morrendo, gerando um equilíbrio. 4) Declínio: a quantidade de bactérias que morrem é maior que a de bactérias que se multiplicam. Não há crescimento de colônias pois os nutrientes acabaram, já que utilizaram para se multiplicarem, crescerem e se manterem vivas. Métodos diretos para quantificar o número de bactérias Existem diferentes métodos diretos para quantificar (em UFC/mL ou UFC/g) o crescimento de uma população microbiana. Sempre a amostra deverá ser diluída A diluição seriada e contagem em placa é a mais utilizada, onde se adiciona 1mL por vez. • Espalhamento em placa: adição de inóculo em placa contendo meio sólido. • Pour Plate: adição do inóculo em placa sem meio e só depois se adiciona ágar. • Filtração: onde há um filtro e apenas bactérias maiores ficam retidas. • Essa contagem é feita ou pelo Número mais provável (NMP) ou pela Contagem direta no microscópio. Métodos indiretos para quantificar o número de bactérias: • Turbidimetria: utiliza o espectofotômetro. • Atividade metabólica: a quantidade de um produto metabólico pode ser uma relação direta do número de células presentes. • Peso seco: é mais utilizada para contagem de fungos.
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