Princípios da Eletroforese

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Fonte: Khanacademy/Ciencianews/Embrapa 
1 Eletroforese em Gel 
Pontos Principais: 
A eletroforese em gel é uma técnica usada 
para separar fragmentos de DNA de acordo 
com seu tamanho. 
As amostras de DNA são carregadas nos 
poços (cavidades) localizados numa das 
extremidades de um gel, e uma corrente 
elétrica é aplicada para fazê-las avançar 
pelo gel. 
Os fragmentos DNA estão carregados 
negativamente, então movem-se na direção 
do eletrodo positivo. Já que todos os 
fragmentos de DNA têm a mesma 
quantidade de carga por massa, os 
fragmentos menores atravessam o gel mais 
rapidamente do que os maiores. 
Quando um gel é pigmentado com um 
corante que se liga ao DNA, os fragmentos 
de DNA podem ser vistos como bandas, 
cada uma representando um grupo de 
fragmentos de DNA de mesmo tamanho. 
Introdução 
Suponha que você tenha acabado de fazer 
uma reação de PCR, criando várias cópias de 
uma região de interesse do DNA. Ou talvez 
você tenha feito uma clonagem de DNA, 
tentando "colar" um gene em um plasmídeo 
de DNA circular. 
Agora, você quer verificar se seu PCR 
funcionou, ou se seu plasmídeo contém o 
gene certo. Que técnica você pode usar 
para visualizar (observar diretamente) os 
fragmentos de DNA? 
Eletroforese em gel 
A Eletroforese em gel é uma técnica usada 
para separar fragmentos de DNA (ou outras 
macromoléculas, como o RNA e proteínas) 
com base no tamanho e carga. A 
eletroforese envolve a passagem de uma 
corrente através de um gel contendo as 
moléculas de interesse. Em função de seu 
tamanho e carga, as moléculas vão se 
mover através do gel em diferentes 
direções ou em diferentes velocidades, o 
que permite que sejam separadas umas das 
outras. [De onde vem o nome 
"eletroforese"?] 
Todas as moléculas de DNA têm a mesma 
quantidade de carga por massa. Por essa 
razão, a eletroforese em gel de fragmentos 
de DNA faz a separação baseada apenas no 
tamanho. Através do uso da eletroforese, 
podemos ver quantos diferentes 
fragmentos de DNA estão presentes em 
uma amostra, e o quão grandes eles são em 
relação aos outros. Podemos também 
determinar o tamanho absoluto de um 
pedaço de DNA examinando-o ao lado de 
um DNA "padrão", composto de fragmentos 
de DNA de tamanhos conhecidos. [Mais 
informações] 
O que é um gel? 
É uma placa de material gelatinoso. Géis 
para separação de DNA são muitas vezes 
feitos de um polissacarídeo chamado 
agarose, que vem na forma de flocos secos 
em pó. Quando a agarose é aquecida em um 
tampão (água com alguns sais) e deixada 
para esfriar, forma um gel sólido 
ligeiramente mole. No nível molecular, o gel 
é uma matriz de moléculas de agarose que 
são mantidas unidas por ligações de 
hidrogênio e formam micro poros. 
 foto: gel agarose polimerizado 
Em uma extremidade, o gel tem cavidades 
semelhantes a bolsos chamadas poços, 
onde as amostras de DNA serão colocadas: 
 
Fonte: Khanacademy/Ciencianews/Embrapa 
2 Eletroforese em Gel 
 
 
Antes das amostras de DNA serem 
adicionadas, o gel deve ser colocado em 
uma caixa de gel. Uma extremidade da caixa 
é ligada a um eletrodo positivo, enquanto a 
outra extremidade é ligada a um eletrodo 
negativo. O corpo principal da caixa, onde o 
gel é colocado, é preenchido com uma 
solução tampão contendo sal que pode 
conduzir corrente. Embora você não seja 
capaz de ver na imagem acima (graças a 
minhas incríveis habilidades artísticas), o 
tampão preenche a caixa de gel até o nível 
em que ele mal chega a cobrir o gel. 
 
A extremidade do gel com os poços está 
voltada para o eletrodo negativo. A 
extremidade sem poços (para a qual os 
fragmentos de DNA vão migrar) está 
voltada para o eletrodo positivo. 
Como os fragmentos de DNA 
movem-se através do gel? 
Uma vez que o gel esteja na caixa, cada uma 
das amostras de DNA que queremos 
examinar (por exemplo, cada reação de PCR 
ou cada plasmídeo digerido por restrição) é 
cuidadosamente transferida para um dos 
poços. Um poço é reservado para uma 
escada de DNA, um padrão de referência 
que contém fragmentos de DNA de 
comprimentos conhecidos. As escadas de 
DNA comerciais vêm em diferentes 
intervalos de tamanho, então podemos 
escolher uma que tenha boa "cobertura" 
para a faixa de tamanho esperada de nossos 
fragmentos. 
A seguir, a caixa é ligada e a corrente 
começa a fluir através do gel. As moléculas 
de DNA têm carga negativa devido aos 
grupos fosfato em seus esqueletos de 
açúcar-fosfato, assim elas começam a se 
mover através da matriz de gel, para o polo 
positivo. Quando a energia é ligada e a 
corrente passa através do gel, diz-se que o 
gel está correndo. 
 
 
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3 Eletroforese em Gel 
 
As amostras de DNA são carregadas nos 
poços na extremidade do eletrodo negativo 
do gel. 
 
 
Qual fragmento de DNA vai ganhar a 
"corrida" para o polo positivo? Pedaços 
curtos de DNA vão viajar através dos poros 
da matriz de gel mais rapidamente que os 
mais longos. Após o gel ter corrido por 
algum tempo, os pedaços mais curtos de 
DNA vão estar mais próximos do polo 
positivo do gel, enquanto os mais longos 
vão permanecer próximos aos poços. 
Pedaços muitos curtos de DNA podem 
correr diretamente para a extremidade do 
gel se forem deixados por períodos 
suficientemente longos (algo de que me 
senti definitivamente culpado!). 
Visualização dos fragmentos de DNA 
Uma vez que os fragmentos tenham sido 
separados, podemos examinar o gel e ver 
quais tamanhos de faixas são encontrados. 
Quando um gel é pigmentado com um 
corante que se liga ao DNA e depois 
colocado sob luz UV, os fragmentos de DNA 
brilham, o que nos permite visualizar o DNA 
presente em diferentes locais ao longo da 
extensão do gel. 
 
 
Uma "linha" bem definida de DNA em um 
gel é chamada de banda. Cada banda 
contém um grande número de fragmentos 
de DNA do mesmo tamanho e todos os que 
viajaram, como um grupo, para a mesma 
posição. Um fragmento único de DNA (ou 
até mesmo um pequeno grupo de 
fragmentos de DNA) não seria visível por si 
só em um gel. 
Ao comparar as bandas em uma amostra à 
escada de DNA, podemos determinar os 
tamanhos aproximados. Por exemplo, a 
banda brilhante no gel acima tem, 
aproximadamente, o tamanho de 700 pares 
de bases (bp).