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Imunoensaios

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PRÁTICAS INTEGRADORAS III 
AULA 5 
Imunoensaios
 APLICAÇÕES DOS TESTES 
• Diagnóstico; 
• Acompanhamento terapêutico; 
• Epidemiologia; 
• Pesquisa. 
 
 REAÇÃO AG x AC 
• Sorologia: Pesquisa do antígeno ou anticorpo no 
soro. É utilizado no diagnóstico de infecções. 
• Imunohistoquímica, imunofluorescência e 
citometria de fluxo: Pesquisa do antígeno em 
tecidos ou amostras clínicas. É utilizado para 
fenotipagem de células. 
 
ESPECIFICIDADE 
• Anticorpos: São formados sob influência das 
características estruturais do antígeno (epítopo 
seleciona o receptor do linfócito B). 
→ A sequência de aminoácidos do sítio 
combinatório é complementar a configuração 
espacial do epítopo. 
→ As ligações são de curto alcance (fracas), pontes 
de hidrogênio, ligações eletroestáticas. 
• A especificidade de um soro total apresenta 
anticorpos que reagem com todos os epítopos dos 
antígenos. 
 
AFINIDADE 
• Força de reação a um único epítopo e um único sítio 
combinatório do anticorpo. 
• Ligação de cada valência do anticorpo a seu epítopo 
correspondente. 
• Pode apresentar alta ou baixa afinidade. 
• Reações cruzadas: Presença de antígenos 
semelhantes. 
 
AVIDEZ 
• Força de ligação total entre um antígeno (com 
muitos epítopos) e anticorpos multivalentes. 
• A IgG faz ligação bivalente, possui uma afinidade 
alta (maturação de afinidade) e avidez alta só para 
antígenos solúveis (epítopos acessíveis). 
• A IgM faz ligação pentavalente (sítios de ligação 
idênticos), sua afinidade é baixa pois não tem 
maturação de afinidade e avidez total do anticorpo 
para antígeno multivalente elevada. 
→ O IgM normalmente é encontrado na porta de 
entrada de patógenos, por isso é importante que 
ela possua várias valências, o que permite que ela 
capture rapidamente vários patógenos no início 
da resposta imune. 
 
FATORES QUE INFLUENCIAM A MEDIÇÃO DAS 
REAÇÕES AG/AC 
• Afinidade; 
• Avidez; 
• Estado físico do antígeno; 
• Concentração antígeno com anticorpo. 
→ Excesso de anticorpo podendo dar falso negativo 
(efeito prozona) 
▪ Comum na sífilis. 
→ O ponto de equilíbrio entre antígeno-anticorpo 
(2:1) forma uma rede, o que possibilita a 
visualização a olho nu da precipitação e 
aglutinação. 
→ A medida que o soro é diluído a resposta 
desaparece. 
 
COMPONENTES DA REAÇÃO 
• Antígeno: 
→ Patógeno íntegro; 
→ Extrato (todos os componentes); 
→ Antígenos de superfície; 
→ Purificado (estruturas do patógeno); 
→ Proteínas recombinantes; 
→ Peptídeo sintético. 
• Anticorpo: 
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→ Policlonais resultantes da inoculação do antígeno 
completo, formando diversos anticorpos que 
reagiram a diferentes epítopos; 
→ Monoclonais resultantes da técnica de 
diminuição infinita, que leva a formação de clone 
de linfócitos, os quais são identificados e 
hibridizados mantendo a formação de anticorpos 
específicos para uma molécula do patógeno. 
• Sistema revelador: 
→ Fixação do complemento; 
→ Fluorocromo; 
→ Radioisótopo; 
→ Métodos enzimáticos. 
 
 AC MONOCLONAL 
VANTAGENS 
• Homogeneidade. 
• Especificade. 
• Reprodutibilidade. 
 
APLICAÇÕES 
• Identificação de marcadores fenotípicos e análise 
funcional de moléculas de superfície celular. 
• Imunodiagnóstico de doenças infecciosas. 
• Diagnóstico e imunoterapia de tumores. 
→ Uso do antígeno junto com um radioisótopo no 
tratamento faz com que apenas a célula tumoral 
seja afetada. 
 
 SOROLOGIA 
• Qualitativa: Positivo ou negativo para presença de 
antígeno. 
• Quantitativa: Titulação. 
→ Dosagem semi-quantitativa do antígeno ou do 
anticorpo ou antígeno desconhecido 
respectivamente. 
→ Título: Maior diluição do componente 
pesquisado (ag ou ac onde ainda há 
manifestação visível da reação). 
→ Titulação de anticorpo (sorodiagnóstico): 
Determina a quantidade de anticorpo presente 
em um soro. 
→ Titulação do antígeno: Determina a 
concentração mínima de antígeno a ser usada 
numa reação sorológica. 
• Levar em consideração o tempo da coleta. 
→ Detecção de IgM: Infecção primária (aguda). 
→ Detecção de IgM e IgG: Infecção em curso. 
→ Detecção de IgG: Convalescência, vacinação, 
cicatriz sorológica. 
• A escolha do teste sorológico a ser utilizado no 
diagnóstico de infecções agudas deve levar em 
consideração a sensibilidade e a duração do período 
necessário para o aparecimento de títulos de 
anticorpos detectáveis (janela imunológica). 
• Resultados positivos necessitam de testes 
confirmatórios. 
• Resultados devem ser interpretados no contexto 
clínico e epidemiológico. 
 
 
 
 
SOROLOGIA PAREADA 
• 1ª coleta na fase aguda. 
• 2ª coleta (2 a 4 semanas após a 1ª coleta). 
• Conversão sorológica: Aumento de no mínimo 4 
vezes no título de anticorpos do soro da fase 
convalescente (2ª coleta) em relação ao soro da fase 
aguda (1ª coleta). 
• Confirmação de infecção por um patógeno. 
 
 MÉTODOS SOROLÓGICOS 
AGLUTINAÇÃO 
• Direta: Antígeno faz parte da estrutura de uma 
célula, forma um agregado antígeno-anticorpo. É 
feita em tubo, lâmina ou microplacas, podendo ser 
qualitativa ou quantitativa. 
→ Qualitativa: Tipagem sanguínea, tipagem de 
bactérias (auxiliar no diagnóstico 
microbiológico). 
→ Quantiativa: Diluição do soro (titulação) e coloca 
o antígeno. Positivo tem formação do agregado. 
Atualmente, mais utilizada as placas. 
▪ Ex: Reação de Widal (Febre tifóide), tipagem 
sanguínea. 
Para diagnóstico de infecção em recém-nascido 
detectamos IgM, pois é a única que ele pode 
produzir. A IgG pode passar através da placenta da 
mãe. 
TESTE DE AVIDEZ PARA IgG 
Diz se há muita avidez, significando que a 
gestante já está se curando. Entretanto, caso haja 
pouca avidez, ela está em fase aguda podendo 
comprometer o feto. 
Faz uso da ureia para separação do antígeno-
anticorpo. 
• Índice <0.200: Baixa avidez, infecção recente 
(menos de 4 meses). 
• Índice entre 0.200 e 0.300: Avidez 
intermediária, não é possível determinar o tempo 
de infecção. 
• Índice >0.300: Alta avidez, infecção pregressa 
ou crônica (mais de 4 meses). 
 
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→ Fácil de executar. 
→ Baixo custo. 
→ Elevada sensibilidade (visualização do positivo na 
população doente). 
→ Leitura visual. 
→ Semi-quantitativo. 
• Indireta: Antígeno solúvel adsorvido a superfície de 
uma partícula (hemácia, látex etc.), devido à 
dificuldade de visualizar sua precipitação quando 
separado. 
→ Ex: Sorodiagnóstio da sífilis. 
▪ TPHA: Hemácias de carneiro sensibilizadas 
com antígenos de Treponema pallidum. Teste 
treponêmico. 
▪ VDRL (colesterol): Cardiolipina adsorvida no 
cristal de colesterol, necessário microscópio. 
Cristais espalhados é negativo e aglutinados é 
positivo. Não treponêmico. 
▪ VDRL (látex): Cardiolipina adsorvida no látex, 
feito na lâmina. A bolinha de látex fica 
deformada caso seja positivo. Não 
treponêmico. 
▪ Imunocromatografia: Teste rápido 
treponêmico, utilizado como triagem. 
→ Pesquisa de antígeno 
▪ Anticorpo específico (solúvel) é adsorvido a 
uma partícula (látex, hemácia, S. aureus). 
▪ Pesquisa de proteína C reativa, fator 
reumatóide ou antígenos polissacarídicos 
bacterianos. 
 
 
 
PRECIPITAÇÃO 
• Utilizada para antígenos solúveis. 
• Meio gelificado. 
• Linha de precipitação. 
• Utilizado na detecção de fungos (micose). 
MÉTODOS AUTOMATIZADOS 
• Quando coloca a luz no tubo de ensaio o raio 
luminoso sofre dispersão