Imunoensaios: Diagnóstico e Pesquisa

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PRÁTICAS INTEGRADORAS III 
AULA 5 
Imunoensaios
 APLICAÇÕES DOS TESTES 
• Diagnóstico; 
• Acompanhamento terapêutico; 
• Epidemiologia; 
• Pesquisa. 
 
 REAÇÃO AG x AC 
• Sorologia: Pesquisa do antígeno ou anticorpo no 
soro. É utilizado no diagnóstico de infecções. 
• Imunohistoquímica, imunofluorescência e 
citometria de fluxo: Pesquisa do antígeno em 
tecidos ou amostras clínicas. É utilizado para 
fenotipagem de células. 
 
ESPECIFICIDADE 
• Anticorpos: São formados sob influência das 
características estruturais do antígeno (epítopo 
seleciona o receptor do linfócito B). 
→ A sequência de aminoácidos do sítio 
combinatório é complementar a configuração 
espacial do epítopo. 
→ As ligações são de curto alcance (fracas), pontes 
de hidrogênio, ligações eletroestáticas. 
• A especificidade de um soro total apresenta 
anticorpos que reagem com todos os epítopos dos 
antígenos. 
 
AFINIDADE 
• Força de reação a um único epítopo e um único sítio 
combinatório do anticorpo. 
• Ligação de cada valência do anticorpo a seu epítopo 
correspondente. 
• Pode apresentar alta ou baixa afinidade. 
• Reações cruzadas: Presença de antígenos 
semelhantes. 
 
AVIDEZ 
• Força de ligação total entre um antígeno (com 
muitos epítopos) e anticorpos multivalentes. 
• A IgG faz ligação bivalente, possui uma afinidade 
alta (maturação de afinidade) e avidez alta só para 
antígenos solúveis (epítopos acessíveis). 
• A IgM faz ligação pentavalente (sítios de ligação 
idênticos), sua afinidade é baixa pois não tem 
maturação de afinidade e avidez total do anticorpo 
para antígeno multivalente elevada. 
→ O IgM normalmente é encontrado na porta de 
entrada de patógenos, por isso é importante que 
ela possua várias valências, o que permite que ela 
capture rapidamente vários patógenos no início 
da resposta imune. 
 
FATORES QUE INFLUENCIAM A MEDIÇÃO DAS 
REAÇÕES AG/AC 
• Afinidade; 
• Avidez; 
• Estado físico do antígeno; 
• Concentração antígeno com anticorpo. 
→ Excesso de anticorpo podendo dar falso negativo 
(efeito prozona) 
▪ Comum na sífilis. 
→ O ponto de equilíbrio entre antígeno-anticorpo 
(2:1) forma uma rede, o que possibilita a 
visualização a olho nu da precipitação e 
aglutinação. 
→ A medida que o soro é diluído a resposta 
desaparece. 
 
COMPONENTES DA REAÇÃO 
• Antígeno: 
→ Patógeno íntegro; 
→ Extrato (todos os componentes); 
→ Antígenos de superfície; 
→ Purificado (estruturas do patógeno); 
→ Proteínas recombinantes; 
→ Peptídeo sintético. 
• Anticorpo: 
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→ Policlonais resultantes da inoculação do antígeno 
completo, formando diversos anticorpos que 
reagiram a diferentes epítopos; 
→ Monoclonais resultantes da técnica de 
diminuição infinita, que leva a formação de clone 
de linfócitos, os quais são identificados e 
hibridizados mantendo a formação de anticorpos 
específicos para uma molécula do patógeno. 
• Sistema revelador: 
→ Fixação do complemento; 
→ Fluorocromo; 
→ Radioisótopo; 
→ Métodos enzimáticos. 
 
 AC MONOCLONAL 
VANTAGENS 
• Homogeneidade. 
• Especificade. 
• Reprodutibilidade. 
 
APLICAÇÕES 
• Identificação de marcadores fenotípicos e análise 
funcional de moléculas de superfície celular. 
• Imunodiagnóstico de doenças infecciosas. 
• Diagnóstico e imunoterapia de tumores. 
→ Uso do antígeno junto com um radioisótopo no 
tratamento faz com que apenas a célula tumoral 
seja afetada. 
 
 SOROLOGIA 
• Qualitativa: Positivo ou negativo para presença de 
antígeno. 
• Quantitativa: Titulação. 
→ Dosagem semi-quantitativa do antígeno ou do 
anticorpo ou antígeno desconhecido 
respectivamente. 
→ Título: Maior diluição do componente 
pesquisado (ag ou ac onde ainda há 
manifestação visível da reação). 
→ Titulação de anticorpo (sorodiagnóstico): 
Determina a quantidade de anticorpo presente 
em um soro. 
→ Titulação do antígeno: Determina a 
concentração mínima de antígeno a ser usada 
numa reação sorológica. 
• Levar em consideração o tempo da coleta. 
→ Detecção de IgM: Infecção primária (aguda). 
→ Detecção de IgM e IgG: Infecção em curso. 
→ Detecção de IgG: Convalescência, vacinação, 
cicatriz sorológica. 
• A escolha do teste sorológico a ser utilizado no 
diagnóstico de infecções agudas deve levar em 
consideração a sensibilidade e a duração do período 
necessário para o aparecimento de títulos de 
anticorpos detectáveis (janela imunológica). 
• Resultados positivos necessitam de testes 
confirmatórios. 
• Resultados devem ser interpretados no contexto 
clínico e epidemiológico. 
 
 
 
 
SOROLOGIA PAREADA 
• 1ª coleta na fase aguda. 
• 2ª coleta (2 a 4 semanas após a 1ª coleta). 
• Conversão sorológica: Aumento de no mínimo 4 
vezes no título de anticorpos do soro da fase 
convalescente (2ª coleta) em relação ao soro da fase 
aguda (1ª coleta). 
• Confirmação de infecção por um patógeno. 
 
 MÉTODOS SOROLÓGICOS 
AGLUTINAÇÃO 
• Direta: Antígeno faz parte da estrutura de uma 
célula, forma um agregado antígeno-anticorpo. É 
feita em tubo, lâmina ou microplacas, podendo ser 
qualitativa ou quantitativa. 
→ Qualitativa: Tipagem sanguínea, tipagem de 
bactérias (auxiliar no diagnóstico 
microbiológico). 
→ Quantiativa: Diluição do soro (titulação) e coloca 
o antígeno. Positivo tem formação do agregado. 
Atualmente, mais utilizada as placas. 
▪ Ex: Reação de Widal (Febre tifóide), tipagem 
sanguínea. 
Para diagnóstico de infecção em recém-nascido 
detectamos IgM, pois é a única que ele pode 
produzir. A IgG pode passar através da placenta da 
mãe. 
TESTE DE AVIDEZ PARA IgG 
Diz se há muita avidez, significando que a 
gestante já está se curando. Entretanto, caso haja 
pouca avidez, ela está em fase aguda podendo 
comprometer o feto. 
Faz uso da ureia para separação do antígeno-
anticorpo. 
• Índice <0.200: Baixa avidez, infecção recente 
(menos de 4 meses). 
• Índice entre 0.200 e 0.300: Avidez 
intermediária, não é possível determinar o tempo 
de infecção. 
• Índice >0.300: Alta avidez, infecção pregressa 
ou crônica (mais de 4 meses). 
 
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→ Fácil de executar. 
→ Baixo custo. 
→ Elevada sensibilidade (visualização do positivo na 
população doente). 
→ Leitura visual. 
→ Semi-quantitativo. 
• Indireta: Antígeno solúvel adsorvido a superfície de 
uma partícula (hemácia, látex etc.), devido à 
dificuldade de visualizar sua precipitação quando 
separado. 
→ Ex: Sorodiagnóstio da sífilis. 
▪ TPHA: Hemácias de carneiro sensibilizadas 
com antígenos de Treponema pallidum. Teste 
treponêmico. 
▪ VDRL (colesterol): Cardiolipina adsorvida no 
cristal de colesterol, necessário microscópio. 
Cristais espalhados é negativo e aglutinados é 
positivo. Não treponêmico. 
▪ VDRL (látex): Cardiolipina adsorvida no látex, 
feito na lâmina. A bolinha de látex fica 
deformada caso seja positivo. Não 
treponêmico. 
▪ Imunocromatografia: Teste rápido 
treponêmico, utilizado como triagem. 
→ Pesquisa de antígeno 
▪ Anticorpo específico (solúvel) é adsorvido a 
uma partícula (látex, hemácia, S. aureus). 
▪ Pesquisa de proteína C reativa, fator 
reumatóide ou antígenos polissacarídicos 
bacterianos. 
 
 
 
PRECIPITAÇÃO 
• Utilizada para antígenos solúveis. 
• Meio gelificado. 
• Linha de precipitação. 
• Utilizado na detecção de fungos (micose). 
MÉTODOS AUTOMATIZADOS 
• Quando coloca a luz no tubo de ensaio o raio 
luminoso sofre dispersãoou impede a transmissão 
do raio. 
• Nefalometria: Capta os raios dispersos. Utiliza um 
aparelho caro. 
• Turbidimetria: Capta o bloqueio do raio. 
• Quanto maior a diminuição da luz transmitida maior 
a formação de complexos. 
• Ex: Fator reumatóide, IgA, IgG, IgM, C3, C4, 
albumina, proteína C reativa, transferina, 
fibronectina etc. 
 
 
 
 MÉTODOS ENZIMÁTICOS 
IMUNOFLORESCÊNCIA 
• Direta: Anticorpo, geralmente monoclonal, marcado 
com o fluorocromo. 
→ Detecção direta de microrganismos em secreções 
(urina, fezes), em cortes de tecidos, fenotipagem 
de células tumorais. 
→ Em bacteriologia, um dos poucos métodos de IFD 
ainda usado em laboratório clínico (pesquisa de 
coproantígenos e identificação do Streptococcus 
do grupo A). 
• Indireta: Anti-imunoglobulina conjugado ao 
fluorocromo. 
→ Microrganismo ou cultura de células infectadas é 
fixada a lâmina. 
→ Soro a ser testado. 
→ Anti-Ig conjugado ao fluorocromo. 
→ Precisa de microscópio especial. 
→ FTA-ABS (Treponêmico) confirmatório de teste 
não treponêmico. 
→ IFI para T. cruzi confirmatório da reação Machado 
Guerreiro. 
• Vantagens: 
→ Sensibilidade; 
→ Especificidade; 
→ Reprodutibilidade; 
→ Simples padronização e execucação; 
→ O mesmo conjugado pode ser usado em sistemas 
diferentes; 
→ Permite determinar as classes e subclasses de 
anticorpos (utilização de conjugados específicos). 
• Desvantagens: 
→ Necessidade de microscópio de fluorescência; 
INIBIÇÃO DA HEMAGLUTINAÇÃO 
Técnica usada para vírus hemaglutinantes, 
como o da influenza. Eles possuem uma molécula na 
superfície que aglutina hemácia. 
Caso o indivíduo tenha anticorpo contra o vírus a 
hemácia não aglutina, ela vai para o fundo pois não 
forma rede já que o anticorpo se liga proteína 
hemaglutinante, sendo esse um teste positivo, o 
contrário do visto anteriormente. 
Usado para detecção de vírus de influenza, 
sarampos e dengue. 
 
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→ Subjetividade na leitura; 
→ Não-automação. 
• Aplicação: 
→ Diagnóstico sorológico de várias doenças 
infecciosas humanas. 
→ Ex: Doença de Chagas, AIDS, hepatites e 
complexos antígenos e anticorpos em doenças 
autoimunes. 
 
 
 
CITOMETRIA DE FLUXO 
• Análise multiparamétrica de partículas e células (uma 
a uma) em suspensão. 
→ Tamanho = Forward scatter (FSC). 
→ Complexidade = Side scatter (SSC). 
→ Fluorescência relativa = Fluorescence-activated 
cell sorting (FACS). 
• Informações obtidas pela análise de citometria de 
fluxo. 
• Quanto maior a células mais complexas. 
• A fluorescência relativa identifica células através de 
marcadores antígenos de superfície de cada 
população estudada. 
• Faz-se a lavagem para permanência apenas do 
anticorpo. 
• Aplicações: 
→ Hematologia: Contagem celular, fórmula 
leucocitária, análise da medula óssea. 
→ Farmacologia: Estudo de cinética celular, 
resistência a drogas. 
→ Imunologia: Subpopulação de células T, tipagem 
tissular, estimulação linfocitária, apoptose. 
→ Oncologia: Diagnóstico, prognóstico, monitorar 
tratamento. 
→ Microbiologia: Diagnóstico bacteriano e viral, 
sensibilidade a antibióticos. 
→ Genética: Cariótipo, diagnóstico do portador, 
diagnóstico pré-natal, tipagem para transplantes. 
 
ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO ELISA 
• ELISA: Enzyme-linked immunsorbent assay. 
• Avaliação qualitativa ou quantitativa. 
• Utiliza substrato cromogênico (cor). 
• Direta: Mesma técnica de imunofluorescência, o que 
diferencia é que a reação faz uso de um anticorpo 
marcado por enzima. Pesquisa a presença de um 
antígeno em uma amostra. 
• Indireto: Fixa o antígeno na placa jogo o soro e 
espero reagir, faz a lavagem e joga o conjugado que 
detecta se tem anticorpo. Pesquisa a presença de um 
anticorpo específico em uma amostra de soro do 
paciente. Quantidade de anti-Ig marcada ligada é 
proporcional a quantidade de anticorpo no soro 
teste. 
• Aplicações: 
→ Detecção dos antígenos (hormônios, citocinas, 
enzimas, antígenos microbianos, drogas ilícitas). 
→ Detecção de anticorpos (anti-HIV, por exemplo) 
em fluídos corporais ou sobrenadantes de 
culturas. 
→ Detecção pela quantificação do produto da 
reação da enzima x substrato. 
→ Ex: Diagnóstico de HIV, doença de Chagas, 
toxoplasmose etc. 
 
 
 
 
 
WESTERNBLOT 
• Usado para detectar anticorpos específicos contra 
frações proteicas antigênicas de um determinado 
patógeno em um soro de paciente. 
• 1ª ETAPA: Eletroforense (SDS-PAGE). 
→ Proteínas do extrato bruto, separação das 
frações. 
→ Marcadores de peso molecular, que no caso do 
HIV cada proteína com determinado peso 
aparece em uma etapa da doença, 
correspondendo a um componente da estrutura 
viral. 
ELISA DE CAPTURA (DETECÇÃO DE IgM) 
Importante para o diagnóstico de dengue. 
Identificação do IgM para análise da fase aguda. 
Fixação de anticorpo anti-IgM humano, incubação 
com o soro testado, faz a lavagem tirando os outros 
anticorpos. Em seguida, joga o antígeno da dengue 
e ele ligada na IgM especifica para ele. 
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→ Transfere as proteínas do gel para as membranas. 
• 2ª ETAPA: Reação Imune. 
→ Reação antígeno-anticorpo. 
→ Reação com conjugado e revelação com 
substrato cromogênico ou quimioluminescente. 
→ Visualização dos complexos antígenos-anticorpo 
formados. 
 
TESTE IMUNOCROMATOGRÁFICO DE 
DIAGNÓSTICO 
• Testes rápidos. 
• Permite detectar rapidamente a presença do 
antígeno ou anticorpo na amostra. 
• Facilidade de armazenamento e transporte para 
coleta em campo. 
• Fácil de utilizar, dispensando técnicas complicadas 
ou vários reagentes. 
• Fluxo lateral e o de duplo percurso (amostra e 
tampão em locais diferentes) são os mais usados. 
 
 
 
 
TESTE DE COVID-19 
• RT-PCR: Biologia molecular em amostra de 
secreção. Fase aguda. 
• Teste de antígeno: Uso de amostra de secreção. 
• Teste IgG e IgM: Sorologia. Identifica a 
existência de anticorpo.