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1 Replicação do DNA: Função do DNA: Genotípica: armazena informações genéticas, podendo transmitir para os filhos (hereditariedade). Fenotípica: determina o fenótipo, influenciada pela expressão gênica. Evolutiva: sofre mutações (nem sempre são maléficas) para produzir variabilidade genética (maior ou menor aptidão a uma certa característica, adaptando-se ao meio). Observação: antes de cada divisão celular ocorre replicação do DNA (fase S). A capacidade das células manterem a fidelidade da informação, depende da replicação extremamente precisa (células filhas aptas). Maquinaria de replicação: - Elevada taxa: um dos processos mais rápidos ocorrem na célula (adição de 3000 nucleotídeos por segundo). - Falhas raras: resulta em mutações (1 a cada 109 nucleotídeos) raras, pois é, na maior parte das vezes, muito preciso (vários erros são concertados no próprio processo). Estrutura da molécula de DNA: macromolécula helicoidal longa com duas cadeias paralelas de nucleotídeos (dupla hélice). Composição do nucleotídeos de grupo fosfato (P), desoxirribose e base nitrogenada (4 tipos). Pode ter alterações de acordo com o tipo celular. Principais funções: Ligação fosfodiéster: liga os nucleotídeos de uma mesma fita; grupo OH do C3 do açúcar de um nucleotídeo + grupo fosfato ligado à OH do C5 do açúcar do nucleotídeo seguinte. Faz o esqueleto tridimensional ser forte e dá base ao arcabouço. Pontes de hidrogênio: entre as bases nitrogenadas; mantem a dupla hélice unida; A = T (2) e G = C (3); deixa a molécula mais estável. Dupla hélice: fitas complementares A e T, C e G; fitas antiparalelas 5’ 3’ e 3’ 5’, com polaridades opostas. Características gerais do processo de replicação: precisão; DNA molde para formação de 2 novas fitas por meio do pareamento das bases nitrogenadas (A/T – C/G) que permite às fitas filhas serem complementares geneticamente às fitas de origem; abertura da dupla hélice da fita molde, reconhecimento de um nucleotídeo complementar livre, polimerização catalisada por enzimas (DNA polimerase). Replicação: Semiconservativa (Watson e Crick): cada uma das moléculas originadas contém uma cadeia completa da molécula original e uma cadeia nova. 2 bandas: 1 leve e 1 intermediária. Conservativa: preserva a molécula original e gera uma molécula inteiramente nova. 2 bandas: 1 leve e 1 pesada. Dispersiva: produz duas moléculas com DNA original e novo, intercalados ao longo das cadeias. 1 banda: intermediária. Replicação semiconservativa: no experimento de Meselson e Stahl (1958), E. coli foi cultivada em um meio contendo o isótopo pesado do nitrogênio (15N) em vez da forma normal (14N); após muitas gerações (DNA bem marcado com 15N) as bactérias foram cultivadas em um meio com 14N; centrifugadas após 1ª e 2ª divisão celular; resultado compatível apenas com o modelo semiconservativo (2 bandas: 1 leve e 1 intermediária). 2 Replicação “in vitro”: Procariotos: E. coli realiza 1 divisão a cada 40 minutos; DNA circular e 1 único ponto de origem de replicação. Eucariotos: replicação coordenada para mais de um cromossomo ao mesmo tempo; múltiplos pontos de origem (humanos: 10.000 pontos de replicação para que todo o material seja replicado). - Levedura: 1 divisão a cada 120 minutos. - Célula vegetal: 1 divisão a cada 29 horas. - Célula animal: 1 divisão a cada 24 horas; pode durar de 100 a 200 horas em algumas células. Mecanismos de replicação: Ponto de início da replicação: possuímos 3 milhões de “letras” (pares de bases) organizadas em 46 cromossomos (23 pares); tem início em um sítio específico do cromossomo denominado origem de replicação (em E. coli é denominado oriC) que é reconhecido, e abre- se a fita; forma-se a bolha de replicação que se expande bidirecionalmente em forma de “Y” formando garfos ou forquilhas de replicação que se movem em ambas as direções até encontrar o ponto de término (pode ser unidirecional se for material pequeno, como em alguns vírus). Origem de replicação: sequencias ricas em A=T; localizadas em sequencias específicas do DNA, sempre no mesmo ponto do cromossomo para reconhecimento dos pontos de origem de replicação. Origem de replicação: - Procariotos: oriC (E. coli) tem 245 pb (pares de bases) de tamanho, um conjunto de sequencias quase idênticas de 13 pb em tandem que se repetem (sequencias de 13 unidades que mostra onde é o ponto de partida/origem de replicação, que será reconhecido) e um conjunto de sítios de ligação para uma proteína (DnaA) que promove a deselicoidização do duplex. - Eucariotos: S-Cdk inicia a replicação do DNA e auxilia a prevenir a “rerreplicação” (antes de terminar o processo anterior). Complexos de reconhecimento da origem são proteínas que reconhecem e sinalizam para ocorrer a replicação formando complexo pré-replicativo (fosforilação); S-Cdks atuam em G1 para enviar a célula para a fase S; além da extrema precisão que deve ser o processo de replicação, é necessário que o controle do ciclo celular verifique se a replicação do DNA inicia no momento correto e se ocorre apenas uma vez por ciclo; Cdc6 proteínas regulatórias promovem a ligação de proteínas adicionais para formar o complexo pré-replicativo; S-Cdks acionam a fase S e fosforilam a Cdc6 para evitar outro reconhecimento de ORC. Síntese da fita nova de DNA: incorporação de um nucleotídeo na extremidade 3’OH livre pela enzima. DNA polimerase catalisa a formação de ligações fosfodiéster entre os nucleotídeos ligando a região 3’OH de um com a região 5’P do outro (só sintetiza no sentido 5’ 3’). Baseando-se na fita líder, ocorre a síntese da nova. Síntese do DNA é semidescontínua: se a DNA polimerase só sintetiza no 5’ 3’, devido à natureza da polaridade invertida do DNA, a síntese de uma das fitas é continua (líder; sintetizada continuamente no sentido 5’ 3’ em direção ao movimento do garfo de replicação) enquanto a da outra fita é descontínua (retardada/lenta; sintetizada no sentido 5’ 3’ em direção oposta ao movimento do garfo de replicação, adicionando aminoácidos). Os pequenos fragmentos só podem ser sintetizados após movimento do garfo sobre uma extensão razoável da hélice, implicando sempre em um atraso em relação à fita líder. Ocorre 3 adição de primers (iniciador, pela DNA primase) na fita contínua; na descontínua ocorre adição de primers e DNA polimerase alternadamente. Crescimento da fita lenta: em 1968, Reiji Okazaki explicou a incompatibilidade aparente entre a replicação simultânea das duas fitas antiparalelas e o fato da DNA polimerase só adicionar nucleotídeos no sentido 5’ 3’; existência de fragmentos descontínuos de DNA com 1000 bp a 2000 bp foram denominados Fragmentos de Okasaki. São unidos posteriormente por uma enzima específica formando a longa cadeia do DNA. Principais enzimas envolvidas na Replicação do DNA: a complexidade do processo requer inúmeras proteínas com funções específicas, que podem estar trabalhando ou não ao mesmo tempo. DNA-Helicases: após reconhecimento do início da replicação, auxiliam na abertura da dupla hélice do DNA separando as fitas em até 1000 pares de nucleotídeos por segundo; promovem o rompimento das pontes de hidrogênio deselicoidizando o DNA na presença de ATP; duas enzimas podem trabalhar em conjunto, uma na fita líder e outra na fita lenta. Ex. DnaB em E. coli (só na fita líder ou só na lenta). Proteínas SSB (single-strand binding): proteínas de ligação à fita simples do DNA, proteínas de ligação unifilamentar ou proteínas desestabilizadoras de hélice; ligam-se fortemente de forma cooperativa às fitas simples do DNA (sem encobrir as bases), estabilizando a conformação distorcida e prevenindo a formação do dupléx. Protege a modificação por radicais livres (pró-oxidantes) ou erros no processo de replicação, por exemplo. Primase: sintetiza os primers/RNA iniciadores; a DNA polimerase podeampliar a cadeia mas não pode começar uma cadeia; a síntese deve ser iniciada a partir de um curto oligonucleotídeo que gera um segmento dupléx; capaz de sintetizar pequenos fragmentos de RNA complementares a uma região específica do DNA (RNA iniciadores ou primers); sintetiza o primer deixando uma extremidade 3’-OH livre disponível para a DNA polimerase alongar a cadeia. Na fita líder apenas um primer é preciso no início da replicação e na fita lenta cada vez que a DNA polímerase completa um fragmento de Okasaki, um novo primer é adicionado. Eucariotos possuem primers com 10 nt (nucleotídeos), e na fita descontínua são produzidos em intervalos de 100 a 200 nt. E. coli possui primers com 50 a 60 nt; em E. coli a primase está ligada a helicase e outras proteínas formando um complexo com o DNA molde denominado Primossomo. DNA polimerase: descoberta em 1957 por Arthur Kornberg; enzima que catalisa a reação de replicação do DNA; sintetiza a nova cadeia, movendo-se no DNA molde no sentido 5’ 3’; catalisa a formação de ligações fosfodiéster entre os nucleotídeos ligando a região 3’OH de um com a região 5’P do outro. - Procariotos (E. coli): DNA polimerase I tem três atividades, sendo polimerase (catalisa o crescimento da cadeia no sentido 5’ 3’), exonuclease 5’ 3’ (apara o DNA, promove a excisão dos primers e polimerização) e exonuclease 3’ 5’ (remove bases pareadas erradas); DNA polimerase II para reparo do DNA; DNA polimerase III sendo principal enzima de polimerização (forma holoenzima Pol I e mais 20 subunidades); DNA polimerase IV e V para reparo do DNA (descobertas recentemente). - Eucariotos: identificadas pelo menos 15 DNA polimerases diferentes; denominadas α, β, γ, δ, ε, κ, ξ, η, θ, κ, λ, μ, σ, ϕ e Rev1. Polimerases α e δ: funções similares a Polimerase I da E. coli. Polimerase γ: responsável pela replicação do DNA em mitocôndrias. Polimerases β, ε, κ, ζ, η, θ, κ, λ, μ, σ, ϕ e Rev1: reparo do DNA ou têm outras funções metabólicas. Algumas DNA polimerases não têm a atividade de exonuclease 3' → 5'. 4 DNA ligase: Atua unindo os fragmentos de Okasaki. Liga os nucleotídeos catalisando a formação da ligação fosfodiéster entre a extremidade 5’-P de um nucleotídeo e a extremidade 3’-OH do nucleotídeo adjacente. DNA ligase sozinha não tem atividade em rupturas no DNA com perda de um ou mais nucleotídeos. As falhas só podem ser preenchidas e vedadas pela ação combinada de uma DNA polimerase e uma DNA ligase. Topoisomerases: a ação das helicases para abrir as forquilhas de replicação gera torções no DNA circular que precisam ser removidas para permitir que a replicação continue. Desfazem as torções do DNA gerado pelo desenovelamento do DNA pela DnaB (helicase); removem laçadas no DNA. Tipo I provoca uma quebra unifilamentar (uma fita) no DNA (ex. Topo I e Topo III em E. coli); Tipo II provoca uma quebra em ambos os filamentos do DNA (ex. DNA girase em E. coli). - Replicação nas pontas dos cromossomos: na fita contínua a replicação estende-se até as pontas dos cromossomos; na fita descontínua, no final, um trecho fica sem primer. Em eucariotos existem sequencias especiais de nucleotídeos nos telômeros que atraem telomerase; em humanos a sequência é GGGTTA (cerca de 10 mil nucleotídeos). Telomerases (em eucariotos): adiciona as unidades repetidas às pontas dos cromossomos; faz com que não diminua-se o tamanho dos telômeros e não perca a especificidade; leva uma pequena molécula de RNA que atua como um molde para a polimerização na extremidade telomérica 3’OH; é membro de uma classe de enzimas das transcriptases reversas (que sintetizam DNA a partir de RNA).
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