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Genética Médica Prática Carollayne Mendonça Rocha – TXXXIX Dia: 18/08/2020 Técnicas básicas de biologia molecular: Extração do DNA pelo método caseiro ➢ Introdução A extração de DNA inclui basicamente dois procedimentos principais: a lise das células presentes na amostra e a purificação do DNA. Após a lise das células, o DNA deve ser separado dos restos celulares e das proteínas, precipitado e suspenso em volume adequado de água ultra-pura ou soluções-tampão adequadas. As amostras de DNA podem também ser submetidas a processos de concentração e de purificação, com a finalidade de se obter melhores resultados nas amplificações. Para cada tipo de amostra, vários protocolos podem ser testados, adaptados e otimizados, de maneira a se conseguir DNA de boa qualidade. ➢ Objetivo Extrair DNA pelo método “caseiro” ➢ Material • Uma fruta (Ex: tomate, banana ou morango) • Água (equivalente à um copo) • Recipiente para colocar gelo (pode ser pote, bacia...) • 3 copos (vidro ou plástico) • 1 copo de vidro ou qualquer outro recipiente que seja transparente. • Sal (4 g equivalente a 4 colheres de café) • Detergente comercial (6 mL, equivalente à 1 colher de sopa) • Etanol 96% ou 92% (álcool etílico comercial), preferencialmente. Se não encontrar ou não tiver, pode ser o 70% (Liquído) • Faca • Colher • Filtro de café • Suporte para filtro de café • Gelo (4 a 5 bandejas) (Ou poderá usar o freezer) • Mixer ou liquidificador • Água quente (Esquente água em uma panela, esta panela deverá caber um copo dentro) ➢ Procedimentos ATENÇÃO: Para o experimento dar certo, o álcool precisa estar gelado, portanto, coloque o álcool no Freezer com antecedência (Você pode colocar um pouquinho em um outro recipiente e colocar no freezer). 1. Picar a fruta (ex: o tomate) com uma faca e depois triturá-lo, utilizando o liquidificador (adicionar um pouco de água para facilitar a trituração). Colocar a mistura em um copo. Observação: bater no liquidificador – quebra a parede celular, já que é um vegetal. 2. Em um copo, preparar a solução de lise: detergente + sal, completando o volume com um pouquinho de água. Observação: o detergente rompe a membrana fosfolipídica. O detergente quebra gordura, que é a composição da membrana. Observação: sal tem carga +1 e o DNA carga negativa, assim, acontece uma reação de neutralização entre o sal e o DNA, é como se o sal puxasse o DNA, separando-o dos restos celulares. 3. Adicionar a solução de lise ao copo contendo o tomate triturado. 4. Homogeneizar a solução de lise com a polpa de tomate e colocar na panela com água quente por 10min. Cuidando para que a solução não entre em fervura. Observação: o banho maria otimiza o processo, funcionando como um catalisador. 5. Preparar um banho de gelo em uma bandeja (você pode usar o freezer ou congelador). 6. Após os 10min de banho-maria, transferir o béquer para o banho de gelo por um período de 5min. Observação: colocar no freezer causa um choque térmico para estabilizar e interromper o processo de catalisação. 7. Utilizar o suporte e filtro de café para filtrar a mistura. Observação: o filtro é utilizado para retirar os restos celulares. 8. Adicionar aos poucos o álcool gelado na mistura, com cuidado e delicadamente. Observação: o álcool tenta puxar o DNA, tem densidade diferente (o DNA tem densidade menor, por isso fica na superfície). Auxilia na separação do DNA restante da solução, por isso a importância do álcool, uma vez que o DNA é pouco solúvel nele e sofre um processo de desidratação, deixando as moléculas mais desidratadas. 9. Durante a adição do etanol, observar atentamente o que ocorre no tubo. No final é possível ver 3 camadas: 1. Mais fundo: restos celulares 2. Camada transparente: álcool 3. Camada entre as duas: DNA, parece uma nuvem ➢ Perguntas 1. O processo de extração de DNA envolve, a princípio, dois procedimentos básicos. Quais são eles? Descreva detalhadamente cada um deles. 2. Em relação à extração de DNA “caseiro”, por que o tomate ou a cebola devem ser picados? 3. Porque é necessário incubar as amostras em banho Maria? 4. Porque utilizar o álcool na extração de DNA? 5. Qual é a função do detergente para extrair DNA? 6. Pesquise um método de extração de DNA de sangue e descreva suas etapas. Explique o porquê de realizar cada etapa. 7. Quais as formas de avaliar se o DNA foi extraído? ➢ Referências: OLIVEIRA, M. C. S.; REGITANO, L. C. A.; ROESE, A. D. et al. Fundamentos teórico-práticos e protocolos de extração e de amplificação de DNA por meio de reação em cadeia da polimerase. São Carlos: Embrapa Pecuária Sudeste, 2007. 43 p. SILVA, L.E; SILVA, D.B.S; CRISPIM, B.A; VAINI, J. O; GRISOLIA, A.B; SENO, L.O. Variação de concentração de proteinase k em protocolos de extração de DNA de bovino. Archives of Veterinary Science, v.18, n.2, 2013. Segundo bimestre
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