Biofísica - relatório de prática

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA 
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLOGICAS 
BIO 427 – BIOFÍSICA I 
CURSO DE ENFERMAGEM 
DOCENTE: José Hilberto de Oliveira 
DISCENTES: Alberto Bispo, Bruna Cardoso, Caroline Olveira, Eunice Araújo, Gésia Alves, 
Ivana Andrade, Joseane Santos, Maryana Ferreira, Paulo Weber, Stelman Moreira, Tauany 
Campos Thaís Mercês, Wanderson Santos 
 
 
 
 
 
 
Relatório de Prática 
 
 
 
 
 
Feira de Santana 
2020 
 
ALBERTO BISPO 
BRUNA CARDOSO 
CAROLINE OLIVEIRA 
EUNICE ARAÚJO 
GÉSIA ALVES 
IVANA ANDRADE 
JOSEANE SANTOS 
MARYANA FERREIRA 
PAULO WEBER 
STELMAN MOREIRA 
TAUANY CAMPOS 
THAIS MERCÊS 
WANDERSON SANTOS 
 
 
 
Relatório de Prática 
 
 
Trabalho solicitado pelo docente Jose Hilberto De Oliveira, 
da componente curricular Biofísica I do curso de graduação 
em Enfermagem, da Universidade Estadual de feira de 
Santana, como parte da avaliação desta disciplina. 
 
 
 
 
 
Feira de Santana 
2020 
 
1.Centrifugação 
1.1 Principio 
A centrifugação é o princípio na qual se utiliza a força centrifuga que é até 600.000 
vezes superior à força da gravidade para separar com mais rapidez componentes 
químicos que apresentam densidades diferentes. 
Quando uma amostra é colocada em uma centrífuga e a força é aplicada, 
elementos de maior densidade se movem em direção ao fundo do recipiente, enquanto 
os de menor densidade ficam próximos a superfície. 
O procedimento é muito utilizado para o fracionamento sanguíneo, onde a 
centrífuga é utilizada para separar plasma e soro livre das hemácias, sedimento de 
líquidos biológicos, dentre outros. Posteriormente, com ajuda de micropipetas, faz-se 
a separação do material desejado permitindo a análise. 
1.2 VHS 
O exame VHS é a Velocidade de Hemossedimentação, é um exame de sangue 
muito utilizado para detectar alguma inflamação ou infecção no organismo, podendo 
indicar desde um simples resfriado, infecções por bactérias, até doenças inflamatórias 
como uma artrite ou uma pancreatite aguda, por exemplo. 
Este exame mede a velocidade da separação entre os glóbulos vermelhos e o 
plasma, que é a parte líquida do sangue, pela ação da gravidade. Assim, quando há 
um processo inflamatório na corrente sanguínea, são formadas proteínas que 
diminuem a viscosidade do sangue e aceleram a velocidade de hemossedimentação, 
provocando como resultado um VHS alto. 
Para realizar o exame VHS, o laboratório irá coletar uma amostra de sangue, que 
é colocada em um recipiente fechado e, em seguida, será avaliado quanto tempo leva 
para os glóbulos vermelhos se separarem do plasma e se depositarem no fundo do 
recipiente. Assim, após 1 hora ou 2 horas, esta deposição será medida, em milímetro, 
por isso o resultado é dado em mm/h. 
Os valores normais do VHS são diferentes para homens e mulheres. Para homens 
o normal é que após uma hora seja de até 8 mm e a pós duas horas seja até 20 mm; 
paramulheres é considerado normal após uma hora que seja até 10 mm e após duas 
horas de até 25 mm 
Algumas doenças podem aumentar o VHS como: mieloma múltiplo, doenças 
autoimunes, Artrite Reumatoide, Tuberculose, câncer, anemia severa, inflamações e 
infecções em geral, insuficiência cardíaca, insuficiência renal. Outras podem atuar 
promovendo a diminuição do VHS como: policitemia, leucocitose severa, anemia 
hemolítica, esferocitose hereditária, uso de corticosteroides, hipofibrinogemia. 
 
 
1.3 OBJETIVO: 
Descrever como se dá o processo de centrifugação de amostras biológicas e uso 
da centrífuga, através do sangue periférico do organismo humano para o fracionamento 
sanguíneo. 
1.4 MATERIAIS: 
● Centrífuga 
● Tubos para balanceamento 
● Suporte para Amostras 
● Ferramenta para abertura manual 
● Amostras de sangue total periférico 
 
Cartão de leitura de hematócrito 
1.5 MÉTODOS: 
As amostras devem ser centrifugadas, no máximo 30 minutos após a coleta, em 
temperatura ambiente; 
Centrifugar os tubos tampados por 15 minutos, a 2.000 ou 3.000 rpm (centrífuga 
com 18cm de raio); 
Retirar todo o volume de plasma com auxílio de uma micropipeta; 
Nos tubos de gel separador-PPT, após retirar todo o plasma, com auxílio da 
ponteira utilizada para esse procedimento, retirar o gel separador, enfiando-se a 
ponteira no gel e girando-a até o gel soltar-se do tubo e ficar aderido à ponteira; 
Vortexar o tubo para homogeneizar bem as hemácias retirar todos o volume de 
hemácias com auxílio de pipeta Pasteur, transferindo 1000μL de hemácias para cada 
tubo de criopreservação, com etiquetas de código de barras correspondentes ao tubo 
primário. 
Estocar as alíquotas de hemácias em freezer -20ºC em caixas de armazenagem. 
1.6 RESULTADOS: 
Após o procedimento é possível fracionar o sangue, onde são obtidos os seus 
principais componentes, que são: concentrado de hemácias (parte do sangue que 
contém os glóbulos vermelhos), concentrado de plaquetas (parte sólida do sangue) e 
plasma (parte líquida do sangue). 
 
2. Microscopia 
2.1 Princípio: 
A microscopia consiste na ampliação de substâncias minúsculas que não podem 
ser observadas a olho nu, apresentando grande importância na observação dos 
sistemas biológicos. 
O microscópio é um instrumento que é composto por lentes de cristal que 
atravessadas pela imagem do objeto permite uma ampliação, os diferentes tipos, são 
projetados para esses diferentes usos e, portanto, variam com base em sua resolução, 
ampliação, profundidade de campo, campo de visão, método de iluminação, grau de 
automação e tipo de imagem que produzem. A forma mais comum é a lupa ou 
microscópio estereoscópico, seguida do microscópio óptico, que ilumina o objeto com 
luz visível ou ainda luz ultravioleta. A imagem microscópica é caracterizada por três 
parâmetros: aumento, resolução e contraste. 
O aumento se dá através das curvaturas das lentes e distâncias entre o sistema 
de objetivas e o sistema de oculares maior será o aumento total. 
A resolução de um microscópio ou lente é a menor distância na qual dois pontos 
podem estar separados e ainda ser distinguidos como objetos distintos. Quanto menor 
for este valor, maior o poder de resolução do microscópio e melhor a clareza e detalhe 
da imagem.O limite máximo de resolução dos microscópios ópticos é estabelecido 
pelos efeitos de difração devido ao comprimento de onda da radiação incidente. Mas, 
em geral, os microscópios ópticos convencionais ficam, então, limitados a um aumento 
máximo de 2000 vezes. 
O princípio da microscopia é ser suficiente colocar a objetiva de modo que o objeto 
fique colocado um pouco além do foco principal da lente, mas o mais próximo possível 
dele, para que a imagem formada seja real e a maior possível. Dispondo a ocular de 
maneira que a imagem real obtida pela objetiva fique situada entre o vértice e o foco 
da ocular, será obtida uma imagem virtual e aumentada. 
É importante que o objeto a ser visto esteja bem iluminado. Pode-se iluminar o 
material por cima ou por baixo. Quando o objeto é transparente, usa-se a luz vinda de 
baixo (luz transmitida). No caso de objetos opacos, é mais aconselhável usar uma luz 
vinda de cima (luz refletida). O sistema de lentes condensadoras e de diafragmas 
permite concentrar mais ou menos o feixe incidente para obter a melhor iluminação do 
material. O foco pode ser ajustado para diferentes níveis. Apenas a parte do objeto que 
está em um certo plano é vista nitidamente. 
Além disso, para observar as imagens com nitidez, é preciso estar ajustando o 
foco, que se torna cada vez mais necessária conforme o objeto for mais espesso. Para 
a melhor utilização do microscópio, diversas técnicas foram formalizadas e inovações 
foram feitas. Corantes, fixadores, micrótomo, esfregaço, esmagamento. 
 
2.2 Objetivos: 
 Observar efeitos de contrastes em sistemas a fresco e em sistemas fixados e 
corados. 
 Observar o poder de resolução nos diferentes sistemas:a fresco e corados. 
2.3 Técnicas: 
2..4 Materiais: 
● Microscópio óptico; 
● Lâminas; 
● Laminulas; 
● Sangue total; 
● Solução corante Wright; 
● Luvas; 
● Galeria de coloração; 
● Papel toalha; 
● Vasilhame para desprezar material. 
2.5 Métodos 
● A fresco: Colocar uma gota de sangue/urina na lâmina e fazer um esfregaço 
conforme observação. Deixar secar e observar ao microscópio com as diferentes 
objetivas, a partir de 10x. 
● Corado: Fazer outro esfregaço de sangue e corar com o corante Wright: 
Colocar o corante sobre o esfregaço e aguardar 5min. Adicionar água destilada e 
aguardar 3min. Lavar em água corrente, secar e observar ao microscópio em diferentes 
objetivas a partir de10x. 
2.6 Discussão: 
 O exame de urina de rotina é um teste simples, não invasivo e de reduzido 
custo, que permite identificar diferentes elementos com relevância diagnóstica. Neste 
exame, a análise do sedimento urinário é o mais solicitado pelo clínico, uma vez que 
as avaliações física e química podem gerar resultados falso-negativos, em vista disso, 
é necessário que as amostras sejam bem homogeneizadas antes da centrifugação 
para permitir uma melhor análise das células presentes por meio do microscópio. 
 Ao avaliar uma lâmina a fresco de sedimento urinário podemos observar 
células presentes, como, cellEp, bactérias, leucócitos, hemácias, cristais tanto de urato 
quanto de fosfato, dentre outras células que vai permitir diagnosticar possíveis doenças 
e infecções. 
Um leve aumento do número de eritrócitos e leucócitos é esperado e considerado 
normal quando a amostra é colhida através de micção natural ou por cateterização. 
Além disso, o sedimento também é afetado pela densidade urinária e fatores físicos e 
químicos que afetam a morfologia dos elementos do sedimento urinário. 
No que se refere a metodologia fixada/corada/morta, discutimos sobre a 
sedimentação sanguínea, onde é um teste realizado em hematologia para a contagem 
e a identificação de anormalidades nas células do sangue, e para permitir uma melhor 
análise as células mortas são coradas. 
Seu objetivo principal é analisar a morfologia das células, fornecer informações 
sobre a estimativa do número de leucócitos e plaquetas, investigar problemas 
hematológicos, distúrbios encontrados no sangue e eventualmente parasitas, e dessa 
forma fornecendo informações sobre o paciente e auxiliando para diagnóstico de 
causas patológicas. 
 
Sedimento urinário a fresco 
 
 
 
 
3.SEDIMENTAÇÃO SANGUÍNEA 
 3.1 Princípio: 
O esfregaço de sangue, também conhecido como sedimentação sanguínea, é um 
teste realizado em hematologia para a contagem e a identificação de anormalidades 
nas células do sangue. O teste consiste na extensão de uma fina camada de sangue 
sobre uma lâmina de microscopia que, após corada, é analisada em microscópio. 
O esfregaço sanguíneo geralmente é feito quando solicitado o hemograma ao 
paciente. Seu objetivo principal é analisar a morfologia das células, fornecer 
informações sobre a estimativa do número de leucócitos e plaquetas, investigar 
problemas hematológicos, distúrbios encontrados no sangue e eventualmente 
parasitas. Essas informações são importantes pois auxilia no diagnóstico de doenças 
relacionadas ao sangue, por exemplo as anemias, e outras condições médicas, tais 
como infecções. O primeiro passo para se obter resultados confiáveis é a confecção 
de um bom esfregaço de sangue e, para tanto, é necessário empregar as técnicas 
corretas. 
Técnica de esfregaço de sangue: 
 O método consiste em aplicar uma gota de sangue diretamente sobre uma lâmina 
de vidro e espalhar em uma camada fina pela sua superfície. Isso é obtido espalhando-
se a gota de sangue com a borda de uma lâmina histológica ao longo de outra lâmina, 
com o objetivo de produzir uma monocamada de células. 
 3.2 Método: 
 1. Apoiar a lâmina de microscopia, já com a identificação do paciente, sobre uma 
superfície limpa. Certificar-se de que a lâmina tem boa qualidade e não está suja ou 
possui vestígios de gordura, o que pode prejudicar o teste. 
 2. Colocar uma pequena gota de sangue próxima a uma das extremidades da 
lâmina. 
3. Com o auxílio de outra lâmina, colocar a gota de sangue em contato com sua 
borda. Para isso a lâmina extensora deve fazer um movimento para trás tocando a gota 
com o dorso em um ângulo 45°. 
Distensão sanguínea pelo método fixado, corado e morto. 
 4. O sangue da gota irá se espalhar pela borda da lâmina extensora por 
capilaridade. 
 5. A lâmina deve então deslizar suave e uniformemente sobre a outra, em direção 
oposta a extremidade em que está a gota de sangue. O sangue será “puxado” pela 
lâmina. 
6. Depois de completamente estendido, o sangue forma uma película sobre a 
lâmina de vidro. 
 7. Deve-se deixar que o esfregaço seque sem nenhuma interferência. 8. Seguir 
para o passo de coloração. 
 
3.3: Discussão 
 Na maioria das vezes é possível realizar um diagnóstico definitivo a partir de um 
esfregaço de sangue. Contudo, rotineiramente ele serve como uma base para que 
sejam realizados outros testes confirmatórios. O teste de esfregaço pode indicar uma 
série de deficiências, apontando alterações e anormalidades nessas células 
sanguíneas. Várias doenças podem ser identificadas como os diversos tipos de 
anemia, por exemplo. 
 
4. HISTOLOGIA VAGINAL 
4.1 Princípio 
A citopatologia é a ciência que estuda as doenças através das modificações 
celulares, considerando as suas características citoplasmáticas e nucleares. Essa 
ciência desenvolveu-se através da aquisição de inúmeros conhecimentos científicos e 
à introdução de novas tecnologias, desde a invenção do microscópio óptico 
convencional às técnicas de processamento e coloração dos espécimes, propiciando 
melhor detalhamento e estudo das estruturas celulares. 
Tipos de descamação celular 
A descamação celular pode ser de dois tipos: espontânea ou natural e artificial. 
Como exemplos de descamação natural, temos a urina e o escarro. Na descamação 
artificial, as células são removidas com a utilização de algum instrumento. É o que 
acontece no teste de Papanicolaou, em que as amostras citológicas são obtidas 
através do raspado da ectocérvice e do escovado da endocérvice, utilizando-se a 
espátula de Ayre e a “escovinha”, respectivamente. As células viáveis que são 
traumaticamente esfoliadas, são menores e com menor grau de maturação que as 
células descamadas naturalmente. 
 
4.2 Materiais 
 
a; b - Espátula e “escovinha”, respectivamente, utilizadas na colheita das amostras 
citológicas do colo uterino. 
 c - Lâminas de vidro onde as amostras são espalhadas (esfregaços). 
d - Recipiente de plástico contendo etanol a 95% para a fixação. Posteriormente o 
esfregaço é corado e encaminhado para o exame microscópico. 
 
4.3 Objetivos e limitações do exame citpatológico 
Os objetivos do exame citopatológico incluem: 
• Identificação de doenças não suspeitadas clinicamente. 
• Confirmação de doenças clinicamente suspeitas. 
• Acompanhamento da evolução ou resposta ao tratamento de determinada 
doença. 
Por se tratar de um procedimento diagnóstico não invasivo sem complicações para 
a paciente, além do seu baixo custo e eficácia diagnóstica, a citopatologia é 
considerada o método de eleição no rastreamento do câncer cervical. Contudo, 
limitações são comuns a todos os métodos diagnósticos. Com relação à citopatologia, 
os seus aspectos negativos compreendem o tempo excessivamente longo na 
interpretação das amostras, a natureza algo subjetiva da interpretação e a 
impossibilidade de assegurar a invasão ou extensão da invasão no caso de lesão 
maligna. Deve ser realçado que a avaliação histopatológica é essencial no diagnóstico 
definitivo das lesões pré-cancerosas e malignas do colo uterino, detectadas pelo 
exame citológico. 
Exames de citologia podem ser utilizados de duas formas: para o diagnóstico e 
parao rastreamento. 
Um exame diagnóstico só é utilizado em pacientes que apresentam sinais, 
sintomas ou alguma outra razão para suspeitar que uma determinada doença (como o 
câncer) possa estar presente. Um exame de diagnóstico classifica a doença (se 
presente) de forma precisa. 
Um exame de rastreamento é utilizado para encontrar pessoas que possam ter 
uma determinada doença, mesmo antes de desenvolver quaisquer sintomas. Espera-
se que um exame de rastreamento possa encontrar quase todas as pessoas que tem 
predisposição a alguma doença, mas nem sempre serve para provar que a doença 
está presente. Alguns exames de citologia, como o exame de Papanicolaou são usados 
principalmente para a seleção de pacientes em risco, enquanto outros podem 
identificar com precisão os cânceres. Quando a citologia mostra câncer, uma biópsia é 
também realizada para se ter certeza de qualquer achado anormal antes do tratamento 
ser iniciado. 
 
5.REFRATOMETRIA 
5.1 Princípio 
Refratometria é um método analítico para medir o índice de refração de um 
material sólido ou líquido. Esse índice é a razão entre a velocidade de uma onda 
eletromagnética no vácuo em relação à sua velocidade no material de interesse, logo, 
é uma propriedade física importante de substâncias sólidas, líquidas e gases. A medida 
de índice de refração pode ser usada para determinar a concentração de uma solução, 
pois varia com a concentração. 
Em geral, quando a densidade de um meio aumenta, o seu índice de refração 
também aumenta. Como variações de temperatura e pressão alteram a densidade, 
conclui-se que essas alterações também alteram o índice de refração. No caso dos 
sólidos, essa alteração é pequena, mas para os líquidos, as variações de temperatura 
são importantes, e no caso dos gases tanto as variações de temperatura como as de 
pressão devem ser consideradas. 
 
5.2 Objetivo 
Pode ser utilizado para determinar a identidade de um material desconhecido a 
partir da medida de seu índice de refração, para determinar a concentração de uma 
substância dissolvida em outra ou ainda determinar a pureza de uma determinada 
substância. 
O uso mais comum é na determinação da concentração de açúcar, também 
conhecido por índice de Brix em frutas. Na área de saúde, o refratômetro pode ser 
usado para medir a concentração de proteínas ou a salinidade no sangue. 
 
 
5.3 Materiais utilizados: 
 
● Refratômetro de ABBÉ; 
 
● Lenços de papel. 
 
 Reagentes e soluções utilizadas: 
 
● Água destilada; 
 
● Amostra : Soro fisiológico 
 
● Amostra 2: Soro glicosado 
4.4 Métodos 
Inicialmente, abriu-se o conjunto de prismas e efetuou -sde a li mpeza as 
superfícies de vidro com água e lenços de papel, evitando-se tocar as superfícies com 
outros objetos. 
Das soluções utilizadas (água destilada, soro fisiologico e glicosado) foram pegues, 
separademente, algumas gotas com a pipeta de paster, transferindo assim essas gotas 
para o prisma inferior e fechando-se os prismas, em seguida, foi travado o aparelho e 
efetuada a leitura que saiu automaticamente no aparelho 
Focalizou-se o espelho de maneira que a janela mais próxima do conjunto fosse 
bem iluminada. Adaptou-se o telescópio até que as linhas cruzadas estivessem em 
foco. Giraram -se os prismas com o botão giratório até a fronteira luz-escuro coincidir 
com a interseção das linhas cruzadas. Melhorou-se a imagem da fronteira luz -escuro 
e eliminaram-se as cores girando o compensador. FInalizando com leitura do índice 
de refração diretamente na escala. 
 
5.5 Resultados 
 
Com base nos reslutados, a água destilada não apresentou porcentagem Brix, isso 
ocorreu pelo fato de essa substância não apresentar sólidos dissolvidos , por ser pura, 
diferente das outras amostras analisadas (soro glicosado e fisiológico) que vão 
apresentar glicose ou sacarose em sua composição, consequentemente alterando sua 
porcentagem. 
A partir dos experimentos realizados em laboratorio foi possivel perceber que a 
refratometria é uma tecnica de simples utilizaçao sem necessitar de grandes recursos. 
É bastante empregada para descobrir propriedades de substâncias e sua concentração, 
quanto mais concentrada se encontra uma solução, maior é o índice de refração do 
mesmo. 
 
5.6 Anexos 
 
 
 
 
6. ESPECTROFOTOMETRIA 
6.1 Princípio 
Baseado no comportamento da luz monocromática e de sua especificidade diante 
das diferentes soluções biológicas, permitindo a construção de diferentes curvas de 
absorção(Princípio Qualitativo). Observação da Leis de Beer e Lambert (Princípio 
Quantitativo). 
Espectrometria e os métodos espectrométricos: referem-se às medidas das 
intensidades das radiações usando transdutores fotoelétricos ou outros tipos de 
dispositivos eletrônicos. 
 
A espectrometria é um conjunto de recursos que nos permite identificar a estrutura 
das partículas que constituem as substâncias. Atualmente existem tecnologias tão 
avançadas que se torna possível descrever com precisão a estrutura exata de uma 
molécula. Os equipamentos modernos permitem detectar os tipos de elementos 
presentes no composto, a quantidade de cada um deles, a posição tridimensional de 
cada átomo e muito mais. Esses aparelhos funcionam basicamente a partir de feixes 
de onda eletromagnética incidentes sobre uma amostra do composto, que então, 
absorve energia em determinados comprimentos de onda. Os valores da energia e dos 
comprimentos de onda absorvidos são detectados no aparelho e transformados em um 
gráfico no computador. É então pela análise desse gráfico que se determina a estrutura 
da molécula. 
Um espectrofotômetro é um aparelho que faz passar um feixe de luz 
monocromática através de uma solução, e mede a quantidade de luz que foi absorvida 
por essa solução. Usando um prisma o aparelho separa a luz em feixes com diferentes 
comprimentos de onda. Pode-se assim fazer passar através da amostra um feixe de 
luz monocromática (de um único comprimento de onda, ou quase). O 
espectrofotômetro permite-nos saber que quantidade de luz é absorvida a cada 
comprimento de onda. Os principais componentes do espectrofotômetro de feixe 
simples são: 
Radiação 
 Comprimento 
de onda 
 Energia 
(kcal/mol) 
 Efeito causado nas 
partículas 
Raio Gama < 120 nm > 286 ----- 
UV no vácuo 100 - 200 nm 286 - 83 Transição eletrônica 
UV próximo 200 - 380 nm 83 - 36 Transição eletrônica 
Luz visível 380 - 800 nm 83 - 36 Transição eletrônica 
 Infravermelho 8 - 300 mm 36 - 01 Vibração e deformação 
 Microondas 1 cm 10-4 Rotação 
 Radiofrequência metros 10-6 Acoplamentos de spins 
 Lâmpada de intensidade constante, radiação contínua e intensa. Para região 
visível usa-se lâmpada de tungstênio e para U.V., lâmpada de hidrogênio, com emissão 
de radiação de 100 a 350um; 
 Filtros são lâminas de vidro corado que isolam faixas amplas de y; 
 Monocromadores isolam faixas estreitas de comprimento de onda; 
 Cubetas de absorção podem ser de vidro ou de quartzo, com comprimentos de 
1,5 e 10 cm de trajeto óptico; 
  Detectores convertem energia radiante para sinal elétrico; 
 Mediadores apresentam escalas de T% e A. 
Diferentes substâncias tem diferentes padrões de absorção, a espectrofotometria 
permite-nos, por exemplo, identificar substâncias com base no seu espectro. Permite 
também quantifica-las, uma vez que a quantidade de luz absorvida está relacionada 
com a concentração da substância. 
 
A espectrofotometria é baseada pela lei de Lambert-Beer que estabelece que a 
absorbância é diretamente proporcional a concentração da solução da amostra. O 
termo absorbância é utilizado para designar a quantidade de luz absorvida. Quando se 
trata de substâncias muito concentradas esta linearidade deixa de existir, sendo então 
adequado diluir a solução em estudo, anteriormente a sua análise. Pode-se também 
analisar a absorbância controlandoo comprimento de onda que será incidido na 
amostra, que será indicado pela transmitância, que representa fração da luz incidente 
com um comprimento de onda especifico, que atravessa uma amostra da matéria. É 
utilizada uma solução-padrão com diferentes concentrações (pontos), que tem sua 
absorbância determinada. Esses pontos são preparados diluindo-se a solução padrão 
na proporção necessária para a obtenção das concentrações desejadas. Com os 
valores de absorbância e de concentração conhecidos, pode-se traçar um gráfico cujo 
perfil é conhecido como “curva-padrão”. 
6.2 Objetivo 
 Descrição das funções do espectrofotômetro; descrever o processo de 
determinação da curva de absorção espectral; enunciar a lei de Beer e Lambert e o 
princípio básico de absorção da luz; saber usar a equação: A= E.C. 
6.3 Materiais 
• Espectrofotômetro (calorímetro); 
• corantes: verde malaquita, azul de cresil brilhante, auramina e vermelho neutro; 
• tubos de ensaio; 
• água destilada; 
• micropipetas automáticas. 
 
6.4 Método 
Distribuiu 10ul de corantes em diferentes tubos de ensaio contendo 10 ml de água 
destilada. A solução que foi colorida percorreu todos os comprimentos de ondas 
disponíveis no espectrofotômetro. Após, zerou-se o espectrofotômetro a cada 
comprimento de ondas com destilada antes de aferir a absorbâncias das soluções 
coloridas. Foi construído gráficos e tabelas anotando os respectivos valores das 
absorbâncias nas respectivas passagens pela luz monocromática. 
6.5 Resultados 
 Diante dos processos físicos realizados pelo aparelho de espectrofotometria, 
podemos analisar as propriedades das soluções, por exemplo: as concentrações. E 
com a utilização de cálculos juntamente com os resultados obtidos, pela aparelhagem, 
é possível definir a concentração, em margens muito aproximadas, de soluções de 
concentrações desconhecidas. Para a leitura de absorbância de uma espécie na curva, 
um valor para a concentração é encontrado, estando mais evidente a frequência de 
absorção máxima. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6.6 Anexos 
 
 
7. Eletroforese 
7.1 Princípios 
A eletroforese é uma técnica laboratorial realizada com o objetivo de separar 
moléculas de acordo com o seu tamanho e carga elétrica para que se possa ser 
realizado o diagnóstico de doenças, seja verificada a expressão de proteínas ou se 
possa identificar microrganismos. 
A eletroforese é um procedimento simples e de baixo custo, sendo utilizado na 
rotina laboratorial e em projetos de investigação. De acordo com a finalidade da 
eletroforese, pode ser necessária a realização de outros testes e exames para que se 
possa chegar a um diagnóstico, por exemplo. 
 
 
 
 
⮚ Para que serve 
 
A eletroforese pode ser realizada com diversas finalidades, tanto em projetos de 
investigação quanto no diagnóstico, já que se trata de uma técnica simples e de baixo 
custo. Dessa forma, a eletroforese pode ser realizada para: 
● Identificar vírus, fungos, bactérias e parasitas, sendo mais comum essa 
aplicação em projetos de investigação; 
● Teste de paternidade; 
● Verificar a expressão de proteínas; 
● Identificar mutações, sendo útil no diagnóstico de leucemias, por exemplo; 
● Analisar os tipos de hemoglobina circulantes, sendo útil no diagnóstico da 
anemia falciforme; 
● Avaliar a quantidade de proteínas presentes no sangue. 
De acordo com a finalidade da eletroforese, pode ser necessária a realização de 
outros exames complementares para o médico possa concluir o diagnóstico. 
7.2 Materiais 
 
Agarose: extraída a partir de algas marinhas é extremamente fácil de preparar, 
basta misturar o pó de agarose com solução tampão e derreter por aquecimento, ao 
resfriar transforma-se no gel de agarose. 
Tampão de eletroforese: geralmente Tris-acetato-EDTA (TAE) ou Tris-borato-
EDTA (TBE). 
 Marcador de peso molecular:1kb. Frasco com 500µ: estabelece o padrão de 
peso molecular que serve como ponto de referência e monitoramento para a 
eletroforese. 
Corante: para visualizar o resultado da corrida sob a luz ultravioleta, utilizava-se 
o brometo de etídeo no gel, porém esta é uma substância cancerígena e pode interferir 
no padrão de migração. A melhor opção em sua substituição é o corante safer, pois 
além de mais sensível não é mutagênico. 
Cuba de eletroforese e fonte de eletroforese: possibilita o preparo do gel e 
fornece a corrente necessária para uma corrida uniforme. 
Transiluminador: fonte de luz UV ou LED usada para visualizar o resultado da 
corrida de eletroforese. 
 
Após preparação do gel, deve ser colocado um objeto específico para que sejam 
feitos os poços no gel, chamado popularmente de pente, e deixar o gel firmar. Quando 
o gel estiver pronto, basta aplicar as substâncias nos poços. Para isso, deve-se colocar 
um marcador de peso molecular em um dos poços, um controle positivo, que é a 
substância que se sabe o que é, um controle negativo, que garante a validade da 
reação, e as amostras a serem analisadas. Todas as amostras devem ser misturadas 
com um corante fluorescente, pois dessa forma é possível visualizar as bandas no 
transiluminador. 
O gel com as amostras deve ser colocado na cuba de eletroforese, que contém a 
solução tampão específica, e, em seguida, é ligado o aparelho para que haja corrente 
elétrica e, consequentemente, diferença de potencial, que é importante para que haja 
a separação das partículas de acordo com a sua carga e tamanho. O tempo da corrida 
eletroforética varia de acordo com o objetivo do procedimento, podendo durar até 1 
hora. 
Após o tempo determinado, é possível visualizar o resultado da corrida 
eletroforética por meio do transiluminador. Quando o gel é colocado sob luz UV ou 
LED, é possível visualizar o padrão de bandas: quanto maior a molécula, menor é a 
sua migração, ficando mais próximo do poço, enquanto que quanto mais leve for a 
molécula, maior é o potencial migratório. 
Para que a reação seja validada, é preciso que sejam visualizadas as bandas do 
controle positivo e que no controle negativo não seja visualizado nada, pois caso 
contrário é indicativo de que houve contaminação, devendo todo o processo ser 
repetido. 
 
 
 
⮚ Tipos de eletroforese 
A eletroforese pode ser realizada com diversas finalidades e, de acordo com o seu 
objetivo, pode ser utilizados vários tipos de gel, sendo os mais comuns o de 
poliacrilamida e o de agarose. 
A eletroforese para identificar microrganismos é mais comum de ser realizada em 
laboratórios de investigação, no entanto, para fins diagnósticos, a eletroforese pode ser 
utilizada para identificar doenças hematológicas e doenças que evoluam com o 
aumento da quantidade de proteínas, sendo os principais tipos de eletroforese: 
1. Eletroforese de hemoglobina 
A eletroforese de hemoglobina é uma técnica laboratorial realizada para identificar 
os diferentes tipos de hemoglobina circulantes no sangue, sendo possível identificar a 
presença de doenças relacionadas à síntese de hemoglobina. O tipo de hemoglobina 
é identificado por meio da eletroforese em pH específico, idealmente entre 8,0 e 9,0, 
sendo verificado um padrão de bandas que pode ser comparado ao padrão normal, 
permitindo identificar a presença de hemoglobinas anormais. 
Para que é feita: A eletroforese de hemoglobina é feita para investigar e 
diagnosticar doenças relacionadas à síntese de hemoglobina, como anemia falciforme 
e doença da hemoglobina C, além de ser útil na diferenciação das talassemias. 
Saiba como interpretar a eletroforese de hemoglobina. 
2. Eletroforese de proteínas 
A eletroforese de proteínas é um exame solicitado pelo médico para avaliar a 
quantidade de proteínas circulantes no sangue e, assim, identificar doenças. Esse 
exame é feito a partir de uma amostra de sangue, que é centrifugada para que se 
obtenha o plasma, que a parte do sangue constituída, dentre outras substâncias, porproteínas. 
Após eletroforese, pode ser visualizado um padrão de bandas e, posteriormente, 
um gráfico em que é indicada a quantidade de cada fração de proteínas, sendo 
fundamental para o diagnóstico. 
Para que é feita: A eletroforese de proteínas permite que o médico investigue a 
ocorrência de mieloma múltiplo, desidratação, cirrose, inflamações, doenças do fígado, 
pancreatite, lúpus e hipertensão de acordo com o padrão de bandas e o gráfico 
apresentado no laudo do exame. 
 
 
8. CROMATOGRAFIA 
8.1 Princípio 
 
É uma metodologia que visa separar substancias baseadas em substâncias físicas 
e químicas. É realizada por meio de uma técnica quantitativa, a qual tem por finalidade 
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geral duas utilizações, a de identificação de substâncias e de separação-purificação de 
misturas. Usando propriedades como solubilidade, tamanho e massa. Desse modo, é 
vista também como o movimento que os sistemas biológicos em condições 
consideradas dentro do padrão de normalidade apropriadas e com propriedades que 
se vincule com os processos bifásicos, com a finalidade de separar os vários tipos de 
componentes presentes neste sistema, a fim de que cada elemento tenha seu devido 
trajeto. O comportamento da mobilidade do componente deve obedecer as diferentes 
propriedades que intervenham no processo: adsorção, solubilidade, peso molecular, 
carga elétrica e afinidade. Trata-se de um método com bases técnicas simples e muito 
importante para a separação rápida e qualitativa de pequenas quantidades de material. 
A técnica é baseada na migração dos compostos da mistura, os quais apresentam 
diferentes interações através de duas fases: a fase móvel a qual os componentes a 
serem isolados "correm" por um solvente fluido, podendo ser eles líquido ou gasoso e 
a fase estacionária que é considerada como a fase fixa em que o componente que está 
sendo separado ou identificado irá se fixar na superfície de outro material líquido ou 
sólido. Entretanto, a classificação da cromatografia, segundo o modo de separação, 
leva em conta os princípios físicos e químicos subjacentes na partição dos solutos entre 
as 2 fases distintas: 
 Cromatografia de adsorção: nesta as separações ocorrem através de 
interações eletrostáticas e forças de Van Der Waals entre a fase estacionária (sólido) 
e os componentes a separar da fase móvel (líquido ou gás). A fase estacionária pode 
ser muito diversa, nomeadamente sílica gel, alumina ou celulose. O fraccionamento por 
cromatografia de interação hidrofóbica em coluna, sobretudo de misturas contendo 
espécies não iónicas solúveis em solventes orgânicos, é essencialmente determinado 
por diferenças de polaridade dos componentes na mistura a resolver. 
Cromatografia de partição: é baseada nas diferenças de solubilidade dos 
componentes na fase estacionária (líquido) e na fase móvel (líquido). 
Cromatografia de troca iônica: a separação ocorre devido diferentes tendências 
de os componentes iônicos ou ionizados permutarem com íons da fase estacionária, 
que, a partir daí são deslocados para a fase móvel. Assim, a afinidade entre os íons da 
fase móvel e o suporte pode ser controlada por alteração do pH e da força iônica do 
eluente. 
Cromatografia de filtração em gel: é denominada também como exclusão 
molecular ou separação por peneiros moleculares. Esta separa os componentes 
segundo o tamanho efetivo das moléculas, isto é, macromoléculas que não penetram 
no interior do suporte (partículas porosas de gel) e movem-se de forma mais rápida ao 
longo da coluna de onde emergem primeiro, enquanto as micromoléculas vêm a sua 
velocidade de deslocamento retardada porque penetram no gel, portanto, emergem da 
coluna mais tardiamente. 
Cromatografia de afinidade: esta ocorre a partir de uma ligação molecular 
específica e reversível entre o soluto e um ligante imobilizado na fase estacionária. 
Esta técnica é utiliza especificamente para separar produtos biológicos, e como 
exemplos podemos: ligações enzimáticas e substratos, anticorpos e substratos e 
receptores de hormonais. 
 
Cromatografia em placas: 
 Consiste na separação de uma mistura através da migração de seus 
componentes sobre uma camada delgada de adsorvente (fase estacionária) retido 
sobre uma superfície plana, geralmente placas de vidro. Isso acontece devido a 
processos de adsorção. Após ocorrido o processo, a placa passa a se chamar 
cromatograma. 
 
Cromatografia em colunas: ocorre em uma coluna de vidro ou metal, geralmente, 
com uma torneira na parte inferior. A coluna é preenchida com um adsorvente 
adequado que irá permitir o fluxo do solvente. 
 
8.2 Objetivos 
 
Enunciar o princípio da separação cromatográfica, descrever as fases da 
cromatografia e suas funções, saber construir um modelo cromatográfico simples de 
separação e identificação pela cromatografia, idealizar uma aplicação quantitativa na 
pratica cromatográfica, utilizando o Rf (Relação à frente) = distância percorrida da 
substância/distância percorrida eluente. 
 
8.3 Materiais 
Corantes: verde malaquita, azul de metileno, vermelho neutro, solução eluente, 
álcool absoluto, éter, acetona; papel filtro, tesoura, régua, Becker, pipetas de 10 ml, 
micropipetas de 10μl; vidro de relógio. 
 
8.4 Métodos 
Teve como método construir sistemas bifásicos em placas com fase fixa e fase 
móvel, respectivamente usando álcool, água destilada, éter e acetona. Dessa forma, a 
mistura do substrato teve afinidade pelos eluentes do sistema os quais se movem e 
arrastam os componentes da mistura apresentando velocidade de corrida, tempo de 
corrida ou distância percorrida que deverão ser tomadas e normatizadas. Assim, 
construiu um sistema suporte devidamente mensurado onde deveremos observar as 
distâncias percorridas para aplicação da Rf e para serem relacionados com padrões 
conhecidos. 
8.5 Resultados 
Nota-se que foi observada a cromatografia de camada delgada, uma técnica que 
consiste em preparar uma superfície de material absorvente, como papel, ou até 
mesmo sílica alumina. Sendo que nesta superfície que colocamos a amostra e em 
seguida, mergulhamos o extremo contendo a amostra em um solvente. O solvente 
sobe na placa arrastando a amostra. Se existir produtos diferentes na amostra, eles 
tendem a se separar. Os componentes da mistura são identificados pela cor. Pode-se 
perceber que depois de um tempo o eluente percorrer o papel filtro de modo que o 
corante vermelho se juntou a acetona, o azul apresentou afinidade com a água e o 
álcool e o verde com o éter. Sendo que o caráter fixador é do éter.Sendo que após a 
separação na coluna, o papel de filtro foi recortado, e os corantes foram retirados do 
papel de filtro com o solvente que possuía afinidade sendo recolhido no vidro de relógio.