ESTUDOS IN VIVO - PRINCIPIOS EM PESQUISA LABORATORIAL (ESTUDOS EM ANIMAIS, CULTURA DE CELULAS E BIOCOMPATIBILIDADE - METODOLOGIA DA PESQUISA OU METODOLOGIA CIENTÍFICA

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ESTUDOS IN VIVO
INTRODUÇÃO
ENSAIOS LABORATORIAIS
Subtipos:
- Estudos in vitro
- Estudo in ex vivo / material humano (coleto a amostra / órgão do animal e continuo o experimento com esse material ainda vivo 
fora do animal, em ambiente laboratorial)
- Estudo in vivo
Vantagens:
- Elimina a subjetividade dos achados e proporciona melhor comparação de estudos
- Ensaios controlados (redução de viés)
- Útil quando há restrições no uso de seres humanos
Desvantagens:
- Limitação da extrapolação de resultados laboratoriais para seres humanos
ESTUDOS EM ANIMAIS
Histórico: 
- Hipócrites (450 aC) com dissecção de órgãos de animais
- Galeno (340 dC) com vivissecção experimentais
- 1964 – Declaração de Helsinque: regulamentou a pesquisa clínica em humanos e a pesquisa em animal. Necessidade de 
desenvolvimento de modelos animais prévios a pesquisa em humanos
Porque ainda fazemos pesquisas em animais?
- Questões econômicas e práticas
- Organismos complexos (cultura – único tecido)
- Repetição de experimentos, extração dos tecidos tratados, análises invasivas
- Questões éticas envolvendo a pesquisa em seres humanos
- Sequencia: Estudos experimentais (cultura de células) → Modelos em animais → Ensaios clínicos
- Hoje em dia usamos em pesquisas mais ratos e camundongos devido a alta compatibilidade do DNA deles com o humano
PRINCIPIOS ÉTICOS PARA ESTUDOS EM ANIMAIS
Principio dos 3 R’s
Replace (substituição):
- Sempre que possível substituir o uso de modelo animal por outra estratégia
- Uso de pesquisa bibliográfica visando a compilação de resultados pré-existentes
- Uso de modelos matemáticos e computacionais
- Uso de técnicas físico-químicas
- Uso de técnicas in vitro
- Acompanhamento de humanos pos-comercialização de drogas e compilação de dados epidemiologicos
Reduce (redução):
- Uso o menor número possível de animais
- Tratamentos estatísticos: numero amostral a partir de pesquisas prévias
- Escolha de espécie ou linhagem adequadas: variabilidade genética, características intrínsecas
- Realização de estudos pilotos: verificar a viabilidade
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ESTUDOS IN VIVO
ESTUDOS EM ANIMAIS
PRINCIPIOS ÉTICOS PARA ESTUDOS EM ANIMAIS
Principio dos 3 R’s
Refine (refinamento):
- Reduzir o sofrimento ao qual os animais serão submetidos
- Treinamento da equipe: biologia e comportamento animal, manejo adequado
- Procedimento experimental: técnicas anestésicas e adequação de fármacos
- Enriquecimento ambiental: melhorias no bem-estar e funções do animal
- Ex: dar medicação para dor, separar machos e femeas...
TIPOS DE ANIMAIS E CARACTERÍSTICAS DE MANEJO
- Camundongos (50%) e ratos (25%) são os animais mais utilziados atualmente
Ratos:
- Linhagem mais utilizada: wistar (rattus novergicus)
- Albinos, orelhas alongadas, tamanho 35 cm
- Gestação: 20 a 22 dias
- Tempo de vida máximo: 14-20 meses
Camundongo:
- Linhagem mais utilizada: swiss (mus muscullus)
- Albinos, tamanho médio: 13 cm
- Gestação: 19 a 20 dias
- Tempo de vida máximo: 10-12 meses
Quanto a status sanitário:
- Gnobioticos (podem ser axenicos – germ free ou de biota definida)
- Convencionacis
Quanto a genetica
- Heterogenicos
- Isogenicos (animais parentes entre si)
- Mutantes espontâneos (mutação importante para estudo)
- Geneticamente modificados (knock-in tem gene modificado ou substituído x knock-out tem gene deletado)
Biotério - Estrutura
- Gaiolas de prolipropileno ou policarbonato (convencionais ou IVC – controles individuais e com filtro)
- Trocas 2-3 vezes por semana: ração, água e maravalha (raspa de madeira)
- Ficam dentro de estufas para controle de temperatura de umidade, filtragem de ar e ciclo claro/escuro
Manejo do animal
- Há diversas técnicas de imobilização
Vias de administração de drogas
- Via oral, via subcutânea, via intramuscular, via endovenosa, via intraperitoneal
Coleta sanguinea
- Possibilita analise de parâmetros hematológicos semelhante ao humano
- Eritrograma, leucograma, plaquetograma / Dosagens bioquímicas: glicemia, TGO, TGP, Lipidograma / Dosagem de citocinas
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ESTUDOS IN VIVO
ESTUDOS EM ANIMAIS
Meios / Vias de coleta sanguínea:
- Plexo Retroorbital: animal sedado e anestesiado topicamento→ uso de capilar 45º no ângulo globo ocular, quantidade media
de sangue (só pode fazer essa coleta no dia de sacrifício do animal) – é a coleta com mais sangue
- Mandibular (veia facial)
- Veia caudal
EUTANÁSIA
Métodos recomendados:
Quimicos inalantes:
- Camara de CO2
- Sobredosagem de isoflurano
Quimicos injetáveis:
- Sobredosagem de barbitúrico
- Sobredosagem anestésica
- Cloreto de potássio + anestésico
Físicos:
- Deslocamento cervical
- Decapitação por guilhotina
REGULAMENTAÇÃO PARA PESQUISA EM ANIMAL
- Comitê de ética – CEUA – Comissão de Ética na utilização de animais
- Esse comitê é próprio pra cada faculdade onde será realizado o estudo
Documentos necessário para submissão ao comitê de ética animal:
- Uma versão impressa completa do projeto
- Uma versão impressa completa do protocolo de subsmissão (contendo as assinaturas solicitadas)
- Dois CDS contendo uma copia do projeto de pesquisa, uma copia do protocolo e uma copia do termo de responsabilidade de 
submissão preenchido
- Termo de responsabilidade do responsável pelo projeto
- Licenças para coleta
- Transporte
- Manipulação de animais
- Registros
- Termo de consentimento livre e esclarecido do proprietarario ou responsável pelo animal
- Caso o projeto fosse pendente e esteja sendo reencaminhado: anexar o numero do projeto no CEUA
MELISSA BASTOS - @melissacbastos
ESTUDOS IN VIVO
CULTIVO CELULAR
- Manutenção de células vivas (in vitro)
- Crescimento em recipientes estéreis
- Estudos funcionais, bioquímicos e moleculares, alvos farmacológicos e produtos biológicos
- Medicina regenerativa→ Células-tronco
- Engenharia de tecidos → Criação de tecidos artificiais
Vantagens:
- Controle do ambiente
- Homogeneidade da amostra
- Economia
- Principal modelo alternativo para a substituição dos animais
Desvantagens:
- Deve haver um ambiente altamente controlado para evitar contaminação
Tipos de células cultivadas:
- Amostra de tecido→ Dissociação→ Adesão → 1º Monocamada
Cultura celular primarias: 
- Obtenção direta do tecido
- Manutenção das características de origem
- Tempo de vida curto: apoptose
Cultura secundaria:
- Obteñção de culturas primarias
- Podem ocorrer modificações em relação a célula de origem
Meios de cultura:
- Fornecem as substancias essenciais para o crescimento
- Controlam o crescimento in vitro
- Complementares as substancias biossintetizadas pelas células
- Suprir necessidades especificas das células
- Devem apresentar: sais minerais, hidratos de carbono, aminoácidos, vitaminas, proteínas, peptídeos...
Ensaios:
Ensaios de citotoxicidade:
Objetivo: identificar se o material ou dispositivo produz efeitos letais ou subletais
Aplicado a todos os biomateriais:
- Caracterização de biocompatibilidade
- Criterio de exclusão
- Segurança referente a resposta in vivo
Vantagens:
- Curto tempo de ensaio
- Pequeno numero de variáveis experimentais
Produção de imunológicos: Imunoensaios, anticorpos, vacinas...
Obtençao de isolamento viral
Terapia celular: células-tronco: Medicina regenerativa e engenharia de tecidos, Restabelecer a função ou a estrutura de um tecido
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ESTUDOS IN VIVO
BIOCOMPATIBILIDADE DOS MATERIAIS DENTARIOS
- Avaliar o comportamento biológico dos materiais odontológicos
Teste de implantação em tecido subcutâneo de ratos:
- Tricotomia da região dorsal: eliminação de pelos
- Desinfecção da área: álcool
- Incisão central em tecido subcutâneo: 8mm – divulsão tecidual para se obter 2 ou 4 lojas cirúrgicas
- Obs: cuidado para não haver sangramento
- Uso de tubos
- Cortes histológicos: avaliação da resposta tecidual presente na interface entre o material experimental e tecidoconjuntivo do 
animal
MELISSA BASTOS - @melissacbastos