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Biologia Molecular e Celular Isabel Lima ENDOMEMBRANAS, p. I Está perdido? As anotações que eu fiz durante a aula estão em preto. Já as anotações feitas durante a leitura do Alberts estão em azul! Aproveite. Referências utilizadas: ALBERTS, B.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; et al. Biologia molecular da célula. Artmed, 2010. RESUMO DAS ORGANELAS ● Núcleo —> contém o genoma + DNA da mitocôndria/cloroplasto + sítio de síntese de DNA e RNA ● Citosol —> Sítio de síntese e degradação de proteínas + metabolismo intermediário da célula ● Ribossomos —> Não membranosa, síntese de proteínas integrais ou solúveis ● Retículo endoplasmático ○ Rugoso —> Ribossomos ligados ○ Liso —> Síntese lipídica + reserva de cálcio ● Golgi —> Pilhas de compartimentos discóides (cisternas de golgi). Recebe lipídeos e proteínas do RE e os transporta modificando-os ou não. ● Mitocôndrias/Cloroplastos —> Produzem ATP ● Lisossomos —> Degradação de organelas mortas, macromoléculas ou partículas endocitadas via enzimas digestivas ● Endossomos —> Vesículas que carregam o material endocitado para o lisossomo ● Peroxissomo —> Possui enzimas para reações oxidativas (Alberts, 641 e 642) A concentração ou variações nessas organelas depende da função da célula. Por exemplo, células do plasma que secretam anticorpos tem um RE rugoso bem Biologia Molecular e Celular Isabel Lima desenvolvido. Células do tecido adiposo, por sua vez, tem um RE liso bem grande. (Alberts, 643) NÚCLEO TEORIA DO SURGIMENTO DO ENVELOPE NUCLEAR E AS SUAS CONCLUSÕES 1. Uma arqueia anaeróbica ancestral perdeu a parede celular rígida ⇒ facilitando a transferência horizontal de genes 2. Aumento da fagocitose e da digestão de outros procariotos ⇒ Acelera o processo evolutivo 3. M.p. invagina-se para proteger o cromossomo ⇒ Surge a membrana dupla da carioteca 4. Evaginação da carioteca⇒ Retículo Endoplasmático a. Por isso que existe uma continuidade espacial entre eles dois 5. Novas invaginações da mp formando novas organelas com um lúmen topologicamente igual ao exterior da célula (644) 6. Bactéria aeróbia sendo tomada intacta para simbiose ⇒ mitocôndria / plastídio a. A diferença da mitocôndria e dos plastídeos que forma os cloroplastos é que eles possuem o próprio genoma. b. Semelhanças entre esse genoma com o genoma bacteriano sugere a teoria da endossimbiose de Lynn Margulis. c. Não fazem parte da troca de vesículas entre as organelas (644) Assim, o lúmen das organelas endomembranas são topologicamente equivalentes ao meio extracelular. Da mesma forma, o nucleoplasma e o citoplasma também são topologicamente equivalentes. Essas organelas estão Biologia Molecular e Celular Isabel Lima sempre se comunicando, seja por continuidade, que é o caso da carioteca e do RE, seja por transporte de vesículas. Ou seja, pode-se pensar que todas essas organelas são do mesmo compartimento topologicamente falando. (644, alberts) TRANSPORTE DE PROTEÍNAS ENTRE AS ENDOMEMBRANAS ● NÚCLEO —> CITOSOL ⇒ Comportas ○ Os poros nucleares são canais seletivos que auxiliam ou transporte ativo de macromoléculas ou a difusão facilitada de micromoléculas entre dois espaços topologicamente iguais (nucleoplasma —> citoplasma). (646, albertão) ● R.E. —> GOLGI ⇒ Vesículas ○ As vesículas são intermediárias de transporte envoltos por uma membrana transportando um soluto entre dois locais topologicamente iguais (RE —> golgi, por exemplo) ● CITOSOL —> CLOROPLASTO, MITOCÔNDRIA, PEROXISSOMO, NÚCLEO E R.E. ⇒ Transmembrana ○ Os translocadores de proteínas transmembrana são proteínas integrais que transportam outras proteínas para locais topologicamente diferentes (citosol —> RE, golgi, mitocôndria e etc) SEQUÊNCIAS-SINAL ● São específicas para cada destino ○ Podem ser uma organela ou fora do citosol ● As proteínas sem essa sequência ficarão no citosol ● Possuem de 15 à 60 aminoácidos ● Peptidases-sinal retiram essa sequência quando a proteína chega ao seu destino ● Um conjunto tridimensional de sequências podem formar uma região-sinal utilizado para importação nuclear ou transporte vesicular Biologia Molecular e Celular Isabel Lima ● Essas sequências são reconhecidas pelos receptores de endereçamento complementares que levam essa proteína-carga até o endereço específico. São busões, basicamente. ● Com a destruição momentânea da carioteca, há a união do citoplasma com o nucleoplasma, misturando as proteínas. Com a re construção do envelope, para o retorno das proteínas nucleares, há a sequência sinal que não é clivada após a importação nuclear; DÁ PRA FAZER UMA ORGANELA SEM OUTRA PRÉVIA? Não. Para a produção de um outro RE, precisa-se de um prévio. As células filhas herdam um conjunto completo de membranas especializadas, haja vista que as células não produzem essas endomembranas do zero em uma versão acelerada da evolução das endomembranas via invaginações. Ou seja, as informações necessárias para a construção das organelas não reside apenas no DNA. (648, alberts) TRANSPORTE CITOSOL —> NÚCLEO Existe uma continuidade entre as membranas do envelope nuclear, embora as membranas sejam diferentes. A interna contém proteínas com sítios de ligação para cromossomos e a lâmina nuclear (uma malha proteica que dá suporte estrutural para o envelope). Já a externa possui uma continuidade com o RE, haja vista que o ele é uma evaginação da carioteca. Isso causa também uma semelhança funcional, haja vista que ribossomos podem “grudar” a carioteca produzindo proteínas, tal qual o RE rugoso. As proteínas produzidas na membrana externa da carioteca são transportadas para o espaço perinuclear o qual é contínuo com o lúmen do RE. (649, alberts) O transporte é por intermédio do poro nuclear, sendo uma estrutura óctupla com as nucleoporinas na parte interna. Voltado para o citosol, há a presença de fibras citosólicas e voltado para o nucleoplasma há Biologia Molecular e Celular Isabel Lima a cesta nuclear. Para esse transporte, um sinal intacto é mais que importante, qualquer mutação nele afeta diretamente o transporte. O conjunto de poros nucleares forma o NPC, Complexo de Poros Nucleares. Esses complexos podem transportar até mil moléculas para ambas as direções ao mesmo tempo e não se sabe como esse canal regula o seu tráfego interno. (650, alberts) Como os poros nucleares possuem canais aquosos, moléculas polares ou carregadas passam com facilidade. Já as macromoléculas difundem-se em uma velocidade menor. A seletividade das proteínas que são importadas ou exportadas derivam dos sinais de localização nuclear presente na proteína a ser transportada. Esses sinais são reconhecidos pelas fibrilas do canal. (651, alberts) As importinas (ou receptores de importação celular) são proteínas que carregam as proteínas carga até o núcleo, é o uber do rolê. Algumas proteínas precisam de uma proteína adaptadora que se ligará a proteína carga e também a importina. Existem também as exportinas (ou receptores de exportação celular) que são as proteínas que carregam a carga do núcleo ao citosol. Tanto as importinas como as exportinas são codificadas de uma mesma família de genes dos receptores de transporte celular ou carioferinas. Existem as proteínas vaivém, que trafegam continuamente entre o citosol e o núcleo por terem muitos sinais de importação e exportação. As taxas relativas a importação/exportação determinam a sua localização (tipo o gato de schrodinger e a velocidade e a posição do elétron só que da biologia), se tem mais sinais de importação é provável que essa proteína esteja no núcleo. As células as controlam ligando e desligando os sinais. (654, albertão) RÃS, SAPOS E SEUS GRADIENTES AS VEZES O BULLYING Q EU SOFRI SE EXPLICA SABE……. A Ran é um interruptor molecular que pode existir em dois estados conformacionais: Ran-GDP ou Ran-GTP. (653, alberts) Biologia Molecular e Celular Isabel Lima Forma-se um gradiente de Ran-GDP no meio citosólico por conta da presença do Ran-GAP (Ran-GTPase activatingprotein) que hidrolisa o GTP (guanina + 3Pi) formando o GDP. Já no nucleoplasma forma-se uma concentração de Ran-GTP, isso ocorre por conta do Ran-GEF (fator de troca de guanina ou guanine exchange factor) que troca o GDP por um GTP novo. Ou seja, tenha em mente que: ● Citosol —> Muito Ran-GDP por conta da Ran-GAP (o casaco gap fica fora do corpo) ○ Não se liga a importinas ● Nucleoplasma —> Muito Ran-GTP por conta da Ran-GEF ○ Se liga a exportinas Também saiba que: ● Ran-GAP —> Hidrolisa GTP (gap capa o fosfato) ● Ran-GEF —> Troca GDP por um GTP novo Esse gradiente de Ran-GDP e Ran-GTP auxilia no transporte nuclear. A IMPORTAÇÃO NUCLEAR Há uma ligação da importina com a proteína, saindo do citosol. Chegando no nucleoplasma, a Ran-GEF trocou um GDP por um GTP formando a Ran-GTP que se ligará a importina, expulsando a proteína-carga no nucleoplasma. Esse compsoto Ran-GTP + importina seguirá o gradiente do GTP, levando-a para fora do nucleoplasma. Chegando no citoplasma, há a hidrólise do GTP via Ran-GAP, formando o Ran-GDP para assim re-iniciar o ciclo. Ou seja, a ordem é: 1. Ligação Importina + proteína carga 2. Passagem desse composto para o nucleoplasma (que não se liga com importinas) 3. Chegando no nucleoplasma a Ran-GRF troca o GDP por um GTP que se liga a importina 4. Libera a proteína carga no nucleoplasma Biologia Molecular e Celular Isabel Lima 5. Ligação Ran-GTP + importina 6. Fluxo desse composto para o citoplasma seguindo o gradiente de Ran-GTP 7. Ran-GAP hidrolisa Ran-GTP formando Ran-GDP de novo e liberando energia A EXPORTAÇÃO NUCLEAR Há a ligação entre o Ran-GTP, a importina e a proteína carga que serão transportadas para fora do núcleo. No citosol há a hidrólise do GTP via Ran-GAP, liberando a proteína carga no citosol. Assim, há o transporte da importina de volta para o nucleoplasma seguindo o gradiente de Ran-GDP (o Ran-GTP virou Ran-GDP que tem muito no citoplasma, como tem muito, ele corre). No nucleoplasma, esse Ran-GDP será fosforilado pela Ran-GRF formando novamente a Ran-GTP para outro transporte. Ou seja, a ordem é: 1. Ligação Ran-GTP + exportina + proteína carga 2. Composto vai para o citoplasma seguindo gradiente de Ran-GTP 3. Ran-GAP hidrolisa a GTP formando a Ran-GDP 4. Libera a proteína carga no citosol 5. Exportina passagem esse composto de volta para o nucleoplasma 6. Ran-GRF troca GDP por GTP formando a Ran-GTP de novo EXPORTAÇÃO DE RNAs snRNAs, miRNAs e tRNAs ligam-se à exportinas que usam do gradiente de Ran-GTPs. Já os mRNAs são exportados de maneira diferente. A primeira diferença é que ele passa como um grande conjunto, se ligando ao lado Nuclear do NPC, onde serão remodelados e transportados via hidrólise de ATP. (655, albertão) obs: zuco não falou disso na aula Biologia Molecular e Celular Isabel Lima PRA QUÊ QUE ISSO É ÚTIL CÉLULAS T A ligação da célula T com o antígeno libera Ca++ no citosol (o alerta citado na S02). Isso chama a calcineurina (proteína fosfatase) que se ligará a proteína NF-AT (que possui 3 fosfatos) hidrolisando-os e liberando 3Pis. A ligação da calcineurina a NF-AT esconde a sua face de exportação nuclear e expõe a face de importação que estava “escondida” atrás dos fosfatos. Assim, há a passagem desse composto para o nucleoplasma, ativando a transcrição gênica para a resposta imunológica. Quando a concentração de Ca++ volta para o repouso no citosol a calcineurina libera a NF-AT que será fosforilada por uma proteína-cinase ativa com o gasto de ATP. Essa fosforilação volta a esconder a face de sinalização para importação e expoe a face de exportação, passando esse composto para o citosol. Resumindo de um jeito engraçado porém triste pique columbine: 1. Ca++ no citosol chegou o serial killer na escola estadunidense, pânico, alarme, desespero 2. Calcineurina corre e se liga a NF-AT, liberando 3 Pi e expondo o sinal de importação 3. NF-AT + Calcineurina correm para o nucleoplasma pra se proteger do branco que tanto sofreu bullying 4. Ativa a transcrição gênica e chama a polícia 5. Quando o Ca++ vaza a calcineurina larga da NF-AT, expondo o sinal de exportação, 6. A NF-AT volta pra escola-citosol 7. Não façam bullying com os seus amiguinhos. É sério. A BIOSSÍNTESE DO COLESTEROL ● COLESTEROL ALTO Há a ligação do colesterol com a proteína SCAP que se conecta a SREBP (proteína de resposta ao esterol). Isso impede a produção de mais colesterol. Biologia Molecular e Celular Isabel Lima ● COLESTEROL BAIXO Sem o colesterol, a SCAP muda a sua conformidade e é empacotada junto com o SREBP em vesículas de transporte para o RE e depois para o Golgi. As proteases do Golgi atuam na SREBP liberando um fator transcricional importante para a síntese de colesterol na sua membrana. O domínio citosólico se movimenta para o núcleo, onde se liga ao promotor de genes que codificam proteínas envolvidas na biossíntese do colesterol e ativam a sua transcrição. Desse modo, mais colesterol é produzido. (656, albertão) OBS: As pessoas com colesterol alto Nesse caso, o colesterol é alto no soro (colesterol sérico) e não na célula. Algumas pessoas com variações genéticas possuem uma mutação nas proteínas de membrana para translocação de colesterol para o lado citosólico, bloqueando-as. Assim, mesmo que no sangue haja muito colesterol, a célula ainda acredita que o colesterol está baixo, produzindo mais com a quebra do SREBP. SUMIÇO DA CARIOTECA DURANTE A PRÓFASE A lâmina nuclear (rede bidimensional de proteínas filamentosas intermediárias) da forma e estabilidade ao envelope nuclear, ancorando-se a ela por ligações a NPCs e transmembranas e também se relacionando com a cromatina. (656, albertão) Proteínas quinases (cdk) fosforila uma das lâminas da carioteca fazendo com que as fibras que fazem o envelope percam a conexão. Assim, ficam filamentos de carioteca fosforiladas soltas durante a prófase, aparecendo o cromossomo metafásico. As proteínas da membrana, não mais ligadas a lâmina, difundem-se para o lúmen do RE. A proteína motora dineína, por exemplo, participa ativamente da quebra do envelope nuclear. Para a reconstrução do envelope, primeiro precisa-se marcar a localização da cromatina no citosol. Já que a Ran-GEF continua agregada à cromatina durante a mitose, cria-se uma nuvem de Ran-GTP ao redor da cromatina, localizando-a. Assim, proteínas dos NPCs livres e as proteínas da carioteca anexam-se ao cromossomo. Assim, os NPCs ativam a reimportação de proteínas núcleo plasmáticas e há a reprodução da carioteca. (657, albertão) Biologia Molecular e Celular Isabel Lima Na telófase, há a presença de uma fosfatase que hidrolisa esses filamentos fosforilados, desfosforilado-os e permitindo a sua reconexão formando novamente uma das lâminas da carioteca. RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO RESUMO SOBRE O RETÍCULO O RE é um labirinto de túbulos ramificados e de vesículas achatadas que se estendem através do citosol conectando-se, onde o seu espaço luminal ou espaço cisternal ocupa mais de 10% do volume celular. As membranas do RE são contíguas com a membrana celular e ainda com a carioteca, ligando do centro a periferia com o seu sistema de produção e transporte. Para atender à algumas necessidades especiais da célula, o RE pode se especializar, como por exemplo: ● Para “agilizar” a produção de proteínas, por exemplo, o RE aderiu ribossomos à sua superfície, passando a transloca-los enquanto eles eram traduzidos (importação cotraducional), surgiu assim a skin RE Rugoso. ● As partes sem ribossomos são chamadas de RE liso que participa do ○ Metabolismo de lipídios, acomodando enzimas que fazem o colesterol e o modifica a fim de formar os hormônios esteróides ○ Do processo de detoxificação da célula,guardando enzimas, como o citocromo P450, que catalisam reações de quebra de toxinas ○ Do sequestro de Ca++ do citosol, recaptando-o após a expressão do sinal ■ Função muito importante nas células musculares em que o RE liso usa a skin de retículosarcoplasmático, em que essa função de armazenar cálcio sofre um upgrade. ● As áreas do RE liso que “cospem” vesículas de transporte são chamadas e RE transicional. Biologia Molecular e Celular Isabel Lima TRANSPORTE DE PROTEÍNAS PARA O LÚMEN DO RE Existem duas maneiras pelas quais as proteínas podem ser endereçadas ao retículo: ● TRANSLOCAÇÃO COTRADUCIONAL ○ Mais comum eu eucariotos ○ Significa que o transporte está acontecendo ainda durante a tradução da proteína, onde o ribossomo está aderido ao retículo ● TRANSLOCAÇÃO PÓS-TRADUCIONAL ○ Mais comum em leveduras ○ O transporte ocorre depois da tradução feita em ribossomo livre A HIPÓTESE DO SINAL O EXPERIMENTO QUE COMPROVA Houve o isolamento de microssomos rugosos e lisos do RE em um tubo com gradiente de sacarose que sofrerá centrifugação em 1970. Os microssomos lisos têm baixa densidade e param de sedimentar, flutuando em baixas concentrações de sacarose (mais para cima do tubo). Já os microssomos rugosos têm alta densidade e param de sedimentar flutuando em altas concentrações de sacarose (mais para o final do tubo). Os microssomos rugosos possuem todas as proteínas do lúmen do Biologia Molecular e Celular Isabel Lima RE rugoso, inclusive a peptidase de sinal, que é responsável por clivar sequências-sinal de endereçamento ao RE. No experimento chave, houve a comparação entre uma proteína traduzida a partir de um mRNA em um ribossomo livre e em um microssomo derivado do RE rugoso. Constatou-se que a proteína derivada do rb livre era maior que a do microssomo, enquanto que a decodificada no microssomo tinha o tamanho correto. Esses aminoácidos “extras” são justamente a sequência sinal. (672, albertão) A UTILIDADE DA SEQUÊNCIA SINAL O RE importa 2 tipos de proteínas do citosol: as transmembrana (que são parcialmente translocadas, então fica um ou dois bracinhos pra fora presos na bicamada do RE) ou as solúveis em água (que é completamente translocada). Ambas as proteínas são endereçadas para o RE pela sequência sinal. (672, albertão). Ou seja, essa sequência de aminoácidos é como um GPS para a proteína. Ela também auxilia na abertura do canal de translocação, servindo como chave. Existe ainda a partícula de reconhecimento de sinal, o SRP, sendo uma estrutura proteica do tipo haste. Uma parte da SRP se liga a sequência sinal à medida que a cadeia polipeptídica emerge do ribossomo, já a outra se liga na interface entre as subunidades ribossomais, pausando a tradução. Biologia Molecular e Celular Isabel Lima A IMPORTAÇÃO COTRADUCIONAL DE PROTEÍNAS PARA O RE 1. Ligação do SRP (partícula de reconhecimento de sinal) à sequência sinal, “abraçando” um ribossomo a. Aqui, o SRP pausa a tradução momentaneamente. Essa pausa é útil para dar tempo do rb se ligar à membrana do RE antes que a tradução seja completada. Sobretudo, essa pausa evita uma enovelação das proteínas grandes. (674, albertão) 2. Ligação do SRP ao receptor de SRP a. O receptor de SRP é uma proteína transmembrana do RE 3. Ligação do Ribossomo ao canal de translocação Sec61 a. A abertura do canal de translocação se dá pela sua ligação com a sequência sinal, que o mantém aberto até o fim da tradução e da translocação. 4. Retorna a tradução junto com a translocação (translocação cotraducional) 5. Liberação do SRP, que será reutilizado em outro ciclo 6. Liberação da proteína no lúmen do RE Biologia Molecular e Celular Isabel Lima OS TRÊS TIPOS DE TRANSLOCAÇÃO ● TRANSLOCAÇÃO COTRADUCIONAL EM SEC61 ○ O rb é conduzido pela SRP se ligando a Sec61 (canal de translocação). Ligada a ela, o rb traduz a sua proteína que passará pelo único canal que resta: por dentro da translocadora ○ O canal, quando inerte, é bloqueado por uma alfa hélice, evitando a passagem de íons ○ Esse canal possui uma fenda lateral, permitindo o deslocamento da proteína translocada para a bicamada. (676) ○ O seu conjunto com componentes acessórios é chamado de translócon (677, albertão) ○ Não é necessário energia adicional ○ Ocorre em bactérias, arqueas e eucariotos ● TRANSLOCAÇÃO PÓS TRADUCIONAL EM EUCARIOTOS ○ Necessita de um complexo adicional (Sec62, 63, 71, 72) ligada ao Sec61, que adiciona moléculas BiP (chaperona do tipo hsp70 chamada BInding Protein) na cadeia translocadora. ○ A hidrólise do ATP cria um ciclo de ligações das proteína BiP, que puxa a proteína para o lúmen do RE. ○ As BiP evitam também o enovelamento das proteínas no citosol (677) ○ Necessita de uma energia adicional Biologia Molecular e Celular Isabel Lima ● TRANSLOCAÇÃO PÓS TRADUCIONAL EM BACTÉRIAS ○ Aqui, o transporte é feito do citosol para o espaço extracelular ○ Há a ligação do SecY a uma ATPase SecA que funciona tipo um pistão. ○ Com a hidrólise do ATP, o pistão (uma parte da SecA) desce e empurra uma parte da proteína para fora. ○ Necessita de uma energia adicional OBS: BiP, chaperona hsp70 A BiP, além de participar na translocação pós traducional, ela percebe proteínas enoveladas incorretamente se ligando a cadeia mal-criada que não deveria estar exposta se tivesse sido bem empacotada. A hidrólise do ATP cria um ciclo dinâmico de alta e baixa afinidade de ligação com as proteínas. (683, albertão) FORMAÇÃO DAS PROTEÍNAS TRANSMEMBRANAS (com dois bracinhos) TRANSMEMBRANA DE PASSAGEM ÚNICA A sequência sinal é lida duas vezes: uma no citosol, pela SRP, e outra no canal de translocação, assumindo a função de sequência sinal de início de transferência, responsável por abrir o poro. Essa sequência se liga não só ao canal, mas também ao centro hidrofóbico da bicamada. (678, albertão) Biologia Molecular e Celular Isabel Lima No meio da proteína, há ainda a sequência de parada de transferência no que, quando lida pelo canal de translocação, ativa a peptidase de sinal, responsável pela clivagem da sequência sinal de início de transferência, inserindo-o na bicamada. Posteriormente, esse sinal será degradado. A sequência de parada fica como uma âncora, que assumirá a forma de alfa hélice ou beta pregueada. Assim, fica um braço da proteína para o citosol e um outro braço voltado para o lúmen do RE, ambos ligados pela sequência de parada. As transmembranas de passagem única passam de 3 maneiras: (679, albertão) ● Sequência sinal N-terminal: a sequência fica na ponta do N terminal. ○ Sempre o N-terminal fica voltado para o lúmen do RE ● Sequência sinal interno: a sequência fica no meio da proteína ○ C terminal (N —> C): Quando a Amina (NH2) fica para o citosol o carboxi (COOH) fica para o lúmen do RE ■ Isso ocorre quando a tradução se inicia na amina e termina no carboxi ○ N terminal (C —> N): Quando o carboxi fica para o citosol e a amina para o lúmen do RE ■ Isso ocorre quando a tradução se inicia no carboxi e termina na amina ○ A importância dessa orientação se dá na membrana plasmática. Biologia Molecular e Celular Isabel Lima COMBINAÇÕES INTERCALADAS DE SINAIS DE INÍCIO E SINAIS DE PAUSA E OS CANAIS MULTIPASSO Para canais multipassos, quando há essa parada da translocação, deixando um braço para fora e outro para dentro, um desses braços se liga ao próximo canal e reinicia a translocação com um sinal de início. É um movimento semelhante a costura, ou seja, essa proteína vai “costurando” a membrana”. Proteínas que passam por canais multipassos tem que ter sequências de início e parada intercaladas. Ou seja, a sequência de início permite a passagem, a de parada pausa e deixa a linha solta que se re conectará com a membrana com outra sequência de início. Nesse caso, a sequência de parada não induz a clivagem da sequência de início. Sequências-sinal de início e de parada agem para corrigir a topologia da proteína na membrana, trancando-as como alfa hélices. Sobretudo, sabe-se que uma sequência sinal atuará como a de início ou de parada a depender da sua posição na cadeia, uma vez que a função pode ser trocada via DNA recombinante. O SRP inicia a leitura procurando por sinais hidrofóbicos na N-terminal indoem direção a C-terminal. Reconhecendo-o, há o início da translocação e assim o próximo sinal será obrigatoriamente de parada e assim por diante. Esse mecanismo cria uma assimetria na membrana, expondo domínios diferentes para cada lado da membrana. Essa assimetria é mantida em brotamentos. FORMAÇÃO DE PROTEÍNAS ANCORADAS PELA CAUDA (com um bracinho) 1. Há a ligação da sequência sinal da proteína com um complexo de pré-endereçamento 2. Esse complexo se liga a ATPase Get3 Biologia Molecular e Celular Isabel Lima 3. A ATPase Get3 se liga aos seus amigos os backyardigans Get2 e Get1 4. Com a hidrólise do ATP, há a inserção da proteína na bicamada, usando da sequência sinal como âncora, deixando um bracinho só pra fora Essas proteínas ancoradas por caudas possuem subunidades SNARE, que regulam o tráfego vesicular, função importantíssima para o RE transicional. Nessa situação, a inserção é pós traducional! Aqui não há cotradução. FORMAÇÃO DAS PROTEÍNAS GLICOSILADAS (bracinho doce) 1. Formação de um oligossacarídeo precursor à um lipídio (dolicol) ancorado na membrana luminal do RE —> oligossacarídeo precursor pré-formado composto de N-acetilglicosamina, manose e glicose. (683, albertão) 2. Esse oligossacarídeo se liga a Oligossacaril transferase 3. A oligossacaril transferase liga o oligossacarídeo à uma proteína, especificamente por um resíduo de asparagina ou ligados a N 4. Essa oligoproteína continua no lúmen da vesícula e do golgi, passando para a bicamada externa da membrana. a. No golgi, esse oligossacarídeo será modificado, criando toda a diversidade das proteínas glicosiladas As glicoproteínas ligadas a N são as mais comuns, em especial para que ocorra o enovelamento adequado no N. (685, albertão) ENOVELAMENTO DE PROTEÍNAS (bracinho cacheado kaka) O enovelamento de proteínas é a formação de estruturas proteicas secundárias ou terciárias e pode ocorrer dentro do RE rugoso quando essa proteína possui o sinal de retenção no RE, tornando-se uma proteína residente no RE. Um exemplo de uma proteína residente no RE é a proteína dissulfeto isomerase, que catalisa a oxidação de grupos sulfidrila (SH) livres na cisteínas para formar as ligações dissulfeto. (682, albertão) A proteína não-enovelada possui um oligossacarídeo precursor ligado a N que será recortado pela glicosidase até possuir uma única molécula de glicose. Biologia Molecular e Celular Isabel Lima Essa única hexose será reconhecida pela calnexina ou calreticulina (duas chaperonas de ligação de carboidratos) Essa calnexina irá verificar a enovelação da proteína 1. Se ela estiver bem enovelada, a calnexina irá retirar esse resíduo de glicose e exportará a proteína. 2. Caso a proteína não esteja completamente enovelada, a calnexina leva essa proteína até a uma glicosil transferase, que irá adicionar outra glicose à proteína, reinserindo-a no ciclo. As repetidas passagem nos ciclos da calnexina ou da calreticulina vai enovelando a proteína. Isso tudo acontece no lúmen do RE. (685, albertão) E AS PROTEÍNAS QUE NÃO CONSEGUEM SE ENOVELAR? As proteínas rebeldes que não conseguem se enovelar após repetir o ciclo da calnexina são marcadas para a exportação. Há a ligação de chaperonas na proteína mal enovelada, a ligação de Lectinas ao seu oligossacarídeo precursor e também a degradação das ligações S-S via dissulfeto isomerase. Essa proteína será encaminhada para um canal translocador que fará a retro translocação dela para o citosol. No citosol, essa proteína será marcada pela ubiquitina via a E3 ubiquitina ligase. Essa cadeia poliubiquitina chama o proteassomo que irá quebrar essa proteína afuncional. FORMAÇÃO DO GPI A scramblase mistura os fosfolipídios no RE, permitindo com que haja fosfatidilinositol na bicamada interna (distribuição essa impossível na membrana plasmática). Ligado a esse fosfatidil, há 3 manoses e uma fosfoetanolamina com N terminal.. Nessa bicamada há a presença de um peptídeo C terminal que é clivado, deixando uma parte dela no lúmen do RE. Essa parte solta com final carboxi será colada ao grupo amino da fosfoetanolamina formando uma ligação peptídica que resultará na âncora de GPI. (689, big beto) Biologia Molecular e Celular Isabel Lima SÍNTESE DOS FOSFOLIPÍDIOS 1. Ácido graxo chega ao RE transportada por uma proteína 2. Inserção do ácido graxo na bicamada externa do RE 3. CoenzimaA liga-se a um ácido graxo e expulsando uma hidroxila, reação de substituição essa catalisada pela Acil-Coa-ligase 4. O glicerol 3-fosfato se liga a 2 ácidos graxos com terminais Coa formando o ácido fosfatídico 5. A fosfatase tira o fosfato do ácido, formando o diacilglicerol que é instável e se liga ao radical do fosfolipídio na sua versão CDP (cdp-colina, cdp-etanolamina, cdp-inositol e cdp-serina) RESUMÃO: Ácido graxo —> ácido graxo + CoA —> 2 AG + Glicerol-Pi (Ácido fosfatídico) —> Diacilglicerol —> Fosfatidilinositol, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina e fosfatidilcolina. Como a maioria dos fosfolipídios é formado no folheto citosólico do RE, precisa-se mistura-los de maneira rápida (o flip flop demora muito). Assim, entra em ação a scramblase que, de maneira não seletiva, embaralha os fosfolipídios. Na membrana plasmática/golgi (albertinho) a flipase irá reorganizar os fosfolip de maneira seletiva, seguindo a assimetria já estabelecida previamente. (690, albertão) O DIFERENTÃO: ESFINGOLIPÍDIO No RE há a formação da ceramida, quando ligada a fosforilcolina, será convertida em esfingomielina que formará o esfingolipídio. Caso a ceramida seja exportada virgem para o golgi, ela será matéria prima para glicolipídios. LIGAÇÕES DE DISSULFETO No lúmen do RE há a formação de ligações de dissulfeto por ser um ambiente oxidante, permitindo a formação de cadeias proteicas tridimensionais. Quando essas proteínas forem transportadas para a membrana, elas irão passar para a membrana externa, mantendo as ligações de dissulfeto. Biologia Molecular e Celular Isabel Lima Já no citosol, por ser um ambiente redutor (tem maior disponibilidade de H+), há a formação de SH, impedindo esse tipo de ligação entre as proteínas.
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