Seminário CRISPR e modulação epigenética

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CRISPR/Cas e 
modulação epigenética
Epigenética 
● Mudanças herdáveis e reversíveis no padrão de expressão gênica que não envolvem 
mudanças no DNA e estão relacionadas ao remodelamento da cromatina 
 
 
 
Eucromatina Heterocromatina 
Transcrição inativa Transcrição ativa 
Mecanismos epigenéticos: 
metilação e acetilação
Acetilação:
Cromatina 
pouco 
compactada.
Alta atividade 
transcricional.
Metilação:
Cromatina 
muito 
compactada.
Baixa 
atividade 
transcricional.
Edição de epigenoma 
O que é: reescrita direcionada de marcadores epigenéticos.
●
● As proteínas projetadas usadas para edição de epigenoma 
são compostas por um domínio de ligação de DNA que 
tem como alvo sequências específicas e um domínio efetor 
que modifica características epigenômicas.
Utilização: 
1. Modificar marcas epigenéticas em um determinado locus 
para explorar seus efeitos sobre a transcrição e 
consequências fenotípicas.
2. Tratamento epigenético: doenças relacionadas a 
mecanismos epigenéticos.
Métodos: ZFNs, TALENs, CRISPR 
 
 
 
● Não é uma técnica de edição gênica, apenas utiliza uma ferramenta de edição gênica.
● A dCas9 (desativada) tem o seu RNA guia e está ligada a ativadores ou repressores da 
transcrição (epigenetic effectores - epieffectors). 
Complexo dCas9 + epieffectors: pode metilar e desmetilar no nível do DNA, reescrever marcas 
de histona induzindo metilação ou acetilação no nível do nucleossomo e ser otimizado para 
melhorar a eficiência da edição.
CRISPR/Cas e modulação epigenética 
dCas9
● Cas9 com os dois domínios de 
clivagem desativados
Não corta, serve apenas como sítio de 
ligação ao DNA
dCas9
dCas9-SAM-system: Amplificação de genes 
● dCas9 fusionada a 
ativadores transcricionais, 
VP64 e p65
dCas9-KRAB system: Silenciamento de genes 
● Recruta modificadores de histona 
que remodelam a eucromatina 
para heterocromatina.
dCas9-p300 
Acetila a histona permitindo a transcrição
dCas9-LSD1
Desmetila a histona inibindo a transcrição
dCas9-Tet1 
Desmetila o DNA permitindo a transcrição
dCas9-DNMT3A 
Metila o DNA inibindo a transcrição
In Vivo Target Gene Activation via CRISPR/Cas9- 
Mediated Trans-epigenetic Modulation
Ativação de gene alvo in vivo via modulação trans-epigenética mediada por CRISPR/Cas9
 Em resumo, desenvolvemos um sistema 
CRISPR / Cas9 TGA in vivo para ativar a 
expressão de genes endógenos. Este 
sistema pode induzir a remodelação 
epigenética de loci direcionados ao recrutar 
a maquinaria transcricional (um processo 
que chamamos de modulação 
trans-epigenética) e pode ser 
potencialmente usado para tratar uma ampla 
gama de doenças e lesões humanas
● dgRNA com alça MS2 
capaz de recrutar o 
complexo transcricional 
MS2-P65-HSF1 (MPH)
● é uma adaptação do 
sistema dCas9-SAM
Secreção de 
insulina em ratos 
diabéticos
dgPdx1
Compensação de 
defeitos genéticos 
musculares
dgFst
dgUtr
Tratamento de rins 
por expressão de 
genes silenciados
dgKlotho
dgIL-10
Superexpressão de folistatina (Fst)
● Escolheram esse gene para o experimento porque ele está envolvido no 
aumento de massa muscular. → Aumento da expressão pode causar alteração 
no fenótipo? 
● De fato, as construções dgFst-MPH aumentaram em 50x a expressão de Fst 
relativo ao controle.
Melhora em fenótipos da Distrofia Muscular de Duchenne
● A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) surge pela incapacidade do organismo em 
produzir uma proteína essencial para o músculo, a distrofina. Isso acarreta problemas 
como fraqueza muscular, dificuldade de ficar em pé etc.
A alternativa para tratar foi aumentar a expressão do gene da Utrofina (Utrn), 
já que a proteína possui 80% de similaridade com a Distrofina.
● A expressão foi 
confirmada por análise 
dos transcritos e por 
imunofluorescência.
● A força dos músculos 
posteriores 
foi realmente aumentada.
Ativação epigenética de Pdx: diabetes tipo 1 
● O gene Pdx (pancreatic and duodenal 
homeobox gene 1) foi superexpresso 
numa tentativa de tratar ratos com 
diabetes tipo 1. -> Células passam a 
secretar insulina. 
Remodulação epigenética de Pdx
● Diferença observada entre ratos que receberam injeção com o controle e aqueles que 
receberam com Pdx. Padrão similar ao observado em tecidos que expressam Pdx.
Tratamento de doença aguda do rim restaurando
expressão de genes silenciados
Klotho - protege contra danos renais e tem 
expressão diminuída na doença 
Interleucina (IL)-10 - citocinina antiflamatória, 
melhora danos no rim quando seguido de 
tratamento com cisplatina.
Genes que serão induzidos com o objetivo de 
tratar a doença
In vitro: células tronco para 
testar dgRNAs teriam a 
melhor expressão
Medição de nitrogênio da uréia e creatinina para estimar melhora nos rins.
-> Os dois devem ser filtrados do sangue pelos rins quando estão funcionando de maneira saudável
Os níveis de ambos diminuíram com o tratamento.
Tratamento com 
cisplatina para induzir a 
lesão renal
Considerações e perspectivas
● A edição epigenômica mediada por CRISPR/Cas9 possui grande potencial para os 
estudos epigenéticos e terapêuticos em humanos.
● Por não gerar quebra da dupla fita, é um método mais seguro, que evita o 
surgimento de mutações indesejadas.
Para isso, alguns avanços devem acontecer:
- Experimentos que testem um modelo mais preciso que possa predizer efeitos 
off-target estão faltando.
- Alta especificidade e mecanismos mais claros devem ser um pré-requisito. É 
preciso conhecer mais sobre as questões envolvidas com regulação epigenética 
para que se possa ter segurança nesse tipo de tratamento.
Referências
● LIAO, Hsin-Kai et al. In Vivo Target Gene Activation via CRISPR/Cas9-Mediated Trans-epigenetic 
Modulation. Cell, [S.L.], v. 171, n. 7, p. 1495-1507, dez. 2017. Elsevier BV. 
http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2017.10.025.
● GENE Regulation with dCas9. Disponível em: 
https://info.abmgood.com/crispr-cas9-gene-regulation-dCas9. Acesso em: 28 abr. 2021.
● XIE, Nina et al. Novel Epigenetic Techniques Provided by the CRISPR/Cas9 System. Stem Cells 
International, [S.L.], v. 2018, p. 1-12, 8 jul. 2018. Hindawi Limited. 
http://dx.doi.org/10.1155/2018/7834175.
● Applied Biological Materials - abm. 4) CRISPR Cas9 - Gene Regulation with dCas9. Youtube, 2017. 
Disponível em <https://www.youtube.com/watch?v=ATSegvJEUkw>. Acesso em 29 abr. 2021.
http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2017.10.025
http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2017.10.025
https://info.abmgood.com/crispr-cas9-gene-regulation-dCas9
http://dx.doi.org/10.1155/2018/7834175
https://www.youtube.com/watch?v=ATSegvJEUkw