Enzimas: Proteínas Catalisadoras

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Enzimas
O que são enzimas? Quais são as suas
características?
São proteínas que catalisam reações no
nosso organismo sem sofrer alterações
durante esse processo. Com exceção de
um pequeno grupo de moléculas de RNA
com propriedades catalíticas, chamadas
de ribozimas, todas as enzimas são
proteínas.
Características:
● altamente eficientes;
● específicas pelo substrato;
● aceleram a velocidade das reações (105
a 107 vezes) sem ser consumidas ou
alteradas ao participar da catálise;
● diminuem a energia de ativação, não
alteram o equilíbrio químico das
reações;
● funcionam em solução aquosa em
condições suaves de temperatura e
pressão;
● agem em sequências organizadas;
● podem sofrer regulação da sua
atividade.
Ligação de um substrato no sítio ativo de
uma enzima
As enzimas são bem maiores que seu
substrato. Observa-se abaixo.
Há um local específico de ação da enzima
com o substrato chamado de sítio ativo.
Esse sítio ativo consiste em um sulco na
superfície da enzima complementar ao
formato do substrato.
Na figura anterior, alguns resíduos de
aminoácidos chave do sítio ativo estão
indicados em vermelho. O substrato se liga
e forma o complexo enzima-substrato, ES.
Após ocorrer a reação, o produto é
liberado e a enzima permanece inalterada.
E + S ⇌ ES ⇌ EP ⇌ E + P
Complexo enzima-substrato
A complementaridade geométrica e
eletrônica entre enzima e substrato
depende de interações não covalentes
(interações eletrostáticas, ligações de
hidrogênio, interações de van der Waals e
interações hidrofóbicas).
Resíduos de aminoácidos que
normalmente aparecem no sítio ativo de
enzimas
No sítio ativo das enzimas, normalmente
há resíduos de aminoácidos que podem
funcionar como doadores de prótons
(ácidos) ou receptores de prótons (bases).
Aminoácidos a uma distância do sítio
ativo são críticos
A estrutura tridimensional de uma enzima
é muito importante para sua atividade
catalítica, muitas vezes resíduos de
aminoácidos que estão distantes do sítio
ativo podem ser necessários para uma
conformação adequada do sítio ativo.
O sítio ativo de uma enzima é específico
para o substrato
Uma enzima pode diferenciar entre lig.
alfa e beta de estruturas de carboidratos,
podem diferenciar isômeros ópticos.
Nomenclatura e classificação das
enzimas
As enzimas são denominadas
acrescentando-se o sufixo -ASE ao nome
do substrato da enzima ou a uma
expressão que descreva sua ação
catalítica.
Ex: a urease é uma enzima que hidrolisa o
substrato uréia.
A união internacional de bioquímica e
biologia molecular classifica as enzimas
em 6 classes:
1. oxidorredutases: reações de
oxidação-redução.
2. transferases: transferência de grupos
funcionais.
3. hidrolases: reações de hidrólise.
4. liases: eliminação de grupos para
formar ligações duplas.
5. isomerases: isomerização.
6. ligases: formação de ligação acoplada
à hidrólise de ATP.
Fatores que afetam a velocidade da
reação enzimática:
1. concentração da enzima.
2. concentração do substrato.
3. pH do meio.
4. temperatura.
1. Efeito da concentração de enzima na
velocidade da reação enzimática
A velocidade da reação aumenta com o
aumento da concentração da enzima,
desde que seja oferecida uma
concentração elevada do substrato.
Esse gráfico mostra que a velocidade da
reação enzimática é diretamente
proporcional à concentração da enzima,
desde que o substrato não seja limitante
da reação.
2. Efeito da concentração do substrato
na velocidade da reação enzimática
A concentração de substrato necessária
para que a velocidade da reação seja a
metade da velocidade máxima.
A concentração do substrato influencia na
velocidade da reação.
Quando a [substrato] é baixa, a maior parte
da enzima vai estar livre, e nessa condição,
a velocidade da reação vai ser baixa,
porém, proporcional à [substrato].
A medida que [substrato] aumenta, a
velocidade da reação também aumenta, e
isso ocorre até que [substrato] não resulta
em nenhum aumento da velocidade da
reação, nesse ponto, a [substrato] é
saturante, pois a [substrato] vai ser muito
maior que a [enzima]. E aí, toda a enzima
vai estar na forma de complexo
enzima-substrato, nessa condição, a
velocidade máxima vai ser alcançada e no
gráfico teremos um platô.
A [substrato] necessária para que a
velocidade da reação seja metade da
velocidade máxima, se chama Km
(constante de Michaelis).
Equação de Michaelis-Menten
Como visto anteriormente, a curva que
expressa a relação entre a [substrato] e a
velocidade da reação enzimática é uma
curva hiperbólica que pode ser expressa
algericamente pela equação de
Michaelis-Menten.
Leonor Michaelis e Maud Menten
estudaram a cinética enzimática e esses
cientistas deduziram essa equação
partindo da hipótese de que a etapa
limitante da velocidade de reação
enzimática é a quebra do complexo ES em
produto e enzima livre.
O Km fornece uma ideia de afinidade da
enzima pelo substrato.
Km alto: baixa afinidade da enzima pelo
substrato.
Km baixo: alta afinidade da enzima pelo
substrato.
Gráfico duplo recíproco
Através de uma transformação
matemática, é possível converter a
equação de Michaelis-Menten na equação
de Lineweaver-Burk.
Repara-se que a representação gráfica do
inverso da Vinicial versus o inverso da
[substrato], nos fornece uma linha reta, e o
ponto onde essa linha reta intercepta a
ordenada é igual ao inverso da Vmáxima. E o
ponto de interseção na linha da abscissa é
igual ao inverso do Km negativo.
Esse gráfico permite a determinação mais
acurada do valor da Vmáxima e do Km.
3. Efeito do pH na velocidade da reação
enzimática
Destaca-se que cada enzima tem um pH
ótimo no qual a atividade é máxima. Que é
o pH no qual a sua atividade vai ser
máxima. A atividade decresce em pH
maior ou menor.
Nesse exemplo há duas enzimas com
perfil de atividade em função do pH bem
distinto.
Pepsina: enzima encontrada no estômago
e seu pH ótimo é em torno de 1,6
(lembrando que o pH do suco gástrico é
na faixa de 1-2).
Glicose-6-fosfatase: é uma enzima dos
hepatócitos e seu pH ótimo é em torno de
7,8 (próximo ao pH normal dos hepatócitos
que é cerca de 7,2).
Em resumo, o pH ótimo é geralmente
muito próximo ao pH do ambiente no qual
a enzima costuma ser encontrada.
4. Efeito da temperatura na velocidade
da reação enzimática
Curva em forma de sino, vai haver uma
temperatura ótima, que corresponde a
máxima velocidade da reação e acima da
temperatura ótima temos uma diminuição
progressiva da velocidade da reação
enzimática devido à desnaturação térmica.
Inibição enzimática
De que maneira uma enzima pode sofrer
inibição da sua atividade. Dois tipos:
1. reversível: competitiva e não
competitiva.
2. irreversível.
Inibição competitiva
Neste tipo de inibição, o inibidor compete
com o substrato pelo sítio ativo da enzima.
Esse inibidor sempre vai ter uma estrutura
química muito semelhante a estrutura
química do substrato, e ele vai formar um
complexo enzima-inibidor e não ocorrerá a
catálise. Enquanto o inibidor estiver ligado
ao sítio ativo da enzima ele impede que o
substrato se liga à enzima.
A ligação do inibidor não inativa a enzima e
quando o inibidor se dissocia, o substrato
pode ligar e reagir.
Uma característica desse tipo de é que a
inibição pode ser revertida pelo excesso
de substrato.
Inibição competitiva
No gráfico A, na presença do inibidor
competitivo (curva vermelha) existe um
aumento do Km aparente na presença do
inibidor. O mesmo pode ser observado no
gráfico B (gráfico duplo-recíproco).
No entanto, a velocidade máxima não é
alterada na presença do inibidor
competitivo. Na presença desse tipo de
inibidor maior [substrato] é necessária
para que se atinja uma determinada
velocidade e por isso o Km aparente
aumenta na presença do inibidor
competitivo.
Na inibição competitiva, o inibidor e o
substrato competem pela enzima, isto é,
não podem ligar ao mesmo tempo à
enzima. O inibidor aumenta o Km, mas
não altera a velocidade máxima. Na
presença deste tipo de inibidor, maior
concentração do substrato é necessária
para que se atinja uma determinada
velocidade, aumentando o Km aparente.
Exemplo de inibição competitiva:estatinas.
As estatinas são fármacos
hipocolesterolemiantes (diminuem níveis
plasmáticos de colesterol). Elas agem
inibindo competitivamente a enzima
HMGCoA redutase que controla a síntese
do colesterol. E agem dessa maneira pois
possuem uma estrutura química muito
semelhante ao substrato desta enzima.
Outros dois exemplos de inibição
competitiva:
A sulfanilamida tem uma estrutura química
muito semelhante ao ácido
paraminobenzóico (PABA) e por isso existe
uma inibição competitiva na síntese de
ácido fólico em microrganismos, atuam
como agentes antibacterianos, pois os
microrganismos necessitam de ácido fólico
para sua replicação.
Em humanos temos a possibilidade em
casos de leucemia de utilizar um
quimioterápico que é um metotrexato que
inibe competitivamente a enzima
responsável por converter ácido fólico em
ácido tetrahidrofólico, que é necessário
para a replicação celular. Dessa forma, não
produzindo ácido tetrahidrofólico, ou
produzindo menos, tem-se uma redução
na proliferação celular.
Inibição não competitiva
Na inibição não competitiva, o inibidor tem
estrutura química diferente do substrato e
por essa razão ele não modifica o valor do
Km. Ou seja, o inibidor reduz a Vmáx da
reação, mas não modifica o Km.
O complexo EIS (complexo
enzima-inibidor-substrato) gera produto
mas em uma velocidade desprezível.
Inibição enzimática irreversível
Nesse tipo de inibição ocorre uma ligação
covalente do inibidor em grupo funcional
essencial para a atividade da enzima, mas
também pode ocorrer uma associação
não covalente, porém estável do inibidor
com a enzima.
Exemplo: reação do inibidor
diisopropilfluorofosfato com a enzima
quimiotripsina (enzima proteolítica). Esse
inibidor modifica um determinado resíduo
de aminoácido muito importante para a
atividade da enzima (Ser195), inibindo a
enzima irreversivelmente.
Regulação enzimática
A regulação da atividade das enzimas
possibilita ajustes finos nas vias
metabólicas, que são necessários devido
às alterações das condições das células.
Existem dois mecanismos que são
imediatos:
○ disponibilidade de substrato:
quando tem pouco substrato ele vai limitar
a velocidade da reação.
○ inibição do produto: quando
tivermos muito produto, o excesso de
produto pode inibir a velocidade da reação
enzimática ou reduzir a afinidade da
enzima pelo substrato.
Existem ainda mais dois mecanismos
imediatos: controle alostérico e
modificação covalente.
Existe um mecanismo de regulação lento,
que consiste na síntese ou degradação da
enzima, que pode levar horas a dias.
Curva de saturação de uma enzima
alostérica pelo substrato
A curva de saturação de uma enzima
alostérica pelo substrato é diferente da
curva de saturação de uma enzima
clássica (enzima que segue a cinética de
Michaelis-Menten).
A enzima que segue a cinética de
Michaelis Menten apresenta uma curva
de saturação pelo substrato do tipo
hiperbólica, enquanto uma enzima
alostérica apresenta uma curva sigmóide.
Lembrando que a [substrato] que fornece
a metade da Vmáxima numa enzima clássica
(segue a sinética de Michaelis-Menten), é
chamado de Km, e no caso da enzima
alostérica, é chamado de Km aparente ou
K0,5.
Enzima alostérica: em geral, apresenta
muita subunidades, e apresenta além do
sítio ativo ela apresenta um sítio
alostérico, onde o modulador ou efetor
alostérico se liga (de forma reversível e
não covalente).
Regulação de uma enzima alostérica
Enzima alostérica com 2 sítios:
○ Em azul: sítio catalítico onde se liga o
substrato.
○ Em rosa: sítio regulatório onde se liga
o modulador ou o efetor alostérico.
No exemplo tem-se um modulador
alostérico positivo (ou estimulador
alostérico), o que significa que quando
esse modulador positivo se ligar de forma
não covalente ao sítio alostérico (sítio
regulatório) vamos ter uma mudança de
conformação da enzima, que vai ficar
mais ativa, formando o complexo ES ativo,
levando a uma maior atividade dessa
enzima.
Se tivéssemos um modulador alostérico
negativo teríamos um processo
semelhante, mas ao contrário. Ao invés da
enzima ficar mais ativa quando o
modulador alostérico interage no sítio
regulatório, a enzima ficaria menos ativa.
Regulação de uma enzima por
modificação covalente
Alguns exemplos de modificação
covalente, a mais comum é a fosforilação.
Outros exemplos:
1. Fosforilação
2. Adenilação
3. Acetilação
4. Miristoilação
5. Ubiquitinação
6. ADP-ribosilação
7. Metilação
Regulação de uma enzima por
fosforilação/desfosforilação
A fosforilação consiste na adição do grupo
fosforil em um ou mais resíduos dos
aminoácidos serina, treonina ou tirosina.
Esses três aminoácidos têm em comum o
fato de apresentarem hidroxila na cadeia
lateral e a fosforilação acontece sempre na
hidroxila.
A fosforilação ocorre por ação de uma
enzima chamada proteína cinase (PK -
violeta).
Essa enzima catalisa a transferência do
grupo fosforil terminal do ATP para a
proteína em questão. A proteína que vai
ficar fosforilada pode se tornar mais ativa
ou menos ativa, dependendo da enzima.
A desfosforilação sempre ocorre por ação
de uma enzima fosfatase (PP - verde). Essa
enzima hidrolisa o fosfato, liberando esse
fosfato (Pi) para o meio.
Exemplo de modificação covalente
Regulação da atividade da enzima
glicogênio fosforilase muscular por
fosforilação.
A enzima glicogênio fosforilase está
presente no fígado e no músculo e
catalisa uma reação fundamental para
degradação da molécula do glicogênio.
Nessa reação, ocorre a produção de
glicose-1-fosfato, que é usada para síntese
de ATP no caso da degradação do
glicogênio muscular.
A enzima glicogênio fosforilase,
fundamental para que ocorra a
degradação do glicogênio, pode existir em
duas formas:
● Enzima desfosforilada ou Fosforilase
b: pouco ativa (a esquerda): por ação de
uma proteína cinase, chamada de
fosforilase-cinase, ocorre a transferência
de dois grupos fosforil do ATP para a
fosforilase B, que se tornará fosforilada e
fica ativa, também chamada de fosforilase
a.
● Enzima fosforilada ou Fosforilase a:
ativa: A redução da atividade dessa enzima
ocorre pela remoção dos grupos fosfato
por ação de uma enzima chamada
fosfoproteína-fosfatase 1. E isso ocorre no
músculo em estado de repouso.
Exemplo de enzimas que sofrem
fosforilação e desfosforilação
Conforme visto anteriormente, a
fosforilação da enzima
glicogênio-fosforilase ativa essa enzima,
mas nem sempre a fosforilação promove o
aumento da atividade enzimática.
Observa-se na tabela que algumas
enzimas ao sofrerem fosforilação ficam
pouco ativas, como é o caso da
Acetil-CoA-carboxilase, Glicogênio-sintase,
Piruvato-desidrogenase,
HMG-Coa-redutase.