cultura de células animais

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Laura Ferrarini Campodonico — 3°B
RESUMO
Quando colocadas em cultura, as células de animais podem assumir diferentes
comportamentos em relação à sua capacidade proliferativa, podendo se obter crescimento
finito ou infinito.
O progresso alcançado na técnica de cultura de tecido foi em parte decorrente da
facilidade encontrada na utilização do embrião de galinha. No início do desenvolvimento da
cultura celular, entre 1950 e 1960, esse tecido foi utilizado em estudos sobre a otimização
dos meios de cultura, no metabolismo celular e na propagação de vírus. As células obtidas
dessa embrião se propagavam com facilidade, mas a partir de 25 passagens o crescimento
era reduzido progressivamente.
A primeira cultura celular estabelecida, com crescimento infinito, foi obtida de tecido de
camundongo e denominada linhagem L. Na época, alguns pesquisadores passaram a se
interessar por estudos relacionados à formação de tumores em animais de laboratório, e
diversos agentes indutores foram caracterizados. Motivado pelas descobertas, Wilton
Robinson Earle implantou uma linha de pesquisa sobre a nação de substâncias
cancerígenas em culturas de tecidos. Earle utilizou camundongos adultos (110 dias) da
cepa C3H, sensível à formação de sarcoma pelo tratamento com hidrocarbonetos. O tecido
subcutâneo era retirado da região lombar e colocado em frasco de Carrel contendo meio de
cultura constituído por plasma de galinha, soro de cavalo, extrato de embrião de galinha e
solução salina. Após 24 horas, era possível observar a migração de células do fundo do
frasco. Seguindo esse procedimento, Earle mostrou que o hidrocarboneto
20-metilcolantreno exercia atividade inibidora sobre o crescimento da cultura. Em seguida,
programou uma experiência para verificar o efeito do metilcolantreno em culturas tratadas
por longos períodos. Após 6 dias foi observada a redução do crescimento da cultura. As
alterações morfológicas foram evidenciadas a partir do 45° dia, depois da primeira
transferência de tecido para novos frascos de Carrel. As células foram então injetadas de
volta nos camundongos e verificou-se a formação de sarcoma.
As culturas foram subcultivadas 18 vezes durante 650 dias, nos quais as células
permaneceram em estado ativo de proliferação. Porém, ainda não se sabia se era possível
obter uma cultura de uma única célula, o que era considerado improvável na época. Na
experiência de clonagem foi utilizada a cepa L — a estratégia consistiu em retirar células da
monocamada formada no frasco de Carrel com uma micropipeta. As células eram aspiradas
para o interior de um tubo capilar que continha plasma de galinha. O tubo era quebrado na
base da micropipeta e, após vedação, era incubado a 37,5°C por 15 a 20h. Os capilares
eram examinados em microscópio e as células de bom aspecto eram selecionadas. Em
seguida, os capilares eram esterilizados e transferidos para uma placa de petri. Com uma
pinça, o capilar era quebrado onde havia uma única célula isolada. O crescimento era lento,
levou 28 dias para ser observada a migração das células da extremidade do capilar para o
fundo do frasco. A proliferação celular era estimulada quando o meio de cultura era
proveniente do líquido do sobrenadante de culturas antigas, contendo meio exaurido. Esse
meio foi denominado meio condicionado e Earle sugeriu que o estímulo poderia ser
resultante da ação de substâncias secretadas pelas próprias células. Esta técnica era muito
trabalhosa e de baixo rendimento, porém resultou pela primeira vez uma técnica de
clonagem de célula animal.
George Otto Gey foi o responsável pela obtenção e manutenção das células HeLa, a
primeira linhagem de células humanas mantidas in vitro. Em 1950, dois homens do
departamento de Ginecologia da Universidade John Hopkins solicitaram a Gey que tentasse
cultivar células do epitélio cervical. Essa tentativa foi ineficaz. Em 1951, o Departamento
recebeu uma paciente queixando-se de sangramento intermenstrual decorrente de,
suspeitava-se, um cancro sifilítico. Porém, como o exame microbiológico não acusou a
presença de espiroquetas, a paciente foi submetida a uma biópsia, que revelou a presença
de carcinoma. Uma amostra do tecido retirado foi encaminhado a George, que efetuou seu
procedimento para cultivar tecidos. A amostra foi fracionada em pequenos fragmentos
colocados em meio de cultura constituído de plasma de galinha, extrato de embrião bovino
e soro humano do cordão placentário, e distribuída em tubos de ensaio. As células foram
propagadas por um ano, caracterizando o estabelecimento da primeira linhagem de células
humanas in vitro.
Theodore Puck e Philip Marcus, da Universidade do Colorado, desenvolveram outro
método de clonagem, agora mais eficiente. Eles se basearam na observação de Eagle de
que a formação de uma colônia a partir de uma única célula depende do volume do meio de
cultura. Quanto menor o volume, maior a probabilidade de a célula entrar em divisão. Em
condições de baixa densidade populacional, vários componentes do metabolismo
intermediário são liberados para o meio de cultura. Admitindo que esses produtos
metabólicos poderiam ter uma vida média a 37°C e menos de 24h, Puck e Marcus
desenvolveram um método pelo qual eles pudessem ser produzidos de maneira contínua,
assegurando um suprimento adequado às células a serem clonadas. A experiência de
clonagem foi dividida em isolamento das células, preparação das células alimentadoras
(que produziam os componentes que eram liberados) e clonagem, a 37°C durante 8 a 10
dias. Durante esse período, as células se multiplicaram, formando colônias. Através de
sucessivas transferências de tubos para frascos maiores, uma população de 10^7 células
foi desenvolvida a partir de uma única.
Uma das primeiras aplicações das células HeLa foi na luta contra a poliomielite. Gey
mostrou que o vírus da poliomielite se multiplicava com facilidade nessa linhagem, que era
mais sensível do que células de macaco. Devido ao grande interesse, a National
Foundation for Infantile Paralysis criou um laboratório no Institute Tuskegee destinado à
produção dessas células em larga escala.
Em 1962, o ATCC iniciou um programa para formar um banco de células e enviou 18
linhagens de tumor humano para Stanley Gartler, que estava desenvolvendo um estudo
sobre o polimorfismo bioquímico e sua possível aplicação na caracterização de linhagens
celulares. Analisando as linhagens, Gartler verificou que todas possuíam a forma A da
G6PD e a forma 1 da PGM, duas enzimas encontradas em negros e caucasianos. Como
grande parte das amostras vinha de doadores caucasianos, Gartler concluiu que todas as
linhagens estavam contaminadas com as células HeLa e que a contaminação entre células
ocorria com frequência de modo acidental nos laboratórios. A comunidade científica foi à
loucura, já que as células HeLa estavam sendo utilizadas em diversos projetos, o que
significava que vários trabalhos haviam sido publicados com erros graves. Até hoje a
contaminação entre as linhagens é uma grave questão.
As células de roedores, principalmente de camundongos, se adaptam facilmente ao
crescimento in vitro. Em 1958, Theodore Puck estudou a manutenção em cultura de células
obtidas de diferentes animais. As células derivadas do ovário de hamster-chinês
apresentaram morfologia inalterada e manutenção do número diplóide dos cromossomos.
Essa linhagem é denominada CHO e é considerada normal e de crescimento infinito.
De modo geral, células de porco são utilizadas no tratamento de viroses de importância
econômica no comércio de carne suína.
Em 1961, Leonard Hayflick e Paul Moorhead resolveram estudar o comportamento de
células de tecidos humanos normais mantidas em cultura. O método utilizado consistiu em
preparar culturas primárias de tecido embrionário pela técnica de desagregação enzimática
com tripsina. Com exceção das células do coração, todas as demais linhagens (pulmão,
rim, pele, músculo, timo e tireoide) se desenvolveram com facilidade por pelo menos 5
meses. As células de pulmão atingiram a fase de declínio após11 meses. Com isso, os
cientistas mostraram que células humanas normais possuíam um potencial de proliferação
limitado e eram incapazes de estabelecer linhagens com crescimento infinito.
A obtenção de linhagens derivadas de tumores tem alcançado grande importância em
estudos básicos e na pesquisa de novos fármacos que interferem na divisão celular. O
tecido inicialmente é retirado por biópsia e levado ao laboratório para preparo da cultura
primária. Alguns tumores humanos são facilmente degradados por ação mecânica. No
preparo da cultura observam-se diversos tipos de células, e o maior problema para obter
uma cultura apenas de células tumorais está nos fibroblastos, que proliferam com maior
facilidade. A eliminação de células normais que contaminam a cultura é lenta e feita por
passagens. Observa-se que um tumor, ao ser colocado in vitro, reduz sua capacidade
proliferativa.
Os estudos com células-tronco também são promissores devido à possibilidade de
utilização no tratamento de doenças degenerativas. As primeiras experiências com o
isolamento e cultivo de células-tronco embrionárias foram realizadas em 1981. Desde 1975
já haviam sido identificadas células pluripotentes em embrião de camundongo, e, para
Martin Evans, as dificuldades de isolamento e manutenção se davam ao fato de que não se
sabia o estágio exato em que essas células poderiam se multiplicar em cultura sem
ingressar na fase de diferenciação. Essas células podem ser isoladas pelo método
imunocirúrgico, que, embora muito usado, tem a desvantagem da longa exposição ao meio
ácido, o que reduz a viabilidade celular.
A obtenção em larga escala de células-tronco embrionárias humanas tem encontrado
dificuldades não só pelo aspecto técnico, mas também por questões éticas e religiosas, que
têm estimulado o desenvolvimento de técnicas alternativas para a obtenção de
células-tronco pluripotentes.