RESUMO: técnicas de hibridização (blotting)

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Técnicas de Hibridização
Técnicas de Hibridização	@vireicientista
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SOUTHERN BLOTTING - DNA
NORTHERN BLOTTING - RNA
WESTERN BLOTTING - PROTEÍNAS
· Blotting - técnica de transferência de amostras para gel.
o que são técnicas de hibridização?
Métodos que levam em consideração a capacidade das fitas de RNA e DNA formarem duplas fitas estáveis por meio do pareamento com bases complementares.
principal utilização:
Identificação e localização de sequências de ácidos nucleicos em genomas, pool de DNA, mistura de DNA e RNA.
southern blotting
hibridização de DNA-DNA.
· Amostra de DNA em uma sonda para a detecção de sequencias específicas de DNA.
· O resultado do DNA tratado com enzimas de restrição é visualizado por eletroforese
· PRIMEIRO PASSO: digestão enzimática
· Tratamento com as enzimas de restrição
· Geração de fragmentos
· SEGUNDO PASSO: eletroforese em agarose
· Amostra em gel de agarose tratada com substância alcalina/básica com o objetivo de quebrar a dupla fita de DNA da amostra, permitindo assim a hibridização futura. Após correr o gel, vamos lavá-lo para retirar a substância alcalina.
· TERCEIRO PASSO: transferência para um filtro
· Há transferência do material do gel para uma membrana de nitrocelulose ou de nylon com posterior fixação por UV.
· As bandas do gel passam pelo filtro por capilaridade (forças de adesão x forças de coesão)
· QUARTO PASSO: exposição a sonda marcada
· Tratamento da membrana com sonda marcada (podendo ser marcada tanto por um fluoróforo quanto por um elemento radioativo). A sonda ficará presa no DNA somente se encontrar uma sequência complementar à ela.
· SONDAS: Sequências complementares ao DNA de interesse (presente no 	filtro de nitrocelulose ou nylon).
· QUINTO PASSO: exposição ao raio x
· As sondas ligadas na membrana marcarão o filme de raio X permitindo a visualização do resultado no filme.
· Se a sonda se ligou, significa que a sequência de interesse está presente na amostra
northern blotting
hibridização de RNA-RNA.
· Adição de formol para evitar que o RNA forme estruturas secundárias.
· Não é muito utilizado porque tem outras técnicas melhores, mais eficientes e mais praticas.
western blotting
hibridização de proteínas.
· A hibridização é diferente - imunoensaio
· Antígenos específicos irão estimular reações imunológicas muito específicas e de que proteínas produzidas pela reação imunológica, chamadas anticorpos, podem ser usadas para sinalizar a presença de um composto-alvo em uma amostra
· Utiliza-se leite em pó para bloquear ligações inespecíficas da membrana com a amostra. Posteriormente lava-se o excesso para liberar a amostra na membrana para ligar-se com o anticorpo.
· A proteína fica marcada com um anticorpo preso a um cromóforo
· Cromóforos são grupos funcionais orgânicos e inorgânicos insaturados que absorvem na região do infravermelho, ultravioleta ou visível.