Replicação do DNA e Exame de PCR

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Replicação do DNA e Exame de PCR
 Luana Rocha Vale - Medicina - UNIFACS
 Processos Celulares e Moleculares - Biologia Celular
 O QUE É A REPLICAÇÃO DO DNA?
A replicação do DNA é o processo de 
duplicação da molécula de DNA. 
→ É um fenômeno genético que assegura a 
autoduplicação das informações contidas nos 
cromossomos, especificamente nos genes.
→ Ocorre no núcleo da célula, antes da divisão 
celular, durante a Fase "S", ou interfase.
→ É um processo que envolve diversas enzimas e 
inicia-se com a separação das duas fitas que 
formam a molécula de DNA. 
→ Após a separação das fitas antigas, ocorre a 
ligação dos nucleotídeos livres no núcleo a um 
nucleotídeo correspondente em uma das fitas e a 
sintetização de uma nova fita a partir da antiga. 
→ Formam-se duas moléculas de DNA, constituídas por uma fita antiga (pertencente à 
molécula original) e uma fita nova. Por esse motivo, o processo é 
considerado semiconservativo.→ É devido a essa característica que é possível estabelecer 
vínculos genéticos entre os indivíduos.
→ É também um processo bidirecional, pelo fato de as fitas serem antiparalelas e a enzima 
trabalhar apenas em um sentido: de 5' para 3'.
 QUAL A IMPORTÂNCIA DA REPLICAÇÃO DO DNA?
→ É importante e necessária para a manutenção orgânica do indivíduo, permitindo o 
desenvolvimento do organismo (crescimento), a reposição de tecidos lesionados (epitelial) 
ou regeneração quando possível, bem como a propagação hereditária das características, 
propiciando a formação de gametas contendo as informações fidedignas da espécie.
→ Por meio da replicação podemos entender como nós, seres humanos, fomos formados a 
partir de sucessivas divisões de uma célula, fruto da fecundação (célula ovo ou zigoto), 
passando por intensa multiplicação até resultar em um organismo tão complexo.
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 EXISTE UM LOCAL ESPECÍFICO DE INÍCIO DA REPLICAÇÃO NA MOLÉCULA DE DNA?
No DNA humano, existem locais conhecidos 
como origens de replicação.
Esses pontos existem para acelerar o 
processo - já que a fita de DNA é muito 
comprida - até que uma origem se encontre 
com outra e forme uma fita única.
As origens de replicação são ricas em duas 
bases nitrogenadas específicas: a Adenina 
e a Timina, mais especificamente porque, 
entre elas há apenas 2 pontes de 
hidrogênio (diferente de Citosina e Guanina, 
que possuem 3 pontes) e, por isso, fica 
mais fácil de separar a molécula/quebrar as 
pontes de hidrogênio para fazer a 
replicação. → 
As setas rosas, na imagem abaixo, apontam 
para regiões onde ainda não houve 
replicação, isso forma bifurcações, 
chamadas de forquilhas de replicação ou 
replicons. 
 ABERTURA DA FITA DUPLA
A enzima DNA Helicase promove a quebra das pontes 
de hidrogênio para que haja a abertura da dupla fita e 
ocorra a transcrição.
→ Ela atua desenrolando e relaxando a molécula de 
DNA.
Contudo, a fita de DNA é muito "enovelada" e a enzima DNA Helicase precisa 
de ajuda para abrir a fita para não embaraçar. É aí que entra a DNA Girase:
A enzima DNA Girase (que é uma 
Topoisomerase) faz giros na molécula e 
A Origem única de replicação no DNA de bactéria. 
B Vários pontos de origem de replicação no DNA 
humano.
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também vai promover pequenos cortes e 
colagens para que a tensão seja diminuída e 
a fita seja desenrolada, a medida que a DNA 
Helicase vai quebrando as pontes de 
hidrogênio.
As fitas do DNA tem atração uma pela outra, já que em uma ponta vai ter Adenina e em outra 
Timina, ou Guanina e Citosina, o que faz que elas tenham uma tendência a se juntar. Porém, 
no momento da replicação elas precisam ficar separadas e, para isso, existe um grupo de 
proteínas nomeadas de Proteínas ligadoras de fita simples, que se ligam as fitas simples e 
evitam que elas se reconectem.
A partir daí, vem a protagonista do processo de replicação que é a DNA Polimerase.
 SÍNTESE DA FITA SIMPLES
💡 Antes de falar sobre ela, precisamos saber que o 
DNA é um polímero e todo polímero é composto por 
monômeros; no caso do DNA, seus monômeros são 
os nucleotídeos, compostos por um fosfato, uma 
pentose e uma base nitrogenada. 
A DNA Polimerase sintetiza a fita de DNA 
complementar e faz a união entre os 
nucleotídeos de cada fita. 
→ Para isso, ela catalisa uma reação de 
ligação química entre os nucleotídeos, 
chamada de ligação fosfodiéster, que vai 
unir o fosfato de um nucleotídeo com a 
açúcar ou a pentose do nucleotídeo 
adjacente. Dessa forma - ligando um 
nucleotídeo a outra -, ela vai formando uma 
fita nova de DNA.
→ O mecanismo da polimerização é sempre 
no sentido da fita 5' → 3' e a adição de 
nucleotídeos acontece na extremidade 3', 
que é a extremidade final.
Obs.: Já a leitura da fita é no sentido 3' → 5' 
pois é feita a leitura da fita mãe e não da 
fita filha que está sendo formada no sentido 
contrário.
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IMPORTANTE A DNA Polimerase possui um mecanismo de correção de erros, em que, 
depois de sintetizar uma parte da fita, ela volta, no sentido 3' → 5' apenas corrigindo, caso 
tenha colocado algum nucleotídeo no lugar errado.
💡 Obs¹.: A extremidade 5' sempre termina com o fosfato 
A extremidade 3' sempre termina com a pentose. 
💡 Obs².: É necessário saber que a DNA 
Polimerase é incapaz de sintetizar DNA do 
zero, ela precisa ter uma extremidade 3' com 
uma hidroxila livre; contudo, só existe hidroxila 
livre na fita de RNA (pois a pentose do DNA é 
uma desoxirribose, ela perdeu a hidroxila)
Para resolver o problema da DNA 
Polimerase, existe a enzima DNA Primase, 
que é capaz de iniciar a sintetização do 
DNA do zero, através da adição de um 
primer - uma sequência de nucleotídeos de 
RNA - com uma extremidade final 3' com 
uma hidroxila livre, para que a DNA 
Polimerase possa dar continuidade na 
sintetização da fita de DNA.
→ No final do processo, o primer de RNA é 
removido e substituído por uma sequência 
de DNA. Ele só é útil para iniciar o processo 
e depois é descartado.)
Ainda sobre a síntese da fita simples, há uma diferença no processo de formação da fita de 
"cima" e na fita "debaixo", também chamadas de fita líder ou contínua e fita atrasada ou 
descontínua; essa diferença ocorre porque a fita líder é sintetizada no mesmo sentido de 
abertura da fita dupla de DNA e a fita atrasada é sintetizada no sentido contrário. Além 
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disso, ela vai precisar de vários primers, pois o processo é iniciado várias vezes, enquanto a 
contínua só precisa de um primer.
→ Nesse cenário, a DNA polimerase precisa 
sintetizar o DNA na fita atrasada em 
pequenos pedaços, descontínuos, 
chamados de Fragmentos de Okazaki, nos 
locais que já foram abertos pela DNA 
Helicase, diferente da fita líder em que a 
síntese é contínua, no mesmo ritmo da 
Helicase.
→ No final do processo, a enzima DNA ligase une os Fragmentos de Okazaki e a fita se 
torna contínua. 
💡 FUNÇÃO DAS PRINCIPAIS ENZIMAS QUE PARTICIPAM DA REPLICAÇÃO 
 
- Helicase: promove a quebra das pontes de hidrogênio para que haja a abertura 
da dupla fita e ocorra a transcrição. 
- Girase/Topoisomerase: faz giros na molécula e pequenas clivagens e colagens 
para que a tensão seja diminuída e a fita seja desenrolada. 
- Proteínas ligadoras de fita simples: se ligam as fitas simples e evitam que elas se 
reconectem. 
- Polimerase: sintetiza a fita de DNA complementar e faz a união entre os 
nucleotídeos de cada fita. 
- Primase: inicia a sintetização do DNA do zero, através da adição de um primer. 
- Ligase: une os Fragmentos de Okazaki para que a nova fita de DNA se tornecontínua. 
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 TÉCNICA DE PCR (reação em cadeia da polimerase)
É uma simulação do processo de replicação, in vitro.
Essa técnica amplifica sequências específicas de DNA → produz milhares de cópias da 
mesma molécula para poder observar com maior facilidade o padrão da resposta.
→ É um processo realizado em vários ciclos com diferentes temperaturas.
O QUE CONTÉM NO TUBO DE PCR
→ DNA extraído e isolado
→ Primers (da fita contínua e descontínua - 
pois a enzima Primase não está no PCR
→ Nucleotídeos
→ DNA Polimerase (são utilizadas enzimas de 
bactérias específicas - hipertermófilas, que 
vivem em regiões de vulcão -, que são mais 
resistentes a temperaturas e não desnaturam 
com facilidade)
→ MgCl2 (cloreto de magnésio - é um cofator 
para ativar a enzima Polimerase)
→ H20 (água livre de DNAase e RNAase)
→ Tampão (mantém o PH estável para a 
atividade da enzima)
Tudo isso é colocado dentro de um tubo e levado para um aparelho 
chamado de Termociclador: ele tem a capacidade de variar a 
temperatura ao longo de alguns ciclos
 REAÇÃO DE PCR
 FASE 1 - Abertura da Dupla Fita por Desnaturação:
No PCR não tem a enzima Helicase, então o método utilizado para abertura da dupla fita de 
DNA é o aumento da temperatura para quebrar as pontes de hidrogênio e separar a dupla 
fita.
Obs.: é um processo abrupto, em que todas as pontes de hidrogênio são quebradas no 
mesmo instante, diferente do processo natural, com a enzima, em que a quebra é mais lenta, 
uma a uma. Isso vai dispensar as outras enzimas que auxiliam nesse processo, como a 
Topoisomerase.
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Aquecimento a mais de 90ºC para a separação da dupla fita
Separa tanto a fita de DNA original quanto os produtos de amplificação.
 FASE 2 - Anelamento dos Primers ou Hibridização:
É o encaixe dos primers, ou das sequências de bases nitrogenadas.
Como no PCR não há a enzima Primase, então faz-se a diminuição da temperatura para se 
reestabelecerem as ligações de hidrogênio. Nesse momento, os primers se ligam as fitas e 
impedem que elas se aproximem, até que a Polimerase os encontra e sintetiza o restante da 
cadeia.
Hibridização
Temperatura varia entre 40 a 70ºC 
conforme o par de primers
Determina a especificidade da 
ligação
 FASE 3 - Extensão:
É feita a duplicação do DNA
Atividade da Taq DNA Polimerase
Duplicação do DNA
Temperatura ótima em torno de 72ºC
Resumo da técnica:
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No final da técnica, o que temos é semelhante a 
imagem ao lado: tubinhos com água transparente. →
É preciso colocar corantes específicos de DNA através 
da técnica da Eletroforese.
→ O material genético é colocado numa matriz 
gelatinosa com um pólo negativo e um pólo positivo. O 
DNA, que é muito eletronegativo (tem fosfato) vai 
migrar para o pólo positivo e, ao migrar, ele vai 
deixando tracinhos.
→ Os resultados são muito similares aos testes de 
paternidade. O DNA do patógeno é detectado com os 
primers específicos do DNA do patógeno. Se os 
primers se ligarem e, por consequência, a polimerase 
estender o restante da cadeia, vai haver a amplificação.
→ Os tracinhos, chamados "bandas" vão detectar se é 
positivo ou não. 
 TIPOS DE PCR
Na técnica de PCR em tempo real não há a necessidade da 
eletroforese para detectar o resultado; o corante é colocado nos 
tubos de PCR e o equipamento é conectado a um computador que 
vai identificando, em tempo real, se os corantes estão emitindo 
fluorescência ao se ligarem ao DNA, a medida que ele é 
amplificado.
 USO DO PCR NA PRÁTICA
O PCR pode ser utilizado na prática médica para o diagnóstico de infecções de vírus, 
bactérias, fungos e protozoários.
Também pode ser utilizado para quantificação de DNA ou RNA viral da célula 
hospedeira. 
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Laudo de PCR e Eletroforese de um paciente com resultado negativo:
P = paciente
CN = controle negativo 
(não tem a banda)
CP = controle positivo 
(tem a banda)
Exame com resultado negativo.