Técnicas de Imunodiagnóstico

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03/06/2015 
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Reações Ag-Ac 
Testes Sorológicos / 
 
Técnicas de Imunodiagnóstico 
Prof. Helio José Montassier 
INTERAÇÕES 
ANTÍGENO-ANTICORPO 
Detecção, quantificação e 
caracterização de 
anticorpos (Acs) ou de 
antígenos (Ags) e seu uso 
como ferramenta para 
pesquisa e diagnóstico 
IMUNODIAGNÓSTICO: Diagnóstico laboratorial por 
meio de técnicas imunológicas 
SERVE PARA PROCURAR (DETECTAR / IDENTIFICAR / 
MENSURAR):- Anticorpos ou Antígenos no organismo 
vertebrado suspeito de estar infectado com um determinado 
agente infeccioso, usando-se técnicas sorológicas de 
Precipitação, Aglutinação, Fixação de complemento, 
Neutralização ou Imunoensaios com Acs ou Ags 
marcados que utilizam sinalizadores da interação Ag-Ac com 
conjugados ligantes, como Imunofluorescência, 
Radioimunoensaio, Imunoenzimáticos, Imunofluorimétricos e 
Quimioluminiscência . 
Interação Ag-Ac: Conceito Inicial 
 
É uma associação bimolecular semelhante à 
interação de enzimas com seus substratos ou de 
hormônios com seus receptores, com uma 
distinção bem evidente o Ac não provoca nenhuma 
alteração química irreversível na molécula de Ag, 
podendo, portanto, o produto formado (Ag-Ac) se 
dissociar nos seus 2 componentes; isto é, Ag e Ac 
livres /solução/suspensão. 
Ag + Ac AgAc (Imunecomplexos) 
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INTERAÇÕES Ag-Ac 
 
 
 Reações reversíveis. 
 
 Ligações não covalentes: 
-Pontes de hidrogênio 
-Interações hidrofóbicas 
-Interações de Van der Waals 
-Ligações iônicas 
RESPOSTA DE ANTICORPOS 
 Especificidade 
Habilidade do Ac distinguir seu imunógeno de outros Ag. 
 Quantidade 
N° de células B x taxa de síntese do Ac x persistência após sua produção. 
 Isotipo 
Determina a persistência (meia vida in vivo diferente). 
A composição determina a função dos Ac e os locais onde são encontrados. 
 Afinidade 
Força de ligação do Ag com o Ac, em um único sítio. Quanto maior a 
afinidade entre Ac e Ag, menos Ac será necessário. 
 Avidez: força total de ligação, nos dois sítios. 
 Reações Cruzadas: 
É a habilidade de uma população de moléculas de Acs reagirem com mais 
de um Ag 
Avidez x Afinidade Reatividade Cruzada entre Ag-Ac 
• É a habilidade de um Ac reagir através de seu 
parátopo com mais que um determinante antigênico. 
• É a habilidade de uma população de moléculas de 
Acs reagirem com mais de um Ag 
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MÉTODOS SOROLÓGICOS 
1) Reagentes não marcados 
• Reação de precipitação 
• Reação de aglutinação 
 
2) Reagentes marcados 
• RIA 
• ELISA 
• Imunofluorescência 
• Western Blotting 
• Testes Imunocromatográficos 
MÉTODOS 
 PRECIPITAÇÃO 
- Imunodifusão dupla 
- Imunodifusão radial 
- Imunoeletroforese 
 AGLUTINAÇÃO 
- Aglutinação direta e indireta 
- Inibição da aglutinação 
- Teste de Coombs 
 IMUNOENSAIOS 
- RIA 
- ELISA 
- Imunofluorescência e Citometria de Fluxo 
- Western Blotting 
- Testes Imunocromatográficos 
 
 
 
 
APLICAÇÕES 
 
- Pesquisa 
- Diagnóstico 
- Soroepidemiologia 
PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO 
 Precipitação: 
Formação de complexos Ag/Ac. 
 
 Aglutinação: 
É o agrupamento de partículas antigênicas após a 
interação com Acs específicos, usualmente por moléculas 
de Acs que se ligam a Ags na superfície de partículas 
adjacentes. 
 
 As reações de precipitação e de aglutinação decorrem, 
respectivamente da ligação entre o Ac e Ag solúveis ou 
particulados. 
 
REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO 
 Interação entre Acs [IgG(*) e IgM(-)] e Ags solúveis 
 Ac precisa ser bivalente ou c/ valência maior 
 Ag precisa ser bi ou polivalente 
 A reação pode ser afetada pelo n° de sítios de ligação 
que cada Ac possui para seu Ag VALÊNCIA 
 
PRECIPITADO 
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É importante levar-se em conta como ocorre a 
ligação Ag-Ac em diferentes concentrações 
dos mesmos. Observe abaixo: 
TÉCNICAS DE PRECIPITAÇÃO EM GEL 
IMUNODIFUSÃO 
IMUNODIFUSÃO DUPLA 
 As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se 
encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela 
formação de uma linha de precipitação: 
 Pode ser visualizada pós lavagem do gel , para remoção das 
proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com 
corante 
Radial & Double Immunodiffusion 
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 Permite a quantificação do 
antígeno ou do anticorpo. 
 O processo continua até ser 
atingida a zona de equivalência, 
com os complexos precipitando-
se em um anel (halo) em torno 
do orifício. 
IMUNODIFUSÃO RADIAL 
 Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são 
separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica. 
 As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de 
acordo com os seus PM e cargas elétricas. 
 Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se 
difunde. 
 Ag e Ac formam arcos de precipitação. 
IMUNOELETROFORESE 
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 Ac + Ag multivalente particulado 
 Título: maior diluição que ainda causa aglutinação 
(semi-quantitativo) 
 Pó-zona: excesso de Ac 
 Potencial Zeta: alguns Ag podem apresentar carga 
elétrica (repulsão) 
 Agregação visível de 
partículas = Eritrócitos, 
bactérias, fungos e látex 
 
REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO 
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2) Reagente (anticorpo anti A, B): 
AGLUTINAÇÃO DIRETA 
1) Amostra de sangue na placa teste: 
 Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO) 
Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação 
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3) Controle negativo: 
4) Mistura-se: 
AGLUTINAÇÃO DIRETA 
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5) Leitura do resultado: 
Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação 
visível (aglomeração dos eritrócitos na placa teste), como 
ilustrado acima. 
AGLUTINAÇÃO DIRETA 
 
Hemaglutinação 
p/ determinação 
de grupos 
sanguíneos A, 
B e O. 
TESTE DE COOMBS 
 Ac antiimunoglobulinas (Robert 
Coombs); 
 DHRN – mãe produz IgG anti-Rh; 
 Não aglutinam os eritrócitos; 
 Direto: Ac ligados aos 
eritrócitos fetais; 
 Indireto: Ac anti-Rh não 
aglutinantes no soro materno. 
 Permite detectar 
incompatibilidades Rh, prevenindo 
contra DHRN. 
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 Teste de aglutinação quantitativa 
 Título: recíproca da > diluição com resultado + 
 Efeito Prozona 
Aglutinação / Hemaglutinação 
 Definição – teste de aglutinação feito com um 
antígeno solúvel adsorvido a uma partícula (por ex. 
Cels./hemácias ou partículas de látex) 
Aplicações 
– Medida de anticorpos para antígenos solúveis 
(por ex. Ags sols. do Toxoplasma gondii) 
Aglutinação Passiva /Hemaglutinação 
(+) 
(-) 
AGLUTINAÇÃO INDIRETA (PASSIVA) 
Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a Doença de 
Chagas: 
• As hemácias são revestidas com Ag do T. cruzi (ligação 
covalente) e então distribuídas nos poços da placa. 
 
• O soro teste e os controles positivos e negativos, 
devidamente diluídos, são adicionados aos poços da 
referida placa. 
 
• Se houver Ac específico contra o Ag, as hemácias se 
aglutinam e formam uma camada no fundo do poço. 
Quando não existe Ac específico, as células formam um 
botão no fundo do poço. 
 Aglutinação Positiva 
 Negativa 
Ag solúveis associados a outras superfícies 
(Partículas de látex ou superfície de hemácias) 
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Exemplo: presença de hCG na urina (gravidez) 
INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO 
Resultado negativo: 
(ausência de hCG na 
urina). 
Ocorre aglutinação, 
pois os anticorpos 
anti-hCG não são 
bloqueados na 
incubação inicial, 
porque não havia o 
hormônio naurina. 
 Livres, podem 
aglutinar as partículas 
revestidas de hCG. 
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-As infecções bacterianas frequentemente induzem a 
produção de Acs séricos específicos para Ags de 
superfície das Bactérias. 
-A presença de tais Acs pode ser detectada pelas 
reações de aglutinação bacteriana. 
-Os títulos dos Acs séricos de um indivíduo suspeito 
é definido como a recíproca da maior diluição do 
soro que produz uma reação positiva de aglutinação. 
-O título aglutinante de um soro pode ser usado para 
o diagnóstico de infecções bacterianas. 
Aglutinação Bacteriana 
 
Aglutinação Bacteriana 
 
 Reagentes marcados (enzimas, 
fluorocromos, isótopos) 
 Tipos: 
- RIA 
- ELISA 
- IFA / CITOMETRIA DE FLUXO 
- WESTERN BLOTTING 
- Testes Imunocromatográficos 
 
IMUNOENSAIOS 
Princípio da técnica: 
 
 Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente) 
a uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por 
radiações UV, emite luz no espectro visível. 
 Assim, como a ligação Ag-Ac é específica, um anticorpo 
conjugado pode ser usado para detectar um determinado antígeno e 
vice-versa. 
 A reação é feita em lâminas de microscopia (um pouco mais finas 
que as comuns) e a observação tem lugar num microcópio com luz UV 
(microscópio de fluorescência). 
 Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – 
FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT). 
Tipos: direta, indireta ou saduíche. 
IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA) 
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REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA 
 
REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA 
IFA direta: 
Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, 
em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células 
tumorais. 
 
IFA indireta: 
Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença 
de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças auto-
imunes. 
 
É uma técnica onde se consegue alta sensibilidade (fluorescência é mais 
intensa) e especificidade. 
 
 
 
 
APLICAÇÃO DA IMUNOFLUORESCÊNCIA REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA 
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REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA 
 Vantagens: limiar de detecção; específica; reprodutível; 
simples execução; determinação de classes e subclasses de 
anticorpos 
 Desvantagens: microscópio de fluorescência; diminuição da 
fluorescência sob irradiação; subjetividade na leitura; 
ausência de automação 
 Ferramenta que detecta e quantifica células individuais marcadas 
por fluorocromos, passando em uma corrente através de um 
feixe de Laser. 
 Separa as células por fluorescência ativada. 
 Cada anticorpo pode ser marcado com um fluorocromo diferente. 
 É um teste qualitativo e quantitativo. 
 
APLICAÇÕES 
 Tipo de população/subpop. de linfócitos/ 
 leucócitos; 
 Quantidade, tamanho, granulosidade; 
 Isolamento de populações celulares; 
 Monitoramento Cels TCD4 / CD8 - HIV 
 
 
CITOMETRIA DE FLUXO 
 Identificação e separação de células baseadas na dispersão de luz e 
fluorescência sob feixe de laser 
 Estudo de populações de leucócitos  luz dispersa  tamanho e 
forma da célula 
 Identificação de populações e/ou subpopulações de linfócitos T e B 
 FACS (fluorescence-activated cell sorter)  separação de uma única 
célula 
Barrientos et al., 2000 
CITOMETRIA DE FLUXO / APLICAÇÕES: 
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CITOMETRIA DE FLUXO – Esquema de 
Funcionamento da Técnica 
CITOMETRIA DE FLUXO – PREPARO 
DA AMOSTRA 
CITOMETRIA DE FLUXO – PREPARO 
DA AMOSTRA 
CITOMETRIA DE FLUXO – RESULTADOS 
Gating strategy to define lymphocyte subsets. (i) Histogram (univariate) plot of CD3 expression; 
this one-dimensional graph corresponds to a typical bar chart and is called “histogram” in flow 
cytometry. (ii) Pseudocolor plot of CD3 versus CD4. This display gives a better view on the 
distribution of CD3 expression than the histogram, in particular for **CD3 low expressing cells; note 
both axes are logarithmic, unlike the linear axes of scatter plots in Figure 2. (iii) Cartoon detailing 
interpretation of quadrant gates of (ii). CD3+CD4+ cells are displayed in the top right quadrant (46.2% 
of lymphocytes). CD, cluster of differentiation. 
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IMUNOHISTOQUÍMICA / IMUNOCITOQUÍMICA 
 
 Detecção e localização de antígenos celulares/teciduais 
 Anticorpos conjugados com enzimas  conversão de substrato 
incolor em produto colorido (deposição pode ser observada 
diretamente ao microscópio óptico) 
 Enzimas mais utilizadas: Peroxidase; Fosfatase Alcalina, -
Galactosidase e Glicose Oxidase 
 Método direto  Acs primários conjugados (detecção de antígenos) 
 Método indireto  Acs secundários conjugados (detecção de 
antígenos ou anticorpos) 
 Desvantagens: atividade enzimática endógena, armazenamento 
inadequado dos conjugados 
TESTE DE IMUNOPEROXIDASE 
Como são detectados / mensurados os níveis 
de Anticorpos em Fluidos Biológicos? 
TÉCNICAS DE ELISA 
Ensaio Imunoadsorvente 
Ligado à Enzima - ELISA 
 
 O teste detecta, identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um 
dos dois conjugados com enzimas. 
 
 
 
 O produto final corado surge por ação da enzima que converte 
um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato 
alterado pela enzima induz mudança de cor de uma substância 
indicadora). 
 A quantidade de Ag ou Ac produto final corado, através 
de leitura em fotocolorímetro. 
 Principais tipos de ELISA: indireto, sanduíche, competição e 
captura. 
Fosfatase alcalina 
Peroxidase 
B-galactosidase 
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Para que o ELISA é usado:- 
 
 -Mensurar os níveis de Acs específicos contra um 
determinado Ag e/ou microrganismo. 
 -Detectar / Identificar vírus (Ags) 
 -Mensurar hormônios 
 -Mensurar marcadores de reações inflamatórias 
(citocinas, proteínas de fase aguda) 
TIPOS DE ELISA: Direto e Indireto 
PLACA 
UTILIZADA 
 ELISA Indireto 
 ELISA Direto ou Sanduíche 
? 
? 
COMPETITIVE ELISA – Ab Detection 
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COMPETITIVE ELISA – Ag Detection 
( - ) 
(+) 
TESTES DE ELISA 
 Aplicações do ELISA: 
 Testes de rotina em Laboratórios Clínicos e 
de Pesquisa 
 
 Vantagens: 
 Teste de alta sensibilidade 
 Permite quantificar Ag ou Ac das amostras 
 Seguros e de baixo custo 
RADIOIMUNOENSAIO - RIA 
 Marcações: 
 I125: emite raios gama 
 H3: raios beta 
 Reprodutibilidade, especificidade e sensibilidade (em torno de 10-12g) 
 Desvantagem a manipulação de isótopo radioativo. 
 Aplicações: 
Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios, 
 proteínas séricas, drogas, vitaminas e Ac. Pesquisa 
WESTERN BLOTTING 
 Eletroforese de 
proteínas. 
 Identifica 
antígenos ou 
anticorpos. 
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WESTERN BLOTTING WESTERN BLOTTING 
TESTE DE IMUNOCROMATOGRAFIA / 
IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA 
TESTE DE IMUNOCROMATOGRAFIA / 
IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA 
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