TouchDown PCR

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Discentes: Graziella Martins Guimarães e Kimberlyn Almada
Pelotas, 25 de maio de 2021
Touchdown PCR
1
7
5
3
2
6
Introdução
Componentes da reação
Etapas do touchdown PCR
Vantagens e desvantagens
8
Aplicações
Conclusão
Referências
4
Protocolo
Sumário
Introdução
Definição: é uma variação simples e rápida do PCR que
melhora a técnica do convencional.
3
Reduz as amplificações de alvos não específicos.
Possibilita maior especificidade, rendimento e sensibilidade.
Diferença entre PCR Convencional e Touchdown PCR.
∆T (ºC) 
Componentes da reação
taqDNA
polimerase e 
buffer
dNTPs (Nucleotídeos)
Primer
Íon bivalente
DNA molde
Solução
Tampão
A
GC
T
4
Protocolo touchdown PCR
5
Estágio Denaturação Anelamento Extensão Componentes
Denaturação inicial: 95ºC por 4’’ 10x taq buffer com Mg2+ 5μL 
10 mM dNTP mix 1μL 
10 uM forward primer 1 0.5μL 
10 uM reverse primer 1 0.5μL 
20ng/μL DNA molde 
2μL taqDNA polimerase 
0.5μL Água 37.5μL 
DMSO 2.5μL
Primeiro 
estágio
94ºC por 1’’ Sequência de 
ciclos de 75º até 
68º por 1’’cada (a 
cada ciclo diminui-
se 1ºC)
68ºC por 2’’
Repete-se o primeiro estágio por 10 vezes
Segundo 
estágio
94ºC por 30’ 55ºC por 30’ 72ºC por 1’’
Repete-se segundo estágio por 30 vezes
Extensão final: 75ºC por 5’’
Fim: 4°C
Adaptado de: McClean:Touchdown PCR
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Etapas do touchdown PCR
75ºC
1min
74ºC
1min
73ºC
1min
72ºC
1min
71ºC
1min
70ºC
1min
69ºC
1min
78ºC
1min
Te
m
pe
ra
tu
ra
Ciclos do TD PCR
4ºC
Extensão
Denaturação inicial Denaturação
Extensão
Extensão 
final
Anelamento
95ºC
4min
94ºC
1min
75ºC – 68ºC
1min
68ºC
2min
Denaturação
94ºC
30seg
Anelamento
55ºC
30seg
72ºC
1min
75ºC
5min
Fim
Primeiro estágio Segundo estágio
Etapas do touchdown PCR
7
Denaturação
95ºC 
8
Etapas do touchdown PCR
Denaturação
95ºC 
9
Etapas do touchdown PCR
Anelamento
75ºC 
5’ 3’
3’ 5’
Primer forward
Primer reverse
1
0
10
Etapas do touchdown PCR
Anelamento
75ºC 
5’ 3’
3’ 5’
11
Etapas do touchdown PCR
Anelamento
75ºC 
5’ 3’
3’ 5’
12
Etapas do touchdown PCR
Anelamento
75ºC 
5’ 3’
3’ 5’
Ciclos até 68ºC
13
Etapas do touchdown PCR
Anelamento no PCR convencional
Os primers podem se ligar também com áreas inespecíficas
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Etapas do touchdown PCR
Anelamento no TD PCR
Os primers não se ligam em áreas inespecíficas do DNA molde
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Etapas do touchdown PCR
Extensão
68ºC 
5’ 3’
3’ 5’
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Etapas do touchdown PCR
Extensão final
5’ 3’
3’ 5’
75ºC 
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Etapas do touchdown PCR
As mudanças de temperatura ocorrem por meio dos termocicladores.
Após a técnica de touchdown PCR, as amplificações são submetidas à eletroforese.
Vantagens e desvantagens
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O touchdown PCR reduz a capacidade de formação de primer-dímero dos primers;
Reduz as ligações não específicas e indesejadas do primer ao DNA molde;
É uma técnica simples e rápida;
Dispensa técnicas mais laboriosas e reconstrução de primers.
Necessita que o profissional esteja preparado, caso contrário pode gerar resultados 
inespecíficos. 
Aplicações
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Genotipagem
• Identificação de genótipos.
Detecção/Identificação de organismos
• Amplificação de um genoma específico.
Diagnóstico
• Testes laboratoriais para identificação de doenças.
Forense
• Quando há pouco material genético e/ou de baixa qualidade.
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Aplicações
Usando este método melhorado, a taxa positiva de sequências de flanqueamento amplificadas
dos mutantes ATMT atingiu 99%. Além disso a associação desses 2 tipos de PCR aceleraram
a possibilidade de análise da amostra em 2 dias.
PCR de supressão e TD
PCR foram utilizados para
melhorar a técnica de obter
as sequências de
flanqueamento.
O fragmento de PCR
obtido pela amplificação foi
utilizado diretamente para
o sequenciamento após a
purificação do gel.
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Aplicações
Macruropyxis fulva é o
terceiro patógeno da
ferrugem, junto com Puccinia
Macruropyxis fulva é um
patógeno da ferrugem
recém-descrito que causa a
ferrugem castanha da cana-
de-açúcar no sul da África.
Um ensaio de PCR touchdown específico para M. fulva foi desenvolvido para diferenciar de 
forma rápida e confiável essa nova ferrugem das outras duas ferrugens que infectam a cana-
de-açúcar.
melanocephala (ferrugem marrom) e Puccinia kuehnii (ferrugem alaranjada) que infectam esta planta.
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Aplicações
Objetivo: desenvolver um
multiplex touchdown PCR
(multiplex TD-PCR) para a
detecção rápida e simultânea
dos quatro principais
patógenos de origem
alimentar.
Os resultados mostraram que este protocolo pode eliminar a banda indesejada ou reduzir 
significativamente.
Conclusão
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Especificidade Rendimento Amplicons indesejados
O diferencial do TD PCR consiste na mudança gradativa da temperatura 
durante a fase de anelamento, o que promove:
Rendimento
Temperatura de anelamento
Especificidade
P
ar
âm
et
ro
Ciclos
Referências
24
BIOSEARCH TECHNOLOGIES. This year’s MVP (most valuable practice): Touchdown PCR. Disponível em: 
<http://blog.biosearchtech.com/TheBiosearchTechBlog/bid/34285/This-Year-s-MVP-Most-Valuable-Practice-Touchdown-PCR>. 
Acesso em: 25 may. 2021.
GAO, S. et al. A method for amplification of unknown flanking sequences based on touchdown PCR and suppression-PCR. Analytical
biochemistry, v. 509, p. 79–81, 2016.
LEVANO-GARCIA, J.; VERJOVSKI-ALMEIDA, S.; DA SILVA, A. C. R. Mapping transposon insertion sites by where one is a 
hybrid consensus- touchdown PCR and hybrid degenerate primers. Disponível em: 
<https://pdfs.semanticscholar.org/28dc/b7388f8274fb0e15d2b92a136ba0cf0f0f89.pdf?_ga=2.13941303.1270994799.1621877148-
1438565261.1620682719>. Acesso em: 25 may. 2021.
MARTIN, L. A.; RUTHERFORD, R. S.; MCFARLANE, S. A. Touchdown PCR assay for the rapid diagnosis of tawny rust caused by
Macruropyxis fulva on sugarcane. Australasian plant pathology: APP, v. 46, n. 1, p. 103–105, 2017.
McClean:Touchdown PCR. Disponível em: <https://openwetware.org/wiki/McClean:Touchdown_PCR>. Acesso em: 25 may. 2021.
Referências
25
MOEZI, P. et al. Multiplex touchdown PCR assay to enhance specificity and sensitivity for concurrent detection of four foodborne
pathogens in raw milk. Journal of applied microbiology, v. 127, n. 1, p. 262–273, 2019.
PCR methods - top ten strategies - US. [s.d.].
What is touchdown (TD)-PCR? Disponível em: <https://geneticeducation.co.in/what-is-touchdown-td-pcr/>. Acesso em: 25 may. 
2021.
Singh, Jagtar. (2014). a critical review on PCR, its types and applications. International Journal of Advanced research in biological
sciences. 1. 65-80.
graziellamartins2611@gmail.com
kim.almada119@gmail.com
Pelotas, 25 de maio de 2021
Obrigada