Métodos de Estudo em Histologia

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Métodos de Estudo em Histologia 
A histologia é o estudo das células e dos tecidos do corpo e de como essas estruturas se organizam para constituir os órgãos. 
 
Preparação para exame microscópico 
A pequena dimensão das células e dos componentes da matriz extracelular contida entre as células faz com que a histologia 
dependa do uso de microscópios. No microscópio de luz a imagem se forma a partir dos raios luminosos de um feixe de luz que 
atravessou um estrutura. Células vivas, camadas muito delgadas de células ou de tecidos, membranas transparentes de animais 
vivos, podem ser observadas diretamente ao microscópio. Em contrapartida, a maioria dos tecidos e órgãos são espessos e devem 
ser fatiados em secções ou cortes histológicos muito delgados que são colocados sobre lâminas de vidro. Os cortes são obtidos 
por meio de instrumentos de grande precisão chamados micrótomos. 
 
Fixação 
A primeira etapa no preparo de uma amostra de tecido ou órgão é a fixação, necessária para preservar a sua estrutura e evitar a 
digestão dos tecidos por enzimas existentes nas próprias células (autólise) ou em bactérias. A fixação, em geral ocorre por uma 
substância química ou uma mistura de substancias químicas, que preserva de maneira permanente a estrutura do tecido para 
tratamentos posteriores. 
Pode ser feita com: 
 Química 
o Glutaraldeído; 
o Formaldeído; 
 Física 
o Congelação; 
Usada para: 
 Parar o metabolismo celular; 
 Evitar a degradação enzimática de células e tecidos pela autólise (autodigestão); 
 Exterminar microrganismos patogênicos, tais como bactérias, fungos e vírus; 
 Enrijecer o tecido como resultado de formação de ligações cruzadas ou desnaturação das moléculas de proteínas; 
Fixação por congelação 
Um modo completamente diferente de preparar secções de tecidos ocorre após submeter os tecidos a um congelamento rápido; 
dessa maneira, os tecidos são fixados por congelação, um método físico de fixação, tornando-se rígidos e, assim, prontos para 
serem seccionados. Um micrótomo para tecidos congelados – o criostato ou criomicrótomo – foi desenvolvido para a produção 
de cortes de tecidos congelados. Ele é habitualmente utilizado em hospitais para que seja possível analisar, em poucos minutos, 
espécimes obtidos durante procedimentos cirúrgicos. 
 
Inclusão 
Para obter secções delgadas com o micrótomo os fragmentos de tecidos e órgãos devem, após a fixação ser infiltrados com 
substancias que lhes proporcionem uma consistência rígida. As substancias mais utilizadas para esse fim são a parafina e algumas 
resinas de plástico. A parafina é habitualmente utilizada para microscopia de luz, e as resinas, para microscopia de luz eletrônica. 
O processo de impregnar os tecidos com parafina é chamado inclusão ou embebição em parafina e geralmente é precedido por 
duas etapas: desidratação e clareamento. 
Quando os fragmentos de tecidos são embebidos no solvente orgânico, eles ficam transparentes. Em seguida, são colocados em 
parafina derretida. O calor causa a evaporação do solvente orgânico, e os espaços existentes dentro dos tecidos tornam-se 
preenchidos com parafina. Os blocos de parafina que contêm os tecidos são então levados a um micrótomo, onde são seccionados 
por uma lamina de aço ou de vidro, de modo a fornecer cortes de 1 a 10 micrometros de espessura. 
Após serem seccionados, os cortes são colocados para flutuar sobre uma superfície de água aquecida e, depois, sobre laminas de 
vidro, onde aderem e serão em seguida, corados. 
 
 
 
Coloração 
Para ser estudada ao microscópio, a maioria dos cortes histológicos deve ser corada, porque, com poucas exceções, os tecidos 
são incolores. Os componentes dos tecidos que se coram bem com corantes básicos são chamados de basófilos, e os que tem 
grande afinidade por corantes ácidos, de acidófilos. 
O azul de toluidina e o azul de metileno são exemplos de corantes básicos. Outros corantes, como a hematoxilina, comportam-se 
como corantes básicos e se ligam às estruturas basófilas das células e dos tecidos. Dentre todos os corantes, a combinação 
hematoxilina e eosina (HE) é a mais comumente utilizada. A hematoxilina cora em azul ou violeta o núcleo das células e outras 
estruturas ácidas. A eosina, por outro lado, cora o citoplasma e o colágeno em cor de rosa. 
Outra maneira de evidenciar componentes de células e tecidos, é a sua impregnação por metais, como prata e ouro, método muito 
usado para estudar tecido nervoso. 
O procedimento inteiro, desde a fixação até a observação de um tecido em um microscópio de luz, pode demorar de 12h a 2 dias, 
dependendo do tamanho do tecido, do fixador e do meio de inclusão utilizados. 
 
Desidratação 
Pode ser feita da seguinte maneira: 
 Desidratação 
o Álcool; 
 Clarificação 
o Xilol; 
 
Parafinização 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cortes histológicos 
Cortes muito finos, na faixa de 5 a 15վm (1 micrômetro é igual a 1/1000 de 1 milímetro). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Colorações 
Hematoxilina Azul – núcleo, regiões ácidas do citoplasma e matriz cartilagínea. 
Eosina Rosa – regiões básicas do citoplasma e fibras colagenosas 
 
Tipos de microscopia 
Principal instrumento da Biologia Celular e Histologia 
De luz (ML) / óptico (campo claro) 
Ao microscópio de luz, as preparações coradas são examinadas por iluminação que atravessa 
a espécime. O microscópio de luz é composto de partes mecânicas e ópticas. O componente 
óptico consiste em três sistemas de lentes: condensador, objetivas e oculares. 
O poder de resolução máximo do microscópio de luz é de aproximadamente 0,2 um; esta 
resolução torna possível a obtenção de boas imagens aumentadas até 1000 a 1500 vezes. 
Modificado (variações) com propósitos especiais 
 Contraste de fase; 
 Polarização; 
 Invertido; 
 Fluorescência; 
Eletrônico (ME) – Imagens mais aumentadas / feixe de elétrons 
 Microscópio eletrônico de transmissão (MET); 
Só pode ser usado para analisar partículas ou moléculas isoladas, pois cortes delgados de células e tecidos podem ser 
observados com detalhes em aumentos de até cerca de 120 mil vezes. A imagem é sempre em preto e branco. 
 Microscópio eletrônico de varredura (MEV); 
Fornece imagens pseudotridimensionais das superfícies das células, tecidos e órgãos. Nesse microscópio um feixe de 
elétrons de diâmetro muito pequeno é focalizado sobre o espécime, percorrendo sequencialmente. 
Microscopia de contraste 
Produz uma imagem aparentemente tridimensional. Estas imagens são sempre vistas em preto, branco e tons de cinza. 
 
Microscopia confocal 
Geralmente, há superposição de vários planos, os quais aparecem em foco simultaneamente, causando certo grau de deterioração 
da imagem. Para resolver esse problema foi desenvolvido o microscópio confocal, que torna possível focalizar um plano muito 
delgado do espécime. Fundamentos: 
 O espécime é iluminado por um feixe de luz muito estreito; 
 A imagem coletada do espécime deve passar por um orifício muito pequeno; 
 A consequência desse arranjo é que só a imagem originada no plano focalizado alcança o detector. 
 
Microscopia de florescência 
Quando algumas substancias são irradiadas por luz de um determinado comprimento de onda, elas emitem luz com um 
comprimento de onda mais longo. Esse fenômeno é chamado de fluorescência. 
 
Radioautografia em secções de tecidos 
Possibilita o estudo funcional de processos biológicos em corte de tecidos pelo uso de radioatividade, aproveitando a capacidade 
de alguns tipos de emissões radioativas sensibilizarem emulsões fotográficas. 
 
Problemas na interpretação de cortes 
Distorções 
Uma causa da distorção é a retração produzida pelo fixador, pelo etanol e pelo calor da parafina usada para inclusão. A retração é 
atenuada quando os tecidos são incluídos em resina. Uma consequência da retração é o aparecimento de espaços artificiais nas 
células e entre as células e outros componentes de tecido.Outra fonte de espaços artificiais é a perda de moléculas que não foram 
mantidas corretamente nos tecidos pelo fixador ou que foram retiradas pelas soluções de desidratação e clareamento. Exemplos 
de moléculas não preservadas são o glicogênio e lipídeos. 
Totalidade do tecido 
Uma grande dificuldade apresentada por cortes de microscopia de luz é a impossibilidade de se corar diferencialmente todos os 
componentes das células e tecidos em um só preparado. 
Duas dimensões ou mais 
Quando uma estrutura tridimensional é cortada em secções muito delgadas, as secções parecem ter somente duas dimensões: 
comprimento e largura. Isso frequentemente conduz o observador a erros se ele não se conscientizar de que uma esfera 
seccionada é vista como um círculo e que um tubo seccionado é visto como um anel.