Técnicas Sorológicas para Diagnóstico de Arboviroses

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UNIVERSIDADE DO GRANDE RIO “PROF. JOSÉ DE SOUZA HERDY” – 
UNIVERSIDADE UNIGRANRIO ESCOLA DE CIÊNCIAS DA SAÚDE CURSO 
BACHARELADO EM BIOMEDICINA 
 
 
 
 
 
CAROLINE ROCHA DA SILVA SOARES 
6501399 
 
 
 
 
 TÉCNICAS SOROLÓGICAS APLICADAS AO DIAGNÓSTICOS DAS ABORVIROSES: 
DENGUE, FEBRE AMARELA, ZIKA E CHIKUNGUNYA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nova Iguaçu – Rj 
Junho de 2021 
 
 
 
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CAROLINE ROCHA DA SILVA SOARES 
 
 
 
 
TÉCNICAS SOROLÓGICAS APLICADAS AO DIAGNÓSTICOS DAS ABORVIROSES: 
DENGUE, FEBRE AMARELA, ZIKA E CHIKUNGUNYA 
 
 
 
 
 
 
 
Trabalho de pesquisa apresentado à Disciplina: 
Fisiopatologia e Análises de doenças I, da 
Universidade do Grande Rio “Prof. José de Souza 
Herdy”, como requisito parcial para a obtenção de 
nota e aprovação na Disciplina: Fisiopatologia e 
Análises de doenças I 
 
Orientadora: DRA. RENATA CRISTINE 
MANFRINATOREIS. 
 
 
 
 
 
Nova Iguaçu – Rj 
Junho de 2021 
 
 
 
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SUMÁRIO 
INTRODUÇÃO............................................................................................4 
SOROLOGIA-ELISA...........................................................................................5 
METODOLOGIA.......................................................................................... 6 
INVESTIGAÇÃO DOS CASOS........................................................................................7 
REFERÊNCIAS............................................................................................8 
 
 
 
 
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Introdução 
O mosquito Aedes aegypti é o transmissor de dengue, zika, chikungunya e febre amarela 
(ciclo urbano). Essas doenças infecciosas transmitidas por insetos são chamadas de 
arboviroses. 
Menor do que os mosquitos comuns, o Aedes aegypti é preto com listras brancas no tronco, na 
cabeça e nas pernas. Suas asas são translúcidas e o ruído que produz é praticamente inaudível 
ao ser humano. Põe seus ovos em recipientes como latas e garrafas vazias, pneus, calhas, 
caixas d’água descobertas, pratos sob vasos de plantas ou qualquer outro objeto que possa 
armazenar água limpa, como a da chuva, por exemplo, e pode procurar ainda criadouros 
naturais, como bromélias, bambus e buracos em árvores. 
É um mosquito urbano, embora tenha sido encontrado na zona rural, onde foram levados em 
recipientes que continham ovos e larvas. Comuns em regiões de clima tropical e subtropical. 
Devido a essas características do mosquito, o controle dessas doenças é um desafio de saúde 
pública. Por isso, todos temos que contribuir para evitar a reprodução do Aedes aegypti. 
 
Dengue 
Aparição no Brasil: século 19 
Principais sintomas: febre alta, dor de cabeça, dores no corpo e articulações, fraqueza, dor 
atrás dos olhos e manchas vermelhas na pele, às vezes com coceira. Pode haver ainda perda 
de peso e vômito e, na forma grave, dor abdominal e sangramento de mucosas 
Transmissão: principalmente pela picada do mosquito Aedes aegypti, mas há registros de 
transmissão vertical (gestante-bebê) e por transfusão de sangue 
 
Zika 
Aparição no Brasil: 2015 
Principais sintomas: dor de cabeça, febre baixa (ou ausente), dores leves nas articulações, 
manchas vermelhas na pele com coceira intensa e vermelhidão nos olhos. Eventualmente, 
também inchaço no corpo, dor de garganta, tosse e vômito 
Transmissão: picada do mosquito Aedes aegypti, transmissão vertical (gestante-bebê) e por 
transfusão de sangue 
 
 
 
 
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Chikungunya 
Aparição no Brasil: 2014 
Principais sintomas: febre alta e abrupta, dores intensas nas articulações dos pés e mãos, além 
de dedos, tornozelos e pulsos. Pode ocorrer ainda dor de cabeça, dores nos músculos e 
manchas vermelhas na pele, com coceira intensa 
Transmissão: pela picada dos mosquitos Aedes aegypti e Aedes albopictus 
 
Febre amarela 
Aparição no Brasil: século 17 
Principais sintomas: início súbito de febres, calafrios, dor de cabeça intensa, dores nas costas, 
dores musculares, vômitos e fraqueza. A doença tem importância epidemiológica por sua 
gravidade clínica e potencial de disseminação. 
Transmissão: pela picada dos mosquitos Aedes aegypti na área urbana e dos 
mosquitos Haemagogus e Sabethes na área rural ou de florestas 
Importante: existe uma vacina bastante segura e eficaz contra a febre amarela distribuída 
gratuitamente nos postos de saúde. Em vários estados brasileiros, essa vacina já faz parte do 
Calendário Nacional de Vacinação. 
 
 
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Sorologia Elisa 
 
O ELISA, método mais empregado nos inquéritos sorológicos, possui diferentes variações 
técnicas, com destaque aqui para o ELISA indireta e o ELISA de captura. No primeiro 
("antigen-coated indirect ELISA"), as microplacas são primariamente revestidas por antígenos 
virais, os quais se ligam às imunoglobulinas específicas (IgM ou IgG), caso presentes no soro; 
após lavagem, os anticorpos ligados serão então detectados por outros anticorpos adicionados 
e conjugados a enzimas, as quais permitirão a reação colorimétrica clássica sobre um 
substrato, medida por espectrometria. Já no ELISA de captura, as microplacas são revestidas 
por anticorpos antiimunoglobulina humana, os quais capturam inicialmente imunoglobulinas 
inespecíficas (IgM ou IgG) do soro do paciente; em seguida, antígenos do vírus de interesse 
são acrescidos e se ligam às imunoglobulinas específicas (IgM ou IgG), caso presentes no 
soro; após lavagem, os antígenos ligados serão, então, detectados por anticorpos do conjugado 
enzimático adicionado, repetindo os passos finais comuns a todas as variedades de ELISA. É 
denominado MAC-ELISA, quando empregado para IgM, e GAC-ELISA, quando para IgG. 
 O teste de neutralização por redução de placas (PRNT) baseia-se na identificação e 
quantificação indireta de anticorpos neutralizantes contra determinado vírus. Foi 
primeiramente descrito na década de 1950, sofrendo aprimoramentos posteriores com a 
adaptação para DENV . A amostra de soro a ser testada é sequencialmente diluída e misturada 
a uma suspensão viral em um tubo ou placa de microtitulação, permitindo a interação in vitro 
entre anticorpos e vírus, sendo posteriormente vertida sobre uma monocamada de células 
suscetíveis. Esta camada é recoberta por um meio semissólido o qual impede o espalhamento 
indiscriminado de vírus. Ao infectar a monocamada celular, cada vírus se replica, produzindo 
placas de lise, as quais podem ser detectadas de diferentes formas, tais como, observação 
microscópica, anticorpos fluorescentes ou corantes específicos. Após usuais 7 dias de 
incubação, as placas são então contadas, comparando-se as amostras testadas com a solução 
de vírus inicial, isto é, livre de anticorpos. Caso haja anticorpos neutralizantes no soro testado, 
ocorrerá consequente redução da 16 quantidade de placas esperadas. Determina-se, assim, a 
porcentagem desta redução, definindo-se um "endpoint" (e.g., 50%, expresso como PRNT50). 
"Endpoints" mais elevados aumentam a especificidade, por outro lado, podem reduzir a 
sensibilidade do teste. Os títulos do PRNT são expressos de acordo com a última diluição do 
soro que atingiu a percentagem desejada de redução na contagem de placas. No caso 
particular da dengue, o teste é capaz de diferenciar anticorpos sorotipo-específicos, ao 
 
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contrário do ELISA e do IH. Além disso, por se correlacionar bem com proteção, tem sido 
empregado em estudos de desenvolvimento de vacinas, o que motivou esforços da 
Organização Mundial de Saúde para padronizálo. Embora o PRNT seja considerado padrão-
ouro na detecção de anticorpos neutralizantes, existe uma variante do método chamada FRNT 
(do inglês, "Focus Reduction Neutralization Test"), a qual oferece algumas vantagens. Ao 
contrário daquele, este é realizado em microplacas de 96 poços, o que reduz a área de tecido 
celular e o volume de reagentes utilizados, além de possibilitaro uso de pipetas multicanais e 
automação. Isto aumenta a reprodutibilidade intra- e interensaio, bem como, permite testar 
número maior de amostras em cada ensaio. Ademais, utilizando a técnica imunocolorimétrica 
- baseada no emprego de anticorpos capazes de se ligar ao vírus infectante - possibilita a 
revelação dos "focos" de inoculação e replicação viral em 2 dias, sendo, portanto, de execução 
mais rápida que o PRNT (96). 
 
 
Metodologia 
Para realização de exames para o diagnóstico laboratorial das arboviroses: dengue, zika, febre 
amarela, chikungunya e mayaro, através da detecção dos vírus e/ou de seus componentes (ex. 
genoma viral e antígenos) e ainda, através da pesquisa de anticorpos específicos para os 
referidos agravos. As metodologias utilizadas são: • Enzimaimunoensaio (ELISA); • 
Isolamento viral; • RT-PCR. Para cada agravo investigado, diferentes métodos são utilizados, 
dentre estes métodos estão as técnicas de detecção de IgM (Dengue, Febre Amarela, Zika, 
Chikungunya e Mayaro), detecção de antígeno NS1 (Dengue), Isolamento Viral (Dengue e 
Febre Amarela) e detecção de genoma viral por RT-PCR em tempo real (Dengue, Febre 
Amarela, Zika, Chikungunya e Mayaro). O Gerenciador de Ambiente Laboratorial (GAL) é o 
sistema informatizado utilizado em todos os procedimentos relacionados ao diagnóstico 
laboratorial, desde o cadastro, que deve ser realizado pela unidade solicitante, até os 
resultados que são disponibilizados ao laboratório. O GAL está implantado em todos os 
municípios do Estado e em todas as Regiões de Saúdes que dão suporte técnico aos 
municípios, garantindo assim, que os solicitantes tenham acesso aos resultados laboratoriais 
de forma oportuna. 
 
 
 
 
 
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Investigação dos casos 
 
Investigação de casos suspeitos de Dengue: 
 
- A pesquisa de anticorpos IgM para Dengue (ELISA IgM / MAC-ELISA IgM) é o exame 
preferencial para o diagnóstico de Dengue, realizada em amostras coletadas do 7º ao 30º dia 
do início dos sintomas. 
 
- Os exames de ELISA IgM serão confirmados por MAC-ELISA para finalização do 
diagnóstico. 
- O LACEN-CEVS disponibiliza quatro metodologias que compõem a pesquisa (ELISA NS1 
/ PCR em Tempo Real / ELISA IgM / MAC-ELISA IgM), sendo realizadas de acordo com a 
data de início dos sintomas e data de coleta da amostra. 
 
- As metodologias ELISA NS1 e PCR em Tempo Real são utilizadas para Vigilância 
Virológica – Identificação Viral e para casos graves de pacientes internados, em amostra. 
 
 
Investigação de casos suspeitos de Chikungunya: 
 
- O LACEN-CEVS disponibiliza três metodologias (ELISA IgM / ELISA IgG / RTPCR em 
Tempo Real), sendo realizadas de acordo com a DATA DE INÍCIO DOS SINTOMAS e DATA 
DE COLETA da amostra. 
 
- A pesquisa do vírus Chikungunya por RT-PCR em tempo Real é o exame preferencial para o 
diagnóstico de Chikungunya, realizada em AMOSTRAS COLETADAS até o 8º DIA DO 
INÍCIO DOS SINTOMAS. 
 
- A pesquisa de anticorpos IgM será realizada em amostras coletadas do 9º dia de febre ao 30º 
dia de doença. Em casos de IgM Reagentes as amostras serão enviadas ao Laboratório de 
Referência para confirmação por MACELISA, conforme estabelecido pela CGLAB /SVS. 
 
- Exames de ELISA IgG para Chikungunya serão realizados das amostras coletadas a partir do 
30º dia de sintomas. Coletar amostra de soro: 5 a 10 ml de sangue em tubo com gel separador, 
 
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centrifugar, identificar (nome paciente, data da coleta, material, município e agravo); refrigerar 
e enviar ao lacen-cevs em até 15 dias a partir da coleta. 
 
Investigação de casos suspeitos de Zika Vírus: 
 
- A pesquisa do vírus Zika por RT-qPCR em tempo Real é o exame preferencial para o 
diagnóstico de Zika realizada em AMOSTRAS DE SORO, COLETADAS DO 1º DIA DE 
FEBRE AO 5º DIA DO INÍCIO DOS SINTOMAS. 
- Coletar amostra de soro: 5 a 10 ml de sangue em tubo com gel separador, centrifugar, 
identificar (NOME PACIENTE, DATA DA COLETA, MATERIAL, MUNICÍPIO e 
AGRAVO); refrigerar e enviar ao LACEN-CEVS em até 15 dias a partir da coleta. 
 
Investigação de casos suspeitos de Febre Amarela: 
 
- A pesquisa de anticorpos IgM para Febre Amarela por MAC-ELISA IgM realizado no 
LACEN-CEVS, é o exame preferencial para o diagnóstico de Febre Amarela, em amostras 
coletadas do 7º ao 30º dia do início dos sintomas. 
 
- Coletar amostra de soro: 5 a 10 ml de sangue em tubo com gel separador, centrifugar, 
identificar (nome paciente, data da coleta, material, município e agravo); refrigerar e enviar ao 
lacen-cevs em até 15 dias a partir da coleta. 
 
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REFERÊNCIA 
http://unimed.coop.br/portalunimed/cartilhas/o-que-sao-arboviroses/index.html 
https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/27442/2/bernardo_wittlin_ioc_mest_2018.pdf 
https://cevs.rs.gov.br/upload/arquivos/201708/23101042-instrucoes-para-o-diagnostico-
laboratorial-de-dengue-zika-chikugunya-e-febre-amarela-2017.pdf