Citometria de fluxo

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Por Glenda Domingos Mascarenhas
Orientadora: Dra. Carmem Beatriz Wagner Giacoia Gripp
Iniciação Científica
Atua como primeira linha de desefa contra microrganismos invasores
e serve como subsídio da imunidade adaptativa;
Composto por barreiras físicas e químicas, como epitélios e agentes
antimicrobianos, por células especializadas e moléculas solúveis;
As células da imunidade inata compreendem uma família de
granulócitos, formada por neutrófilos, eosinófilos e basófilos, além
de células dendríticas, monócitos e macrófagos e células NK;
Essas células reconhecem moléculas antigênicas comuns aos
microrganismos, que constituem padrões moleculares associados a
patógenos - PAMPs, através de seus receptores de reconhecimento
de padrões (RRPs).
Imunidade inata
Apresenta duas características principais: 
 especificidade e memória;
Composto por duas linhagens celulares: os linfócitos T
e os linfócitos B;
Os linfócitos T efetores formam populações: T CD4
auxiliares e T CD8 citotóxicas;
Os linfócitos B formam as populações de anticorpos,
que são proteínas globulares com 5 isotipos (IgM,
IgG, IgE, IgA e IgD), capazes de anular a ação de
microrganismos de acordo com sua função no
organismo.
Imunidade Adaptativa
Foram descobertos em 1975 por Köhler e Milstein,
a partir de uma técnica chamada de hibridoma;
São anticorpos produzidos a partir de um único
clone de linfócito B e que se ligam a uma região
específica do antígeno;
São utilizados na identificação de marcadores
fenotípicos únicos para determinados tipos
celulares, em diagnóticos de doenças
infecciosas e degenerativas;
Esses resultados são obtidos por meio da sua
associação com a citometria de fluxo.
Anticorpos monoclonais
Primeiro Citômetro de Fluxo Cell Sorter foi construído por Mack Fulwyler (1965);
Descoberta da técnica de produção de anticorpos monoclonais por Köhler e Milstein (1975);
Associação de anticorpos monoclonais a substâncias fluorescentes;
Surgimento de diferentes tipos de lasers, o desenvolvimento eletrônico e da informática
computacional;
No Brasil, o primeiro citômetro de fluxo foi importado em 1988 – o EPICS 751 da Coulter Electronics,
Inc. e instalado no então Departamento de Protozoologia, do Instituo Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Rio
de Janeiro. 
Ministério da saúde determinou a utilização do equipamento em todo laboratório clínico que
participasse da rede CD4/HIV
Laboratórios de exames diagnósticos para desordens hematopoiéticas, passaram a utilizar;
Na pesquisa científica, se tornou a técnica de escolha nas avaliações fenotípicas e funcionais em
contextos imunoparasitológicos e de biologia celular.
Histórico da Citometria de Fluxo
METODOLOGIA
Uma ou mais fonte de laser;
Um sistema contínuo de fluxo
hidrodinâmico de solução salina;
Uma câmara de fluxo;
Um sistema ótico;
Fotossensores.
Citômetro de Fluxo
Citômetro de fluxo BD FACS Aria Cell Sorter. 
Metodologia utilizada para estudo celular, que avalia
sua morfologia, fenótipo e função. 
Também utilizada para Sorting – o sorteamento ou
purificação de uma determinada população celular, a
aprtir de uma suspensão heterogênea de células.
Se baseia na detecção de disperção da luz e da
fluorescência emitida por fluorocromos acoplados a
anticorpos que se ligam a uma molécula específica na
célula.
Fotomultiplicadores (PMTs) convertem a luz captada
em sinais eletrônicos, que são enviados ao computador
e analisados por um software.
Citometria de Fluxo
Fluorocromos são moléculas que ao sofrer
excitação por um laser, emitem um comprimento de
onda - cor - característico;
Sua conjugação com anticorpos monoclonais 
 permite a identificação de moléculas na superfície
ou no interior das células;
A combinação AcMo-fluorocromo deve ser
escolhida de acordo com a molécula que se deseja
avaliar e a cor que o fluorocromo vai emitir; 
Lasers são usados como fonte de luz para
mensuração celular e excitação dos fluorocromos;
Fluorocromos e lasers 
 Os mais utilizados são iônicos refrigerados a
ar ou de estado-sólido;
A maioria dos fluorocromos são excitados
pelos lasers de cor azul - 488 nm.
O sistem óptico consiste em um conjunto de filtros e espelhos
que têm como função direcionar a luz.
Filtros Dicróicos: Refletem um determinado comprimento de
onda e deixa que outros comprimentos atravessem o filtro. 
Long pass
Short pass
 Filtros de Interferência: Também chamados de band pass,
permite que um comprimento de onda específico atravesse o
filtro e evita a interferência de outros comprimentos de onda.
Filtros de bloqueio: têm um poder maior de reflexão, não
perimte que comprimentos de onda acima do que é refletido
atravessem o filtro.
Sistema óptico
Sistema eletrônico e software
O sistema eletrônico monitora e controla o funcionamento do equipamento e converte a luz captada
pelos fotomultiplicadores em pulsos elétricos que serão enviados para o computador;
Pulso elétrico é proporcional às características de tamanho, granularidade e fluorescência de
cada célula interceptada pelo laser.
A medição dos fotossensores é chamada de parâmetro - Forward scatter, Side scatter e
fluorescências. 
Os softwares fornecem as informações morfológicas das células e permitem a montagem de
histogramas e gráficos de acordo com os parâmetros a serem analisados.
Cada citômetro de fluxo apresenta um software específico. Ex: FlowJo (Tri_Star Inc.)
Necessária montagem prévia dos protocolos com gráficos
mono e biparaméricos para análise dos diferentes
parâmetros avaliados.
Primeiro se avalia as propriedades físicas - tamanho e
granularidade - para identificação das populações.
Posteriormente, a intensidade da fluorescência dos
fluorocromos utilizados na amostra é avaliado.
Monoparamétrico
Biparamétrico
O gráfico pode ser dividido em 4 quadrantes;
Dot plot
Protocolo de obtenção de células
Ficoll Hypaque: sedimentação 
Necessário escolher a partícula(s) e ou molécula(s) celular(es) de interesse;
Ex: Suponha que em uma amostra de sangue periférico, submetida anteriormente ao tratamento
com Ficoll, se deja identificar monócitos e linfócitos TCD4;
AcMo anti CD14
AcMo anti CD3
AcMo anti CD4
Cada anticorpo monoclonal deve estar associado a fluorocromos com comprimentos de onda
diferentes;
Para a escolha do fluorocromo é necessário saber quais comprimentos de onda são "lidos" pelo
citômetro de fluxo.
Protocolo de marcação
Tubo com suspensão celular é acoplado ao citômetro de
fluxo e as células seguem, aos poucos, para a câmara de
fluxo, que é preenchida por solução salina;
No foco hidrodinâmico cada célula é, individualmente,
interceptada pelo laser;
A emissão de diferentes comprimentos de onda é
direcionada para os fotomultiplicadores, que dispõe de
divrsos filtros.
Fluorescências são convertidas em sinal eletrônico e a
informação obtida é convertida em dados de histograma
ou dot plot por meio de software.
Princípios da Citometria de Fluxo
Avaliação de tamanho
e granularidade
A luz do laser azul, ao interceptar a célula, é refratada e
dispersada permite avaliar tamanho e granularidade celular;
Forward scatter: Permite a análise do tamanho da célula. 
Side scatter: Permite a análise da granularidade celular de
acordo com a luz do laser refratada a 90º;
Compensação das cores
Espectro de emissão de fluorescência é amplo,
apresentando variação;
Subtração eletrônica da fração da fluorescência que
sobrepõe a outra - compensação das cores;
Utilização da marcação individual das amostras com cada
fluorocromo;
 Ajuste do percentual de marcação somente para uma
determinada fluorescência;
Após a compensação, a amostra é então adquirida e
analisada.
APLICAÇÕES
Avaliação do conteúdo de DNA
Permite determinar a distribuição das populações
celulares presentes na amostra ao longo das
diferentes fases do ciclo celular;
Pode ser realizado com células vivas e permite uma
avaliação quantitativa;
Uso de PI - Protocolos para identificação de células
emdiferentes fases do ciclo celular necessitam de
permeabilização da membrana.
Apoptose pode ser carcaterizada com base nos
parâmetros morfológicos, bioquímicos e moleculares;
Pode ser observada apenas pelos parâmetros de
tamanho e granularidade;
Avaliação da degradação do DNA por PI, DAPI, Anexina
V, entre outros marcadores;
 Anticorpos monoclonais específicos como anti-Fas, anti-
Bax, anti-Bid, anti-Bcl2, anti-caspase3.
Morte Celular
Referências
MURPHY, K., TRAVERS, P., WALPORT, M. Imunobiologia de Janeway, 7ª edição. Porto Alegre, Artmed, 2010
Citometria de Fluxo Cell Sorting fundamentos e aplicações 
Citometria de fluxo: imunofenotipagem e avaliação de células citotóxicas na resposta a patógenos 
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