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Genética Médica Teórica Carollayne Mendonça Rocha - TXXXIX Dia: 12/08/2020 Introdução à genética médica ➢ Introdução: A ‘’genética’’ equivale à palavra ‘’hereditariedade’’, que é ‘’passado’’, ‘’transmitido’’. A genética é conceituada como a ‘’Ciência que estuda os genes, seu funcionamento, os mecanismos através dos quais os traços biológicos são transmitidos para geração e expressos em um indivíduo’’ (FEETHAMS and WILLIANMS, 2004). Os genes são a fonte de variabilidade. Basicamente a genética se resume em: genótipo + ambiente = fenótipo e tudo equivale a hereditariedade. ➢ Qual é a contribuição da genética e biologia molecular na formação do médico? O enfoque da biologia molecular: doenças genéticas e/ou doenças crônicas; expressão do gene; marcadores moleculares, manipulação genética, terapias gênicas, etc. ✓ Intervenção ✓ Tratamento ✓ Manipulação genética • Contribuição: ✓ Clínica, pesquisa e ensino ✓ Transformação do conhecimento em benefícios para populações A genética médica é uma das especialidades da medicina; independente da área, vamos nos deparar com pacientes que possuem doenças genéticas, doenças crônicas que são de origem genética; principalmente, o oncologista, é bem provável ter que entender sobre terapias gênicas; o conhecimento sobre marcadores moleculares é importante, pois são eles que são avaliados em exames genéticos para doenças multifatoriais, que são doenças que tem influência da genética e do ambiente. Exemplos de doenças multifatoriais: ➢ Histórico - resumo A genética é algo que está há muito tempo na vida do ser humano, tudo isso começou de forma empírica, as pessoas olhavam para as coisas, para o ambiente e começam a imaginar o cruzamento entre os animais. Com essa manipulação empírica, eles começaram a perceber que isso poderia trazer vantagem para o ser humano. • Alzheimer • Mal formações congênitas • Cardiopatias congênitas • Obesidade • Diabetes Mellitus • Hipertensão arterial Na época não se sabia que essas vantagens eram algo que tinha fundamento na genética, mas com o passar do tempo, foi possível identificar esses padrões e fatores que são herdados. Isso foi identificados a partir de Mendel, ele foi um monge austríaco que popularizou as leis de Mendel. Ele era um matemático, cientista, muito curioso, que passou grande tempo da sua vida se dedicando a essas coisas que na época não se sabia o que eram esses fatores transmitidos. Mendel fez muitos experimentos e um deles foi com uma planta, que foi a ervilha devido ao seu acelerado crescimento. Ele avaliou 7 características da ervilha: cor da pétala, a semente, tamanho da plantas, folhas... mas o que ficou mais popular foi o experimento das sementes, que ele avaliou primeiramente a cor e depois a forma. Então no primeiro experimento, ele fez um cruzamento parental e descobriu que as sementes produzidas eram idênticas (observação: ervilha faz auto-fecundação), para isso ele deu o nome de ‘’puro’’, esses indivíduos eram geneticamente semelhantes, mas ele não sabia muito bem o que estava acontecendo. Então, ele decidiu fazer o cruzamento entre cores diferentes e percebeu que a cor amarela predominava sobre a cor verde, então ele deu o nome pra isso de dominância – ‘’a cor amarela domina a cor verde’’. Ele conseguiu identificar padrão de repetição pra isso, a cada 4 sementes, 3 eram amarelas e uma era verde, com isso, ele postulou a primeira lei de Mendel, que é a lei da segregação. Uma caraterística é condicionada por um par de fatores, até então não se sabia o que era esse fator, com o tempo se descobriu que esse fator era os nossos genes. Mendel começou a avaliar mais fatores, então decidiu fazer cruzamento entra cores e formas diferentes: ervilhas amarelas lisas com verdes rugosas – percebendo que as ervilhas amarelas predominavam, porém, quando ele fez a auto-fecundação, produziu ervilhas de diferentes formas e cores, todas as formas e todas as cores possíveis, amarela e verde, lisa e rugosa – postulando assim, a segunda lei de Mendel, que é a lei da segregação independente, que fala que os fatores se segregam independentemente das características. O que essa lei de Mendel equivale hoje? Na primeira lei, descobriu-se que existiam genes; a segunda lei, descobriu-se que esses genes são passados de geração em geração de forma independente - meiose! A segunda lei de Mendel fala exatamente do princípio básico da meiose. Na meiose, exatamente na prófase I, na fase diplóteno, acontece um processo que chama crossing over, ou permutação, que é um processo onde fragmentos do nosso DNA, do nosso cromossomo, trocam-se entre as cromátides, então, Mendel descobriu na segunda lei que nossos genes se separavam e eram passados para os nossos descendentes de forma independente. Com o passar do tempo, o microscópio óptico foi aperfeiçoado – ele foi desenvolvido ANTES de Mendel, mas foi aperfeiçoado DEPOIS de Mendel – esse microscópio foi desenvolvido para que se pudesse visualizar o que tinha dentro da célula, antes era possível ver protozoários, algumas bactérias, ..., mas dentro da bactéria, tem organelas, DNA, .., sendo assim, ele foi aperfeiçoado para que fosse possível se ver isso, e quando aconteceu, percebeu-se que em algumas células eucarióticas, existia uma outra estrutura que também era muito grande, muito significativa, essa estrutura era o núcleo e dentro do núcleo era possível ver uma massa. Com o tempo eles conseguiram visualizar uma estrutura que se assemelhava a um X, dentro do núcleo, e então isso passou a ser chamado de material genético, de DNA. A forma cromossômica é a forma que o nosso DNA está na maior parte do tempo. Com o passar do tempo eles começaram a perceber que isso desaparecia e que fazia parte de uma estrutura um pouco menor – essas estrutura era o DNA, mas eles queriam saber melhor o que era. Com o tempo, através de alguns estudos, mais especificamente de fração de raio-X, um grupo de 4 pesquisadores, eles descobriram a estrutura helicoidal (estrutura de dupla hélice) do DNA, e dentro dessa estrutura, existiam moléculas um pouco menores, que eram os nucleotídeos, que são constituídos de bases nitrogenadas, uma pentose e um grupamento fosfato. Isso foi o BOOM da genética – a descoberta da estrutura do DNA. Foi o que deu a possibilidade de se começar o sequenciamento dos genomas. O que é o sequenciamento? É a visualização , a descoberta, a identificação da posição das bases nitrogenadas, então, através do sequenciamento, consegue-se identificar exatamente qual base nitrogenada e qual sua posição no genoma. Então, essa descoberta da estrutura do DNA, trouxe a possibilidade do sequenciamento. A partir do sequenciamento foi possível fazer manipulação genética – exemplo: ovelha Dolly – ela foi um marco na história da genética e da biologia molecular, pois foi o primeiro animal a ser clonado. Então, com o sequenciamento conseguiu se fazer clonagem, organismos geneticamente modificados, transgênicos e também: Conseguiu manipular o ser humano. ➢ Alguns fatos • 1997 – Nascimento da ovelha Dolly • 2000 – Projeto genoma humano (rascunho) e término em abril de 2003 (teve início em 1990) • 2003 – 2020? O que está acontecendo? Terapias gênicas, fertilização in vitro, farmacogenética. Uma técnica muito utilizada hoje em dia é a CRISPR. CRISPR – é uma técnica que já vem sendo utilizada há certo tempo, mas de 5 anos para cá é o BOOM – é o futuro. É basicamente uma técnica de biologia molecular que é utilizada para editar o genoma, ela é muito precisa. Ela consegue fazer edição de pequenos e grandes fragmentos de maneira rápida e barata. O problema é ser apto ao utilizá-la, e no mercado, esse profissional é caro. Há dois anos atrás, um chinês apresentou em um congresso internacional os resultados da sua pesquisa. O que ele fez? Pegou embriões, editou e fez a implantaçãode um útero, esses embriões nasceram. Qual era o objetivo dele com essa edição? O HIV é uma doença sexualmente transmissível, existe uma mutação, um determinado gene, que faz com que as pessoas fiquem imunes ao vírus HIV, mas a quantidade de pessoas que possui esse gene é muito pequeno. Sabendo dessa informação, o chinês pensou em reproduzir essa mutação em um embrião, ele produziu e reproduziu essa mutação em dois embriões através da técnica de CRISPR – falando de forma mais simples: ele pegou o embrião, coletou as células, fez uma manipulação, produziu a mutação, voltou as células para o embrião, implantou o embrião no útero e esses embriões nasceram imunes ao HIV. Nosso genoma é dinâmico, se mexer em um canto, vai refletir em outro – esses bebês tiveram alterações no cérebro. Isso envolve muitas questões éticas! Ele não podia ter feito isso – existe convenção internacional que proíbe fazer manipulação genética em embriões, e além dessa convenção, existem as leis que regem o próprio país – ele fez sem aprovação e foi preso e obrigado a pagar uma multa milionária, hoje cumpre prisão domiciliar. ➢ Presente e futuro • Edição genética em adultos com mutações únicas causais (CRISPR/Cas9). Ex: edição do gene da beta-hemoglobina (anemia falciforme...). Hoje em dia NÃO pode fazer edição em embrião, porque quando se faz edição em embrião, isso é passado de geração em geração, a edição é feita nas células germinativas. Mas podem-se fazer manipulações em células somáticas, e está acontecendo atualmente. Existem pessoas hoje que foram editadas para não desenvolverem anemia falciforme – é uma forma de tratamento. Obs: a anemia falciforme é uma ÚNICA mutação, um único gene, por exemplo: era uma adenina e ela trocou por uma timina, então, teoricamente é fácil de se manipular. • Reprogramação de células por meio da tecnologia CRISPR/Cas9 para tratamento do câncer. Principalmente nos que são de origem sanguínea, é possível fazer a reprogramação de células cancerígenas, transformá-las em células saudáveis e inserir de novo no paciente. • Vacinas comestíveis (DNA-recombinante e CRISPR/Cas9). Ex: Austrália, criaram tabaco com genes do vírus do sarampo. Próximo passo é criar alface com sequências do vírus do sarampo que estimulem a formação de anticorpos – poderia gerar uma proteção imunológica mais eficiente. Tabaco pode ser utilizado como planta modelo. Muita gente tem alergia às técnicas utilizadas para a produção de vacina, principalmente aquelas que são produzidas com proteínas dos ovos; muita gente tem pavor de agulha – então, eles estão criando as vacinas comestíveis para minimizar essas coisas. • Vacina contra o SARS-COV-2 (DNA-recombinante e CRISPR/Cas9): EUA, China, Brasil, ... • Genômica: painéis de genotipagem. Ex: Pré-disposição ao câncer de mama e ovário. Todos os nossos cromossomas, tudo o que está dentro do núcleo, é chamado de genoma. Como utilizar isso a favor da medicina? Existem painéis de genotipagem, onde são colocadas informações de todas as mutações que tem em nosso corpo e através deles, é possível fazer exames para identificar por exemplo, a pré-disposição ao câncer. • Diagnóstico genético pré-implantacional e ‘’edição de embriões’’. São exames para identificar se esses embriões tem alguma alteração genética. • Epigenética e epigenômica. Funcionam como uma reprogramação do genoma – por exemplo em doenças como a obesidade: é possível reprogramar, muitas vezes através de alimentação, exercícios físicos e através de intervenção como técnicas moleculares. “Se você quer ser diferente e fazer a diferença, você tem que trabalhar diferente e com metodologias diferentes” ~Herbert Alexandre Galdino Pereira. Genética Médica • 1983 – especialidade médica pelo Conselho Federal de Medicina. • 1986 – Fundação da Sociedade Brasileira de Genética Médica. • Atendimento Clínico. • Realização de exames de diagnóstico laboratorial. • Pesquisa de causas e padrões de herança de doenças genéticas. ➢ Exemplos: • Defeitos congênitos e dismorfologia. • Síndromes teratogênicas. • Erros inatos do metabolismo. • Displasias esqueléticas. • Câncer. • Síndromes neurogenéticas. • Síndromes hematogenéticas. • Entre outras. ➢ Carreira em Genética Médica • Rio de Janeiro: Hospital Universiátio Gaffrée e Guinle – UNIRIO e Instituto Nacional de Saúde da Mulher, da Criança e do Adolescente Fernandes Figueira – Fiocruz. • São Paulo: Hospital das Clínicas da Faculdade de Ciências Médicas – UNICAMP. o Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP. o Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo – FMUSP. o Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP. ➢ Prática Clínica • Encaminhamentos para ambulatórios de Genética: ✓ Aconselhamento: pediátricos, adultos ou combinados. ✓ Pré-natal: riscos gestacionais. ✓ Multidisciplinares que incluem: geneticista, médico especialista. ➢ De que forma o estudo genético pode contribuir na prevenção e controle de doenças? • Estudo de genes. • Estudo de cromossomos. • Estudo do genoma. • Estudos metabólicos. ➢ Testes de diagnósticos (com sintomas) / Testes preditivos (sem sintomas) • Testes moleculares simples: teste do pezinho, outros específicos. • Sequenciamento completo. • Sequenciamento do Exoma: 20 mil genes, suspeita de doenças genéticas existentes. • Painéis genéticos: estima o risco de uma doença futura. • Painéis de portadores: estimam os riscos de transmitir doenças genéticas hereditárias. • Diagnóstico genético pré-implantacional (PGD) e screening genético pré-implantacional (PGS): identificar os embriões livres de doenças genéticas e cromossômicas. • Amniocentese e a biópsia corial (ambos invasivos), e o teste pré-natal não invasivo (NIPT ou NACE): pré-natal, anomalias cromossômicas (Síndrome de Down). ➢ Tratamentos: • Terapia gênica. • Medicamentos biológicos. • Transplantes. Dia: 19/08/2020 Conceitos ➢ Transmissão de informação genética ➢ Cromossomo e cromatina Em determinados momentos o cromossomo fica menos enovelado e adquire a forma de cromatina. A função da cromatina é basicamente atuar na expressão dos nossos genes, na regulação dos nossos genes. Porque quando nosso DNA está muito condensado, em forma de cromossomo, não é possível outras proteínas atuarem no processo de transcrição dos nossos genes. Além disso, é na fase de cromatina que acontece a nossa replicação – então temos 2 processos envolvidos, a replicação e a transcrição - e isso só acontece quando nosso DNA está em forma de cromatina, mais especificamente na fase de eucromatina, onde está menos condensado. ➢ DNA – Ácido desoxirribonucleico O DNA é constituído por nucleotídeos, esses nucleotídeos fazem ligações entre eles e essas ligações são chamadas ligações de hidrogênio, elas podem ser tanto duplas quanto triplas. Então tem 3 componentes: a base nitrogenada, o grupamentos fosfato e a pentose. Existe, além das ligações de hidrogênio, as ligações glicosídicas. O sentido do DNA é sempre 5’ – 3’ devido a posição do carbono livre. Quais são as bases nitrogenadas? Timina e adenina, citosina e guanina. A timina liga-se com a adenina através de ligações duplas e a citosina liga-se com a guanina através de ligações triplas. Existem alguns tipos de DNA – já foram identificados 5 tipos de DNA. O DNA B é o comum, ele tem a dupla hélice e é dextrogira (gira para o lado direito) e ele tem toda uma característica estrutural de tamanho, de voltas e tudo mais. Cada um dos tipos de DNA tem uma função específica em determinada situação que a célula precisa. DNA A – é possível identificar ele em amostras desidratadas. Ele também é dextrogiro, mas ele tem um achatamento maior que o DNA B, isso traz uma maior estabilidade. É raro. DNA Z – também é raro, ele é igual o DNA B, mas ele é levogiro. Ele está relacionado aosprocessos de transcrição dos genes. DNA triplo – um brasileiro (USP) ajudou a desvendar a tripla hélice do DNA. A tripla hélice também está relacionada com a transcrição, ele é basicamente o DNA B e tem RNA, que é rico em timina e adenosina, ele adentra a estrutura da dupla hélice e ajuda na transcrição. Existem também outros DNAs, que são sintéticos – E, H, L, P são DNAs sintetizados em laboratório. ➢ Pesquisadores descobrem DNA em forma de hélice quádrupla em seres humanos A fita quádrupla forma loops, entre os loops acontecem algumas ligações que são estabilizadas por íons. Essa estrutura está principalmente envolvida na divisão celular, mais especificamente na replicação. ➢ RNA – Ácido ribonucleico A principal diferença é que o RNA tem uma hidroxila e também a questão da troca da timina por uma uracila e a terceira diferença é que é uma fita única. Tem ligações fosfodiéster, que é entre o fosfato e a pentose, mas não tem a ligação de hidrogênio, porque é uma fita única e tem também as ligações glicosídicas. ➢ Classificação dos RNAs Basicamente, temos 3 tipos de RNAs, que são os que mais estudamos (não vamos classificá-los como principais), que é o RNAm, que está envolvido no processo de transcrição dos genes; o RNAt e o RNAr que estão envolvidos no processo de tradução. Existem outros tipos de RNA: Dividido em RNA codificador, é o mensageiro (coding RNA), que depois vai ser traduzido para proteína. A outra classificação é não codificadora, é o transportador, o ribossômico, o RNA de interferência (tem função principalmente de edição genética – usado como uma técnica para fazer por exemplo uma edição genética) e também os RNAs longos não codificadores – tanto o RNAi quanto o RNAlnc estão relacionados com processo de regulação genética. Tem também os pequenos RNAs (RNAsn). Tem uma infinidade de outros tipos de RNA, que atuam principalmente no processo de regulação genética. O micro RNA está diretamente relacionado à expressão de genes e eles estão classificados dentro dos pequenos RNAs. Existem os RNAs circulares, que também se relaciona principalmente à regulação genética. ➢ Genes Dentro da dupla hélice tem os genes. Conjunto de bases nitrogenadas unidas entre si, que podem ou não serem transcritos, que podem ou não serem traduzidos para proteínas. O gene pode ser transcrito ou não – ele tem uma estrutura gênica, mas no dia a dia ele não é transcrito. O gene: a região de 5’ é chamada de promotor, então essa região é onde a RNA polimerase se acopla e faz o processo de transcrição do gene. Promotor é onde tudo se inicia, é o início do gene, os exons são as regiões codificadoras, somente os exons vão virar proteínas, e temos os introns, que são regiões não codificadoras e, finalizando, temos a região terminadora, onde tem uma sequência de bases nitrogenadas que se repete e a estrutura termina aí. Armazenamento e transferência de informação – nada mais é que o dogma central da biologia molecular – replicação, transcrição e tradução. ➢ Fatores ambientais que modulam expressão dos genes Muitas das doenças, principalmente as crônicas, além de crônicas, são multifatoriais, isso significa que tem uma influência genética, mas o ambiente também influencia muito. Exemplo: obesidade – uma pessoa que tem histórico de obesidade na família, ela tá na linha, ainda não chegou na obesidade, mas tá quase. Se ela já tem um histórico de obesidade na família, ela já tem o fator genético, tem algumas mutações que conduzem para um maior peso. Apesar de essa pessoa ter o genótipo para obesidade, se fizer acompanhamento médico, nutricional, praticar atividades físicas, no final, ela não vai ter problemas com obesidade. Mas se essa pessoa tem predisposição e não faz acompanhamento médico, se alimenta mal, não faz atividades físicas, é bem provável que ela vai desenvolver a obesidade. Praticamente, o ambiente é o que modula a expressão dos nossos genótipos. Quando se fala de ambientes, não é apenas o ambiente externo, mas também o ambiente dentro das células. Estrutura e função dos genes e do genoma ➢ O que iremos abordar? 1. Estrutura genética e função do genoma humano. a. Projeto Genoma Humano (PGH). b. Estrutura genética e função do genoma. c. Organização gênica. d. Regulação da expressão gênica e sua relevância para a medicina. ➢ Estrutura e função dos genomas ➢ Organização genômica em eucariotos ➢ Genoma (definição) • É a totalidade do material genético de um organismo. (é a conta de todos os nossos cromossomos). • Cromossomos = DNA = Genes . • Sequências não-codificadoras. ➢ Genoma (função) O genoma é transmitido de geração em geração e contém as informações sobre as principais características hereditárias responsáveis de conduzir o desenvolvimento biológico de cada indivíduo. Projetos Genomas ➢ Estrutural • Sequenciamento completo do genoma. • Região gênica e região intergênica. Avalia principalmente onde está cada coisa; quantos cromossomos tem dentro do genoma; onde está cada base nitrogenada... • Funcional • ESTs – Expressed sequence tag. • Regiões que codificam proteínas. • Funções celulares, metabólicas, fisiológicas. Por exemplo: identifica dentro do genoma uma região repetitiva, que tem várias timinas, mas precisar saber porque elas estão ali e para isso existem vários tipos de estudos. • Tamanho de genomas Comparação de genoma com livro. Por exemplo: genoma de um vírus = duas páginas. Genoma humano = 80 livros. • Eucariotos • 3 pg de DNA (10 elevado a -12g) por genoma haploide (n). • Genoma em mamíferos: -3x10 elevado a 9 pares de bases. • -25000 genes. As células animais são diploides, já as plantas são poliploides. • Número de Genes O genoma humano tem aproximadamente 30 mil genes, todos funcionam, todos são iguais, mas os genes funcionam de maneira diferente em pessoas diferentes, justamente pela modulação ambiental. O milho tem 50 mil genes. Essa figura basicamente fala que a quantidade de gene não se relaciona com a complexidade do organismo. Se colocar em linha reta e medir, os 6 cromossomos e os 102, vão resultar em um mesmo tamanho – o que diferencia de um genoma para o outro, é a estrutura. Projeto Genoma Humano (PGH) • Objetivos 1º) Conhecer a sequência de todo o DNA humano composto em torno de 3 bilhões de bases nitrogenadas. (fazer o mapeamento do genoma). 2º) Descobrir e localizar os genes presentes nos cromossomos humanos. A localização destes genes a nível cromossômico é o que constitui o mapa genético dos cromossomos. • 1990 – Fundado por James Watson. • 17 países iniciaram programas de pesquisas sobre o genoma humano. • 2000 – Projeto Genoma Humano (rascunho) e término em abril de 2003. • Atualizações do genoma: NCBI.(é um banco de dados onde são depositadas todas as informações). • https://www.ncbi.nml.nih.gov/genome/?term=human Atualmente é possível sequenciar o genoma humano em horas, é bem fácil e barato. • A descoberta: • Conhecimento: ajudar nas funções dos problemas de saúde. • Preocupação: conhecer uma possível doença futura. • Ética? The Draft Human Genome Sequence. Março de 2000 – Clinton anunciou que sequências humanas não poderiam ser patenteadas e teriam que ser públicas. • Proíbe todas as formas de discriminação, baseadas nas características genéticas. • Para este fim, proclama princípios relacionados a Dignidade Humana E Genoma Humano. • Direitos das Pessoas. • Pesquisa sobre Genoma Humano. • Condições para o exercício de atividade científicas e solidariedades e cooperação internacionais, entre outros. https://www.ncbi.nml.nih.gov/genome/?term=human ➢ Aplicações dos conhecimentos gerados pelo PGH ✓ Teste genético, genômica e terapia gênica. • Molecular ✓ Melhorar o diagnóstico de doenças. ✓ Detectar predisposições genéticas para doenças. ✓ Criar drogas combase em informações moleculares. ✓ Nutrição. ➢ Estrutura e função do genoma humano Genoma (estrutura) O genoma é dividido em genoma nuclear e mitocondrial (herdado das nossas mães). O mitocondrial é muito pequeno e circular; o nuclear é linear. Genoma nuclear: 23 pares de cromossomos (22 pares de cromossomos autossômicos e 1 par de cromossomo sexual): O cariótipo: em uma conferência, os pesquisadores entraram em um consenso e colocaram algumas regras, uma delas é de que o cariótipo é constituído basicamente de cromossomos e a forma como eles são dispostos no cariótipo é de acordo com o tamanho e o tipo de cromossomo. Tem 4 tipos diferentes de cromossomos: os metacêntricos, os submetacêntricos, os telocêntricos e os acrocêntricos. Esses tipos são condicionados pela posição dos centrômeros. O telocêntrico não existe braço P e ele também não existe no genoma humano. A estrutura do cromossomo possui dois braços, o braço P (curto) e o braço Q (longo). O cromossomo 1 é o maior e ele é metacêntrico – o braço P é igual ao Q. O cromossomo 2 é o segundo maior no genoma e é submetacêntrico – o braço P é menor que o Q. • 23 pares de cromossomos. • 22 autossômicos. • 1 sexual (XX ou XY). • 3 bilhões de nucleotídeos (3Gb). • 5% representam 30 mil genes (os outro 95% = regiões não codificadoras). Dia: 26/08/2020 Genoma (estrutura) ➢ Genoma linear (3300Mb) • Sequências Gênicas < 5% o Exons ~ 1.5% (codificante) o Introns ~ 3.5% (não codificante) • Regiões intergênicas > 95% • Sequências repetitivas > 50% (antigamente isso era considerado de DNA lixo) • Famílias gênicas Se apenas 1% do genoma é codificante, qual a probabilidade de uma mutação ao acaso resultar em uma alteração proteica? Exemplo: anemia falciforme – a probabilidade é muito baixa. O genoma circular tem várias cópias por organelas. Alguns desses genes (entre os 13 genes codificadores de polipeptídeos) estão diretamente relacionados com a predisposição à diabetes. Se ocorre uma mutação no início ou no fim do intron, ele não é retirado durante por exemplo, a transcrição do DNA para o RNA, então esse intron se torna um exon, ele vai ser transformado em polipeptídeos, vai ser codificado para aminoácidos e depois transformado em proteína. O genoma nuclear pode ser estudado em 3 níveis: DNA (que a gente chama de genoma), estudar o RNA total (que é todo o RNA que é transcrito naquele momento, chamado de transcriptoma) e estudar as proteínas (a gente chama de proteoma). Genoma, transcriptoma e proteoma a gente chama de ciências ômicas. Além dessas 3, tem por exemplo os estudos metabolômicos, que estudam os metabólitos; fenômica, que é o estudo do fenótipo, ... Isso é muito importante quando falamos de doenças genéticas, porque quando se altera qualquer coisa no genoma, ele segue essa rota (genoma > transcriptoma > proteoma – que é o dogma central da biologia molecular), ou seja, se eu mexi no genoma, vai alterar o transcriptoma, o proteoma e consequentemente a genômica funcional. ➢ Genoma (funcional) Dentro do genoma nuclear, tem um DNA chamado de simples, ele basicamente são os nossos genes, que podem ser codificadores (que se resume nas regiões exônicas) ou pode ser não codificador (que vão ser o pseudogenes ou os introns). ➢ Genes ➢ Pseudogenes Pseudogenes são segmentos de DNA (genes) que perderam pelo menos alguma funcionalidade, em relação ao gene completo, na expressão de genes celulares ou na capacidade de codificação de proteínas. Como outros tipos de DNA não codificante, os segmentos de pseudogenes podem desempenhar funções reguladoras, e alguns têm papéis importantes na fisiologia normal e na patologia. O pseudogene tem estrutura de gene, ou seja, ele tem um promotor, tem exons, introns e região terminadora, só que durante a evolução, aconteceu alguma coisa com esse gene que fez com que ele perdesse a sua funcionalidade. Normalmente, esse pseudogene faz o processo de transcrição mas esse RNA não exerce nenhuma função na célula – teoricamente. Por que teoricamente? Existem trabalhos que estão estudando os pseudogenes e estão os associando a doenças. ➢ DNA espaçador • Antigamente designado de “DNA lixo” • Sem função aparente **Regiões intergênicas podem ter DNA não repetitivo** “Repetitivo” são regiões que se repetem ao longo do genoma, e podem estar diretamente relacionados com a família gênica quando é codificado ➢ Famílias gênicas São genes que estão localizados normalmente em diferentes regiões do meu genoma e que vão codificar uma sequência de polipeptídeos e que ao final, esses diferentes polipeptídeos vão se juntar e formar uma única proteína – é o caso da família das globulinas (que no final de todo o processo vai formar nossas hemácias). Grupo de genes de um genoma que derivam de um ancestral comum Família das globulinas: alfa 1 globulinas, alfa 2 globulinas, beta globulinas e gama globulinas. Esses genes estão localizados em locais diferentes, mas no final vão exercer uma função em comum. Tandem é uma sequência repetitiva. Dispersas são os elementos transponíveis. ➢ Minissatélites São sequências não codificadoras que são chamadas de sequências repetitivas, ou seja, são sequências tandem. • Unidades repetitivas de DNA com 10-100pb (30pb - pares de bases) • Inserções em tandem • Encontrados preferencialmente nas regiões teloméricas (geralmente não transcritas) ------------- Sítio de recombinação homóloga. Por que isso é importante? Porque cada pessoa vai ter um número de repetição. Como que isso acontece? Cada quadradinho é uma repetição dessa sequência de cima. Nesse indivíduo, tem uma repetição de 12 vezes – é isso que traz uma variabilidade para o indivíduo. Normalmente isso é utilizado para identificação de pessoas, de paternidade. ➢ Microssatélites É a mesma coisa do minissatélite, só que menor. STR – Short Tandem Repeats Consistem de pequenas sequências (“sequence motif”) com 1 a 4 nucleotídeos de comprimento, repetidas em tandem. • Mononucleotídeos – uma repetição só. • Dinucleotídeos – duas repetições. • Trinucleotídeos – três repetições. • Tetranucleotídeos – quatro repetições. ✓ Marcadores moleculares – minissatélites e microssatélites são marcadores moleculares, ou seja, uma região do nosso genoma que ele é único para cada pessoa. Ele pode ser usado principalmente para identificação. É possível identificar autor de crime a partir desses marcadores moleculares; também está relacionado a algumas doenças (por exemplo doenças neurodegenerativas). A principal características dos minissatélites e microssatélites é a repetição de bases nitrogenadas. ➢ Elementos transponíveis • São unidades de DNA que se movem dentro dos genomas promovendo variabilidade genética e mutações. • Diretamente relacionado com a evolução. Elementos transponíveis – é uma sequência de DNA que fica andando. Por que ela anda? Em resposta ao que a célula tá precisando naquele momento. ETs podem afetar o genoma: • Aumentando seu tamanho e a variabilidade genética. • Reestruturando a arquitetura genômica. • Causando mutações em genes (ativar ou inativar). • Regulando a expressão gênica. • Originando novos genes (domesticação). **Efeito depende do local de inserção** • Inserção de ET em genes Quando a gente fala de estrutura gênica, temos os exons e os introns, quando o ET se insere dentro de um exon por exemplo, possivelmente ele vai te rum efeito deletério no final, então ele inativa – ele entrou dentro do exon em determinado momento e isso provoca a não transcrição, a não tradução, gerando um efeito deletério. A outra possibilidade é esse ET entrar no intron, quando isso acontece, a gente tem um novo exon. Isso possivelmente vai gerar uma nova proteína totalmente diferente do gene inicial. Isso tudo está diretamente relacionadocom a regulação gênica. Se é irreversível e ele fica ali pra sempre, temos a produção de novos genes, que está diretamente relacionado com evolução. Mas se ele fica entrando e saindo, ele é reversível Algumas doenças infecciosas estão relacionadas com os elementos transponíveis. Por exemplo – uma pessoa deve uma infecção por determinado patógeno e a célula de certa maneira precisa de determinada proteína para ativar o sistema imunológico, essa pessoa não tem essa proteína, mas ela pode produzir um elemento transponível e vir a produzir a proteína que era necessária para a ativação do sistema imunológico, depois que acabou a infecção, tudo isso desmonta. ➢ DNA mitocondrial (funcional) Vídeo aula 2 parte 3 ✓ O que iremos abordar? • Fundamentos da expressão gênica. • Regulação da expressão gênica em procarioto e eucarioto. • Variação na expressão gênica. ➢ Fundamentos da expressão gênica Os diferentes genes do nosso organismo são expressos em uma determinada célula em um dado momento, justamente devido ao alto custo da síntese proteica. A regulação da expressão gênica é bastante essencial para otimizar a utilização da energia disponível que a célula vai ter que providenciar para que isso aconteça. Por que a expressão gênica deve ser regulada? • Adaptação ao ambiente • Diferenciação celular em organismos multicelulares Genes constitutivos – genes que são constantemente expressos. Existem genes que são expressos em todas as células do organismo, que são proteínas essenciais para a manutenção da vida que normalmente estão envolvidas em processos básicos como por exemplo: a replicação, a geração de energia, manutenção do DNA. Genes induzíveis – genes cuja expressão varia de acordo com as condições da célula. São genes que a expressão vai variar de acordo com a condição da célula. Ativadores – ativa a produção de determinada proteína e os repressores vão reprimir isso. A maioria desses repressores e ativadores são RNAs não codificadores ou elementos transponíveis do genoma. Acontece o processo de transcrição através da enzima RNA polimerase 2 porque está transcrevendo um RNAm e tem a produção de transcrito primário, que ocorre apenas a troca da timina pela uracila, depois disso acontece o processamento desse RNA > são tirados os introns dele e sobram só exons, esse processo é chamado de splicing e aí é adicionado a cauda Poli A que é uma sequência de adeninas na posição 3’ e também é adicionado o CAP 5 na extremidade 5’, após isso, o RNA tá maduro, sai do núcleo, vai para o citoplasma e ele é traduzido em proteína – isso é a forma geral de como ocorre todo o processo. ➢ Regulação 1. Sinais que atuam no controle da expressão gênica • Mudanças nutricionais e ambientais • Hormônios o Esteroides – penetram o Peptídeos - receptor 2. Pontos de controle • Ativação de genes • Regulação em de nível de transcrição • Processamento de RNA • Tradução 1. Sinais que atuam no controle da expressão gênica • Mudanças nutricionais e ambientais Se tem uma alimentação saudável, vai fazer com que seus genes se expressem de forma saudável. Já se tem uma alimentação não saudável, pode vir a desenvolver algumas morbidades – por exemplo: obesidade. Exposição aos hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAP) como o benzopireno (presente na fumaça). Vários tipos de câncer: pulmão, mama, fígado. Tudo isso pode causar dano no material genético e levar ao aparecimento de alguma doença • Hormônios o Esteroides – penetram o Peptídeos – receptor O efeito dos hormônios por exemplo o da tireoide – é um exemplo bem conhecido da modulação de proteína que faz parte da regulação em organismos eucarióticos. Esses hormônios interagem pela interação direta com os sinais moleculares. Os hormônios esteroides penetram na célula e eles são hidrofóbicos demais para se dissolverem facilmente no sangue, aí eles são transportados por proteínas carreadoras específicas que faz com que esses hormônios sejam levados do lugar onde eles são liberados até o seu tecido alvo, então, esse hormônio passa através da membrana plasmática por difusão simples e quando ele tá dentro da célula, ele interage com outros tipos de receptores de ligação de esteroide. O complexo hormônio-receptor atua se ligando na sequência de DNA que é altamente específica e isso é chamado de elementos de resposta hormonal, desse maneira, modifica a expressão dos genes – essa atuação nesses sítios, esses receptores atuam como ativadores da transcrição e fazem o recrutamento de co-ativadores da RNA polimerase 2 juntamente com os seus fatores de transcrição associados para iniciar a transcrição do gene. • Hormônios Tipo 2: surge quando o organismo não consegue usar de forma correta a insulina que produz, comum em adultos, está associado a má-alimentação e excesso de peso. Na diabetes tipo 2, o pâncreas vai produzir a insulina, mas o receptor da insulina não vai funcionar, o que faz com que a insulina fique perdida no sangue e consequentemente a glicose não consegue entrar na célula, não podendo ser usada como energia. Como tratamento tem a aplicação da insulina, uso de alguns medicamentos e principalmente o planejamento alimenta e atividade física. • A estenose hepática é causada pelo acúmulo de SREBP-1c (sterol regulatory elemento-binding proteins). • SREBPs > ativa a expressão de aproximadamente 30 genes que se dedicam à síntese e captação de colesterol, ácido graxo, triglicérides e fosfolípides. Insulina > transcrição SRBP-1c Transcrição de genes relacionados ao metabolismo lipídico. • Apesar da presença da resistência à insulina nos tecidos periféricos, a insulina continua a ativar a transcrição do SREBP-1c no fígado em um estudo com camundongos. • O nível elevado de SREBP-1c nuclear aumenta a expressão de genes lipogênicos, a síntese de ácido graxo e o acúmulo de triglicérides. 2. Pontos de controle • Ativação dos genes Quando a célula tá em interfase os cromossomos parecem estar dispersos, mas na verdade eles estão em forma de cromatina e a cromatina pode ser encontrada em duas formas: a heterocromatina e a eurocromatina. A heterocromatina é transcricionalmente inativa – ela é associada às estruturas cromossômicas particulares, por exemplo os centrômeros. A cromatina restante, que é menos condensada, é a eurocromatina. A transcrição de genes eucariotos é bastante reprimida quando o DNA está condensado no interior da heterocromatina, ou seja, não tem a transcrição. A maior parte da eucromatina pode estar ativa na transcrição. A metilação ou a acetilação das histonas – tem papel no processo de ativação e desativação da cromatina. • Epigenética A epigenética é definida como modificações do genoma que são herdadas pelas próximas gerações, mas que não alteram a sequência do DNA. (não é uma mutação). Os principais pontos que são herdados em relação à epigenética, é o modo como o nosso DNA é metilado ou acetilado. Tem a metilação a nível do DNA e a nível das histonas. Quando as histonas estão metiladas, elas estão inativadas e quando não estão metiladas, estão ativadas. A metilação é a adição de um grupo metil no nucleotídeo. Quando não tem a adição do metil, o gene está ativado e quando há essa adição, ele está inativado. Quando tem a acetilação das histonas elas estão inativadas e quando elas estão desacetiladas elas estão ativadas. A acetilação das histonas contribui para a ativação da trasnscrição Histonas acetilases (HAT) acetilam Lys da cauda N-terminal das histonas 1. Reduz a afinidade da histona pelo DNA = afrouxa o nucleossoma. 2. Recrutamento de outros componentes da maquinaria de transcrição. 3. Iniciação da remodelagem da cromatina. • Regulação em nível da transcrição • Iniciação da transcrição ▪ RNA polimerase ▪ Fatores de transcrição ▪ Região promotora▪ Outras sequências reguladoras RNAs polimerases e RNAs celulares A polimerase II é a que atua na transcrição do RNAm que depois vai ser transformado em proteína. No caso de eucariotos a gente tem muitos fatores de transcrição. Cada um tem uma função no processo de transcrição. O promotor – tem sítios de reconhecimento dos fatores de transcrição (em azul), tem outra região que é o TATA box e após ele, tem uma sequência aleatória de DNA que é diferente em cada gene, tem o iniciador ou também chamado de região +1, que é onde o RNA polimerase vai se ligar. Sequência de DNA que dirige a RNA polimerase para o local de iniciação de transcrição. -35 é a região onde os fatores de transcrição se ligam, depois o TATA box, que é uma repetição de T e A, depois tem uma sequência aleatória que é específica para cada gene e após isso tem o sítio de iniciação (normalmente começa por uma adenina ou guanina). ➢ Splicing alterantivo (ou processamento do RNA) Splicing alternativo é o uso alternativo dos exons. Número de proteínas é diferente do número de genes – número de proteínas maior do que o número de genes. Geração de múltiplas cópias de RNA a partir de um único gene. (um único gene produz várias proteínas). ➢ Tradução • Código genético O código genético é degenerado (porque diferentes trincas codificam para o mesmo aminoácido) e universal (porque todos os organismos tem as mesmas trincas que codificam para os aminoácidos) Os transcritos são gerados no núcleo da célula eucariótica e aí eles precisam ser processador, são transportados lá para o citoplasma antes da tradução – isso pode levar a uma demora no aparecimento da proteína. Quando é necessário o aumento rápido da produção das proteínas, um RNA pode ser ativado para a tradução sem demora. Esses genes que são transcritos e depois processados podem durar muito tempo. No caso dos eucariotos, eles têm mais ou menos quatro mecanismos que atuam na tradução: 1. Fatores de iniciação da tradução – estão sujeitos à fosforilação por proteínas. Em geral, as formas fosforiladas são menos ativas e provocam diminuição da tradução na célula. 2. Algumas dessas proteínas se ligam diretamente ao RNAm e vão atuar como repressoras na tradução. Muitas delas se ligam a sítios específicos na região 3’ do DNA não traduzida. Quando elas estão dessa formas, elas interagem com os fatores de iniciação da transcrição ou também com as subunidades dos ribossomos. 3. As proteínas de ligação estão presente nos eucariotos desde as leveduras até os mamíferos – elas interrompem a interação entre os fatores de transcrição. No caso, essas proteínas atuam e o crescimento celular fica lento, então elas limitam a tradução ao se ligarem no local específico do fator de transcrição. 4. A regulação gênica mediada pelo RNA – ocorre a repressão da tradução ➢ Ferramentas genético moleculares O que iremos abordar? ✓ Ferramentas genético moleculares • Marcadores moleculares • Métodos de análises dos ácidos nucleicos e proteínas • Métodos de edição dos ácidos nucleicos • Aplicação das técnicas moleculares na identificação de doenças infecciosas ➢ Mutações e polimorfismos Mutação é uma alteração, elas podem ser divididas em mutações gênicas e mutações cromossômicas. Dentro das mutações gênicas temos: substituições, inserções e deleções (mutações pontuais, mutações de bases nitrogenadas). Dentro das cromossômicas: numéricas (por exemplo Síndrome de Down) e estruturais (por exemplo deleção do fragmento de uma parte do cromossomo 5 que vai levar à doença de cri-du-chat – doença em que a criança tem o miado do gato). Então, gênicas vão afetar os genes, a sequência de bases nitrogenadas; cromossômicas afetam os cromossomos. ➢ Mutações – origem • Alterações do material genético (DNA) que originam novas versões de um gene, definitivas e hereditárias; • Acúmulo de mutações vantajosas ocorrem pela ação da seleção natural, durante os bilhões de anos de evolução biológica; • São fontes primárias da variabilidade dos seres vivos; • As mutações são produzidas ao acaso, não têm qualquer relação com as necessidades do organismo; • Ocorrem espontaneamente ou podem ser induzidas por agentes externos como radiações ionizantes e certas substâncias; • Células germinativas (gametas) > hereditariedade > evolução; • Células somáticas > câncer. ➢ Mutações gênicas • Classificações 1. Por efeito na estrutura – então, temos os tipos: inserção, deleção ou substituição. 2. Por função genética do DNA – avalia se aquela mutação causa perda ou ganho de função naquele determinado momento. 3. Por aspecto do fenótipo afetado – alterações morfológicas (muda totalmente a forma) no fenótipo ou bioquímicas (muda a rota metabólica). 4. Pela herança – autossômico dominante, recessivo e temos os padrões de herança sexuais dominantes e recessivos. Quando tem a perda do par de bases, muda totalmente a estrutura, a cadeia de polipeptídeos. Quando ocorre a adição acontece a mesma coisa. Quando acontece uma substituição não necessariamente muda. • Tipos e consequências das mutações gênicas ✓ Mutação silenciosa (sinônima ou neutral): é muito comum e responsável pela diversidade genética que não é expressa fenotipicamente. ✓ Mutação com perda de sentido (não-sinônima ou missense): tem como consequência a substituição de um aminoácido por outro na proteína codificada. Ex.: anemia falciforme. ✓ Mutação sem sentido (sem sentido ou nonsense): origina uma proteína mais curta ou mais longa do que a proteína normal (altera o stop codón). ➢ Polimorfismos genéticos X Mutações genéticas • Mutações genéticas ✓ Alteração na sequência de nucleotídeos de uma molécula de DNA. ✓ O termo “mutação” é geralmente usado para referir-se a alterações na sequência de DNA que não estão presentes na maioria dos indivíduos de uma espécie • Polimorfismos genéticos ✓ Diferença na sequência de DNA entre indivíduos, grupos ou populações. ✓ Incluem SNPs, sequências repetitivas, inserções, deleções e recombinações. ✓ Resultado de processos naturais ou induzidos por agentes externos (como vírus ou radiação). Polimorfismos são alterações no DNA que se mantém nas gerações futuras • Polimorfismo: variação >1% (é chamado de polimorfismo quando acontece em mais de 1% da população) • Mutação: variação <1% O polimorfismo está diretamente relacionado com a diversidade genética, então, é com o polimorfismo que a gente consegue fazer, por exemplo, um estudo de espécies, um estudo de melhoramento genético, uma avaliação da predisposição para determinada doença. Polimorfismos foram mutações que se propagaram ao longo de gerações Tem um indivíduo TAAAAAT e um outro indivíduo que sofre uma mutação TAACAAT – na árvore genealógica dessa família, temos indivíduos sem mutação e indivíduos com mutação, com o passar do tempo, ela foi produzindo gerações e essa mutação foi se perpetuando, então ela passou de mutação e começou a ser chamada de polimorfismo. Exemplo: mutação no gene que codifica a cadeia β da globina, alterando o códon GAC para GTC no RNAm, o que acarreta a troca do ácido glutâmico (Glu) pela valina (Val), caracterizando uma substituição de uma base. • Por efeito na estrutura: Substituição de base. • Por função genética do DNA: Perda de função. • Por aspecto do fenótipo afetado: Morfológico. • Pela herança: Autossômico Recessivo. • Consequência: Perda de sentido (não-sinônima ou missense). Vídeo aula 3 parte 1 ➢ Marcadores Moleculares “São sequências de DNA que possuem polimorfismos entre indivíduos geneticamente relacionados”. • Função Os marcadores moleculares são amplamente utilizados para estudo populacional, mapeamento e análises de similaridade e ainda, distância genética. São esses polimorfismos que nos diferenciam. • Classificação Evolução Lenta: taxade mudança é lenta, os indivíduos proximamente aparentados (mesma família), não apresentam diferenças. Estudos que envolvam espécies e táxons). Evolução Rápida: taxa de mudança é rápida, mesmo indivíduos muito aparentados, serão diferentes entre em si, sendo mais adequado para estudo de indivíduos, famílias e populações. • Classificação (principais) ✓ Minissatélites ✓ Microssatélites ✓ SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) ✓ Aloenzimas • SNPs É uma mutação que pode ocorrer de um único nucleotídeo em uma dada sequência de DNA e que tem em mais de 1% da população. Os SNPs são as formas mais frequentes de variações genéticas. ✓ Single Nucleotide Polymorphism, ou SNP ("snip"): o pequena mudança, ou variação, que pode ocorrer em um único nucleotídeo numa sequência de DNA em uma porção significativa (mais de 1%) de uma população. ▪ SNPs são as mais frequêntes formas de variações genéticas ▪ 90% das variações genéticas humanas vêm dos SNPs ▪ SNPs tem se tornado marcadores de preferência pela sua grande abundância e pelo desenvolvimento de tecnologias de genotipagem em larga escala. ✓ Distribuição dos SNPs • SNPs em menor quantidade em éxons do que em regiões não-codificantes • Menor quantidade de SNPs nos cromossomos sexuais (humano). • Em média, ocorrem a cada 300~600 nucleotídeos (humano). • Genes com maior pressão para modificação (é uma possibilidade do meu gene se modificar ao longo do tempo) tem maior frequência de SNP (resistência, adaptação, interação parasita-hospedeiro, etc). ✓ Classificação dos SNPs • Aloenzimas ✓ História evolutiva e as relações entre diferentes espécies. ✓ Geralmente desempenham funções muito básicas que se encontram em todas as formas de vida. ✓ DNA polimerase = Alterações significativas nesta enzima refletem eventos significativos na história evolutiva dos organismos. Vídeo aula 3 parte 2 ➢ Métodos de análise dos ácidos nucleicos ✓ Extração de DNA/RNA – qualquer estudo genético, é necessário fazer uma extração do DNA ou do RNA. • Quantificação do DNA – saber a qualidade desse DNA/RNA, precisa-se quantifica esse DNA, saber como ele está, se está bom para o procedimento que vai ser feito • Reação em cadeia pela polimerase (PCR) • Eletroforese em gel de agarose e poliacrilamida • Southern, Northern e Western blotting • Sequenciamento (estudos alvo-específico ou estudos ômicos) • SNP-Chip Quando falamos de extração de DNA, estamos falando que precisamos tirar ele do núcleo da nossa célula. As células eucarióticas animais são constituídas de: membrana plasmática, membrana nuclear, e o DNA está dentro do núcleo, então, preciso romper essas membranas para chegar ao DNA. • Extração de DNA/RNA No geral, toda extração de DNA se baseia em 4 etapas básicas, presentes em qualquer protocolo de extração: Etapas: lise das membranas lipídicas > purificação do DNA > precipitação do DNA > reidratação do DNA. As membranas são constituídas de fosfolipídeos, ou seja, para rompê-las, a gente precisa usar por exemplo um detergente, então nos kits para extração de DNA, onde vem 4 frascos, a etapa 1 é um detergente, que é utilizado para quebrar essa membrana. Após isso, é necessário fazer a purificação e a precipitação do DNA, que é feita utilizando sais e álcool. A reidratação do DNA pode ser com alguma substância salina ou apenas água ultrapura. A primeira etapa foi a coleta do material, que nesse caso foi sangue > após isso, foi adicionado na mistura o detergente, que vai romper a membrana, e também é feito um tratamento com algumas enzimas que ajuda na quebra das membranas e também na quebra de outras proteínas que tem ali no meio (com excessão do DNA) > depois é feita a adição de alguns sais para que seja possível estabelecer a ligação do DNA e obter a sua precipitação > adiciona-se álcool, e têm-se a divisão em camadas – o DNA vai estar em cima > após isso é feita uma centrifugação, o material vai para o fundo e o álcool é jogado fora > depois é feito o processo de secagem para o álcool evaporar completamente, quando isso acontece, é feita a reidratação do DNA, com água ou alguma substância salina. Para a análise clínica, todas as extrações são feitas com kits, porque é muito difícil dar errado. O kit é muito mais rápido, muito mais eficiente, mas muito mais caro. O valor utilizando o método passo por passo é em média de 3 reais por extração. O kit é aproximadamente 7 a 10 reais por amostra. ➢ Quantificação e qualidade do DNA/RNA (para saber quanto de DNA tem naquela amostra) • Após a extração, é necessário determinar a concentração de DNA extraído. • Geralmente feito por espectrofotometria ou algum outro equipamento mais avançado (nanodrop, picodrop). • O DNA possui leitura de absorbância em um comprimento de onda na faixa de 260nm. • As proteínas possuem uma leitura de absorbância na faixa de 280nm. • Razão 260/280nm mostra a pureza do material extraído: o ≥ 1,75 – 1,8 = material de boa qualidade (puro). o < 1,75= contaminação por lipídeos e/ou proteínas o Na extração de RNA a razão 260/280nm ideal = 2 ➢ Quantificação Espectofotômetro – pega uma amostra e adiciona ela no vidro > o equipamento vai ler e dar as razões da proteínas, do DNA e dá também a concentração de DNA. ➢ Eletroforese ✓ Separa, identifica e purifica fragmentos de DNA e de proteínas. ✓ Consiste na separação de moléculas ionizadas de acordo com sua carga elétrica e seu peso molecular ✓ Moléculas com carga negativa migram para o polo positivo (cátodo) e moléculas com carga positiva migram para o polo negativo (ânodo). ✓ Os ácidos nucléicos, por possuírem carga total negativa (em decorrência do grupamento fosfato), migram sempre em direção ao polo positivo (cátodo) ✓ Tampões das cubas e do gel ✓ Conduzida em diferentes meios de suporte: papel filtro, sílica-gel, membranas de acetato de celulose, gel de agarose e gel de acrilamida. • Eletroforese em gel de agarose É um equipamento onde se usam cargas elétricas e é conduzida através de eletrólitos. Acontece uma separação das moléculas de acordo coma carga e o peso. É uma cuba, uma fonte de energia e os polos positivos e negativos. Dentro dessa cuba eu adiciono o tampão (normalmente é um sal); além disso, preciso produzir um gel, que é feito através da agarose (ele funciona como uma gelatina) e nesse gel, se colocam umas formas para criar uns buracos (chamados de pocinho) que é onde a amostra de DNA vai ser colocada. É utilizada uma coloração para que seja possível ver o DNA. Quando se liga na energia ele vai “correr” do polo positivo para o polo negativo. Depois de um tempo retira e coloca em contraste com a luz ultravioleta. O que está brilhando na parte de cima são os pocinhos e o DNA está embaixo deles, assim, é possível observar bandas de DNA. Como dá para ver se está bom ou ruim: através da espessura da banda e da intensidade da luz. • Eletroforese em gel de poliacrilamida ✓ Mesmo princípio de funcionamento gel de agarose. ✓ Difere na configuração e poder de resolução de amostras que contém fragmentos pequenos. Muito utilizado para amostras bem pequenas. Essa é uma cuba de gel de poliacrilamida. Corre de cima para baixo. Esse é o resultado. Dia: 02/09/2020 • A reação em cadeia da polimerase (PCR) Amplificação in vitro de sequências específicas de DNA. Por exemplo: Nessa imagem tem todo o genoma, mas quero estudar só um gene em específico, para isso, não preciso estudar todo o genoma. Como a PCR funciona: o nosso genoma tem 3 bilhões de pares de base, em determinado momento, se estou estudando um gene específico, eu preciso estudar os 3 bilhões de nucleotídeos? Não, para isolar aquele gene específico, usa-se a PCR. É possível coletar fragmentos específicos do DNA. Processo de replicação do DNA = inicialmente, o DNA está em dupla hélice,então a primeira coisa a ser feita, é abrir a estrutura de dupla hélice, para isso precisa-se da enzima helicase, que vai conseguir fazer esse processo (mas tem mais umas enzimas também que atuam). Para começar a produção da nova cadeia, preciso que essa fita não volte, para ela ficar aberta, na replicação tem algumas proteínas chamadas SSBs que se aderem à estrutura de nucleotídeo e faz com que a molécula não se feche , para estender a cadeia, para produzir a nova fita, precisa-se da ação da DNA polimerase, ela coleta os nucleotídeos, ela catalisa as ligações dos nucleotídeos um a um, então ela vai catalisando essas ligações e anova fita é formada. • Estrutura e replicação do DNA PCR - Reação em cadeia pela polimerase A PCR é um sistema para a replicação do DNA in vitro, que permite que uma sequência “alvo” de DNA seja amplificada em milhares de cópias em apenas algumas horas. A Taq polimerase tem a mesma ação da DNA polimerase, precisa-se dos nucleotídeos (dNTPs) e também precisa que esse meio esteja equilibrado, então faz o uso de tampão e magnésio, além disso, é necessário água e iniciadores, que são chamados de primers (produzida pela RNA primase) – tem os primers na direção 5’-3’ e os primers na direção 3’-5’. • Os iniciadores de PCR ✓ A enzima DNA polimerase não se liga em fita simples ✓ Iniciadores ou oligonucleotídeos (=PRIMERS) ✓ Utilização de pares de iniciadores (um complementar para cada fita) ✓ Iniciador Senso (Forward): se liga na fita 3’-5’ ✓ Iniciador Antissenso (reverse): se liga na fita 5’-3’ Ele é pequeno, tem no máximo 20 pares de bases. É uma sequência única, não existe em outra parte do genoma. O primer funciona como extremidade para a minha sequência alvo. Tenho no meu genoma, genes da tubulina, actina e miosina e quero isolar só o da actina, o primer no início e no final do gene vai isolar ele. Como funciona a técnica de PCR – in vitro, o que substitui a helicase é a temperatura, então se aumento a temperatura para 95°, a minha dupla fita abre, as pontes de hidrogênio quebram. Quando ela está aberta, consigo fazer o anelamento do primer (ele vai encontrar a sequência que eu quero e se anelar nela), aí a Taq polimerase começa a sintetizar o novo nucleotídeo, e assim, forma uma fita nova, que vai ser sintetizada em uma temperatura de 72°. Então, há uma ciclagem de temperatura > 95° abre a fita, 60° os primers se anelam, 72° a Taq polimerase trabalha de forma otimizada e começa a sintetizar os nucleotídeos. Então, esse process.o acontece de 3 maneiras: abertura da fita, anelamento dos primers e extensão da cadeia de nucleotídeos através da Taq polimerase. É uma amplificação exponencial. No primeiro ciclo tem duas cópias, no segundo quatro e assim sucessivamente até que chegue em uma quantidade muito alta de cópias de região específica do DNA. Nesses tubinhos tem Taq polimerase, tampão, magnésio, água, nucleotídeos e iniciadores. Material é colocado nesse aparelho e a ciclagem é feita. • Visualização (Eletroforese em gel de agarose) Em cima tem os pocinhos, o DNA total não sai dele. Quando isola, o DNA corre no gel. São amostras de diferentes indivíduos (10, 20, 22...) e por exemplo, a amostra do indivíduo 38 ficou muito boa, já do indivíduo 10, vai ter que repetir (10, 20, 22, 24 e 26 teria que repetir). A partir desse fragmento isolado posso fazer a identificação de uma mutação específica. • Aplicações ✓ Identificação molecular (medicina forense) ✓ Identificação molecular (diagnóstico) ✓ Identificação de polimorfismos ✓ Teste de paternidade ✓ Clonagem ✓ Estudos de espécies (caracterização molecular) ✓ Entre outros... • Variações ✓ RAPD (Amplificação aleatória de DNA polimórfico) ✓ RFLP (Polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição) ✓ Nested PCR ✓ Multiplex PCR ✓ SSCP (Polimorfismo de Filamento único) ✓ PCR digital ✓ Transcrição Reversa seguida de PCR ou PCR semi-quantitativa (RT-PCR) ✓ PCR quantitativa em tempo real (qPCR) ✓ Transcrição Reversa seguida de qPCR (RTqPCR) • Identificação de mutações e SNPs – PCR-RFLP ✓ Amplificação do fragmento alvo (PCR) ✓ Corte com enzima de restrição o Enzimas que fragmentam o RNA em locais específicos o Extraídas originalmente de bactérias. o Extremidades coesivas Visualização – PCR-RFLP • Diagnóstico Molecular da anemia falciforme – PCR – RFLP Exemplo: mutação no gene que codifica a cadeia β da globina, alterando o códon GAC para GTC no RNAm, o que acarreta a troca do ácido glutâmico (Glu) pela valina (Val), caracterizando uma substituição de uma base. ✓ Desenhar e sintetizar primers específicos que flanqueam (flanquear = isolar) a região do gene da cadeia β da globina ✓ Realiza a PCR ✓ Corta com enzima de restrição específica para o sítio de interesse, no caso, CGTCA – para fazer isso, existem enzimas de restrição específicas para esse sítio. Essa enzima vai reconhecer o sítio de ligação e cortar o fragmento alvo. ✓ Faz a corrida de eletroforese em gel de agarose. Primeira coisa vai ser o PCR, então vou amplificar um segmento específico. • Visualização – RFLP Cada banda significa que bem 100pb. Se tá muito brilhante, com dois fragmentos, significa que a enzima identificou a mutação e cortou (em branco). Se tem um fragmento só, não reconheceu, não tem anemia falciforme (vermelho). • Teste de paternidade – PCR- Multiplex (uso várias regiões) ✓ Coleta do material biológico. ✓ PCR com 16 STR (microssatélites) simultaneamente usando oligonucleotídeos marcados (primers) com fluorescências de diferentes cores. ✓ As amostras são submetidas à eletroforese em gel de acrilamida ou capilar para separação dos fragmentos de acordo com o tamanho molecular. ✓ Por fim, a comparação destes perfis deve ser acompanhada de análise estatística para estabelecer a probabilidade de vínculo biológico. Azul é a mãe, amarelo o pai e o filho é a mistura dos dois. • Identificação de espécies – PCR- Multiplex (exemplo: paciente que está com candidíase, mas qual espécie de cândida? É feita a identificação para ter um medicamento mais adequado). PCR – Multiplex Cada “altura” é uma espécie. Observação: esses testes são muito caros. • PCR quantitativa em tempo real!! A PCR pode ser utilizada em diversas aplicações dependendo do tipo de molécula utilizada As aplicações também podem ser classificadas quanto a quantitativas ou qualitativas Quantitativas 1. Quantificação relativa (estudos de expressão gênica). 2. Quantificação absoluta (carga viral/nº cópias) – muito mais usada na medicina por causa do diagnóstico de doenças de carga viral, de patógenos. Qualitativas 1. Genotipagem (SNPs). 2. Detecção (diagnóstico: +/-). 3. Thermal shift (Troca térmica que quantifica a mudança de temperatura de desnaturação térmica de uma proteína). Passos: 1. Desenho experimental. 2. Extração de RNA/DNA. 3. Transcrição reversa. 4. qPCR. 5. Análise dos dados. • REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE (PCR) • Reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa em tempo real (qRTPCR) 1. RNA = cDNA. 2. Região específica (primers). 3. Flouróforos (é um reagente que vai emitir fluorescência). Vai usar uma enzima que chama transcriptase reversa, ela catalisa os nucleotídeos de forma contrária e aí forma o DNA complementar. No final das contas, as uracilas acabam se perdendo no meio do caminho e o que é catalisado é somente as timinas. Normalmente, em patógenos, essa é a região conservada (região alvo), é por onde conseguimos identifica-lo. Domínios conservados (que existem dentro de alguns genes do COVID) – é uma região que tem uma taxa de mutação muito pequena, então ele não modifica e é possível identificar o vírus. Depois que conseguiu fazer a extração do RNA, transformamos ele em cDNA para que essas enzimasnão degradem mais ele e ele fique de forma estável. No COVID, tem 3 regiões. Esses primers da tabela que vão cortar a região específica para saber se é ou não Sars-CoV-2. ✓ Flouróforos – são agentes químicos que quando entra em contato coma região amplificada em específico, vai emitir o sinal de fluorescência. Monitoramento contínuo de um sinal fluorescente ao longo dos ciclos ✓ Monitoramento em tempo real Então, se essa região amplificou, significa que tenho a carga viral. Se essa região não amplificou, o fluoróforo não vai amplificar e não vai emitir fluorescência. Tem 3 diferentes fluoróforos, vai depender da técnica, da especificidade, ... no caso do COVID, é usado TaqMan, ele é muito específico para região, por isso é considerado o padrão ouro. Resultado: a PCR em tempo real, vai mostrar na tela do computador (colocam as amostras dentro do aparelho e ele é acoplado ao computador) um gráfico, que mostra o número de ciclos por fluorescência. Basicamente, ele emite um gráfico que cresce de forma exponencial, então, tem algumas fases: a linha base, que tá iniciando a PCR; depois ele começa a emitir a fluorescência, começando a crescer, essa fase é chamada de fase exponencial e depois fase linear; depois ele chega na fase estacionária, que é quando os reagentes acabam. • Detecção dos Sorotipos da Dengue ✓ Doença infecciosa transmitida pela picada de mosquitos do gênero Aedes. ✓ É atualmente um importante problema de saúde pública no Brasil. ✓ São reconhecidos quatro sorotipos antigenicamente distintos (DENV-1, -2, -3 e -4). ✓ A doença causada por qualquer um dos sorotipos cursa de forma assintomática ou com quadro clínico que varia desde uma febre indiferenciada e autolimitada, passando pela febre clássica da dengue (FD) até quadros graves de febre hemorrágica da dengue (DHF). ✓ O diagnóstico clínico é difícil de ser realizado principalmente na fase aguda da doença em que os sintomas são muito similares aos de outras infecções febris agudas, ficando a cargo do laboratório o diagnóstico definitivo. ✓ Os métodos sorológicos para detecção de anticorpos IgM/IgG são os mais amplamente utilizados, mas inadequados para diagnóstico precoce uma vez que detectam anticorpos a partir do sexto dia do início dos sintomas. ✓ Os métodos moleculares estão sendo cada vez mais utilizados para o diagnóstico precoce por serem mais rápidos e sensíveis que a sorologia e o isolamento viral. ✓ Utiliza marcadores fluorescentes. ✓ Utiliza primers específicos. • Detecção do COVID-19 • Sequenciamento Bibliotecas é a mesma coisa que amostra. O sequenciamento é feito em máquinas chamadas sequenciadores. Depois que o resultado fica pronto, eles são guardados em meios digitais. E após isso, o bioinformata faz seu trabalho. • Métodos de sequenciamento ✓ 1980 – 1ª Geração: Método enzimático – Frederik Sanger. (Applied Biosystems). Esse método revolucionou a ciência e usou da PCR como base para desenvolver esse método enzimático. (genoma humano foi sequenciado a partir desse método). ✓ 1996 – 2ª Geração: Método de pirosequenciamento – Mostafa Ronaghi (Roche 454), Método por síntese: Iron Torrent e Illumina (GA I e II, HiSeq, MiSeq…). É um método mais rápido e foi possível sequenciar um tamanho muito maior. ✓ 2011 – 3ª Geração: Single Molecule Real Time (SMRT) – DNA Sequencing, Pacific Bioscience (PacBio). Metodologia que ao invés de sequenciar a dupla fita de DNA, ele sequencia uma fita só e além disso é em tempo real. ✓ 2013 – Oxford Nanopore desenvolvido pela Oxford Nanopore Technology (ONT). Sequenciamento em tempo real. Projeto iniciado na década de 90. MnION (2014), VolTRAX (2016), GridION X5 (2017) … é possível sequenciar no próprio celular 1ª Geração: Sanger e Sanger automatizado (1986, Applied Biosystems): Genes e regiões específicas (Ribossomal, ITS, genes funcionais...) Por exemplo: fazer identificação de fungos. Vai pegar uma região específica do fungo e depois mandar pra esse sequenciador. O resultado é basicamente esse: Isso é o sequenciamento. Isso é guardado no NCBI. Da segunda geração em diante, conseguimos sequenciar o genoma inteiro de forma direta. Isso foi um pulo em relação a custo e tempo. 2°Geração: Pirosequenciamento e Síntese ✓ Roche 454 ✓ Iron Torrent ✓ Solexa - Illumina (HiSeq, MiSeq…) • Sequenciamento direto de milhões e bilhões de moléculas de DNA, aumentando consideravelmente a escala e a resolução das análises. • Genomas completos, metagenomas, RNA-seq, exomas, RNAs não codificantes, pequenos RNAs, entre outros 3°Geração: PacBio • Molécula única em tempo real – SingleMolecule, Real Time Technology Sequencing (SMRT®). • Observação em tempo real através da enzima DNA polimerase, garantindo a esse método uma precisão superior a 99,999%. • Leitura: 8.000 pares de bases 4°Geração: OxfordNanopore As tecnologias baseadas em nanopore se originaram dos canais de contador e íon Coulter. • 1990 – Inicio. • 1996 – Primeiros testes. • 2013 – Primeiros equipamentos. Ele tem uma cuba, um canal, o nanopore e o DNA passa por esse nanopore, emitindo um vibrato, uma frequência, cada base nitrogenada tem uma sequência diferente. Assim, é possível identificar a posição e qual base nitrogenada. Está sendo uma das metodologias utilizadas para o sequenciamento do Sars-CoV-2. Ele é um sequenciador peqeuno. 4° geração • Abril, 2014 • 100 gramas (tamanho de um grampeador). • Sequenciamento em tempo real. • Detectar alterações epigenéticas, como metilações no DNA. • Usado pela primeira vez no país em 2016 para traçar retrospectivamente a disseminação e a evolução do vírus zika nas Américas. O MinION foi o sequenciador utilizado para sequenciar o Sars-CoV-2 pelos pesquisadores da USP. Conhecido mundialmente por ter sido o sequenciamento recorde do Sars-CoV-2. Ele é usado principalmente para traçar e disseminação e a evolução de vírus, principalmente o zika, vírus da dengue. Vídeo aula 3 parte 4 Métodos de edição de ácidos nucleicos Dentro das técnicas de edição genética temos: • Clonagem - Natural Processo no qual o zigoto se divide, dando origem a dois zigotos independentes, possuindo o mesmo genoma (gêmeos univitelinos). • Clonagem - Induzida Realizada artificialmente em laboratórios, a reprodução assexuada utiliza duas células mãe, que produzirão seres idênticos ou clones. Figura 1- ovelha Dolly A rã foi o primeiro animal a ser clonado. A partir da clonagem da ovelha Dolly, foi possível clonar outros animais mais complexos (mamíferos) e abriu para a possibilidade de clonar o humano um dia. • Clonagem Induzida Reprodutiva É retirado de uma célula o núcleo, e de um óvulo a membrana. A junção dos dois depois é colocada numa barriga de aluguel Inicialmente precisa-se de dois indivíduos. No desenho tem uma ovelha de cara preta e uma de cara branca do sexo feminino. A ovelha de cara preta vai ser doadora do óvulo, esse óvulo vai passar por vários tratamentos, e dentre eles, o núcleo é removido. A ovelha branca é doadora também, vai pegar a célula doadora e vai fundir a célula dela com óvulo da ovelha preta. Assim, vai ter basicamente uma estrutura zigótica, induzindo a divisão celular e conseguindo formar o embrião, que vai ser implantado em uma das ovelhas e assim, nasce o indivíduo clonado daquele que doou a célula (tem material genético dentro). No humano: tem o doador do óvulo e o que vai doar a célula, o núcleo o óvulo é retirado e é feito uma fusão e isso é induzido a uma divisão celular, o óvulo é implantado e vai nascer um indivíduo idêntico ao doador da célula. ! normalmente o clone nasce com a idade do ser clonado, então, todos os danos que já foram causados nas células doadoras, vão ser passados para o clone. • Edição Genética Clonagem- Induzida Terapêutica Utilizada na reproduçãode células-tronco, o processo é semelhante à clonagem reprodutiva, porém não é introduzida no útero. É o mesmo processo da clonagem reprodutiva. Quando chega no blastocisto, é desmembrado e as células são implantadas, por exemplo no coração (em locais que precisam de uma regeneração celular rápida). • Edição Genética - DNA-Recombinante (é a técnica mais usada – é a técnica da vacina) Tecnologia do DNA recombinante (TDR): conjunto de técnicas que permite o isolamento de fragmentos gênicos. Relevância: possibilita o isolamento e multiplicação de genes in vitro para posterior análise/caracterização Duas importantes classes de enzimas: Endonucleases de restrição; DNA ligase • Estratégia geral de clonagem gênica 1- Isolamento de um fragmento de DNA (PCR) 2- Inserção em um vetor de escolha (DNA recombinante ou quimera) – enzima de restrição é utilizada para cortar o plasmídio, assim, possibilitando essa inserção 3- Transporte para o interior de uma célula hospedeira (transformação) 4- Seleção de células transformadas 5- Replicação da molécula de DNA recombinante 6- Multiplicação de células, cada uma contendo cópias do mesmo plasmídio recombinante (clones) – bactérias são utilizadas como vetor de multiplicação (normalmente é a E. coli). Depois de conseguir a clonagem, há vários caminhos que podem ser seguidos. • DNA-Recombinante o Agropecuária (animais e plantas transgênicas ou geneticamente modificado – soja) o Saúde (vacinas, hormônios – insulina, transplantes, terapia gênica...) (Animais que emitiram fluorescência = combinantes). Estudo da regulação e da expressão gênica. Geração de modelos animais para estudos biomédicos. Introdução de novas características importantes economicamente (ex. salmão transgênico cresce 10x mais). Vacina de DNA = muito segura e eficiente • COVID-19 (SARS-CoV-2) – exemplo de como poderia ser feita uma vacina para SARS-CoV-2 1. Sequenciamento 2. Identificação de regiões conservadas 3. Isolamento dessas regiões 4. Inserção em vetor 5. Multiplicação 6. Testes in vivo • Silenciamento de genes – técnica onde é utilizado o RNA A interferência por RNA (RNAi) é um mecanismo celular responsável pelo silenciamento gênico pós- transcricional (post transcription gene silencing - PTGS) atuando sobre o RNA mensageiro (mRNA). O emprego de RNAi como abordagem terapêutica tem sido considerado altamente promissor no combate a doenças em que a expressão anormal de certos genes pode ser identificada como a causa ou o fator contribuinte. Entre essas doenças podemos citar câncer, doenças genéticas dominantes, doenças autoimunes e infecções virais. RNA de interferência – vai interferir na expressão dos genes. Ele segue basicamente dois processos: ele é um RNA dupla fita, depois que ele é produzido, essa dupla fita é retirada, sobrando um RNA simples, ele consegue identificar o RNA mensageiro, então ele vai ter uma sequência que corresponde a um RNA mensageiro qualquer produzido dentro do núcleo. Sendo assim, quando há essa correspondência, o RNA de interferência se liga e interfere, quebrando o RNA mensageiro, assim, com essa quebra, o gene é silenciado, porque quebrando o RNAm, não há produção de proteína. CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats – Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas) • Histórico 1987 – Yoshizumi Ishino (Japão) Identificaram um locus “peculiar” no genoma da E. Coli. Sequências repetidas e espaçadoras intercaladas e de função desconhecida. 1993 – 2002 – Muitas pesquisas foram realizadas e então identificado algumas das funções desse locus denominado CRISPR. 2005 – Sequencias espaçadoras tem origem extracromossômica (derivados de plasmídeos ou vírus) 2005 – Foi descrito que os vírus são incapazes de infectar bactérias que possuem sequencias espaçadoras idênticas a esse vírus. 2005 – CRISPR é um sistema imunoadaptativo de procariotos O sistema CRISPR/Cas procariótico funciona codificando proteínas que atuam como um sistema imune adaptativo. A imunidade é mediada pelas nucleases Cas e pequenos RNAs-guias (crRNAs) que especificam o sítio de clivagem dentro do genoma invasor. Esse sistema é formado por dois componentes principais: ✓ Cas = catalizador (Tipos I, II e III – Cas1 ao 10) ✓ Loco CRISPR = memória genética (RNAs-Guias) • Técnica Utilização do RNA-Guia (crRNAs ou CRISPR) e apenas uma das proteínas Cas (a endonucleaseCas9). ❖ Cas9 – principal nuclease envolvida na clivagem do DNA invasor, resultando na mais eficiente ferramenta de engenharia genética da atualidade. o 1987 – 2006: 32 artigos publicados o 2019: 16.049 artigos publicados o 2020: 17.158 artigos publicados (início de 2020) o Nos dias atuais, já passam de 20 mil artigos publicados. “CRISPR é o passado, o presente e o futuro!” Precisa-se de dois componentes – a enzima e o DNA guia. Como ocorre: precisa-se da sequência personalizada (que é o alvo que quero editar na região), o DNA guia, depois disso o DNA é anexado formando um complexo com a Cas9 para então conformar a ferramenta, chamada de ferramenta CRISPR, após isso, o DNA guia começa a procurar dentro do genoma a região que corresponde à sequência que quero, quando ela encontra essa sequência personalizada, ocorre o corte do DNA, depois disso é possível fazer a edição necessária. • Aplicações o Edição do DNA o Marcação do DNA o Regulação da expressão de genes o Mapeamento de genes o Clivagem de RNAs o Rastreamento de RNAs Estados Unidos O objetivo era corrigir uma mutação em um gene, o MYBPC³, responsável por uma doença chamada cardiomiopatia hipertrófica. • Uso da tecnologia CRISPR para editar cadeias de DNA de pacientes com formas de câncer resistentes, cujo tratamento convencional falhou. o A proposta é pegar células imunes dos próprios pacientes, editá-las usando o CRISPR e, então, devolver ao corpo da pessoa na esperança de que tais células possam ajudar a combater a doença Vídeo aula 4 parte 1 Citogenética clínica e alterações cromossômicas O que iremos abordar? • Citogenética e alterações cromossômicas • Princípios da citogenética • Técnicas básicas e avançadas de citogenética • Anomalias cromossômicas • Citogenética do câncer Princípios da citogenética CITOGENÉTICA DEFINIÇÃO: Todo e qualquer estudo relativo ao cromossomo Técnicas básicas e avançadas de citogenética • Cromossomos – Obtenção Tecidos e órgãos com crescimento e divisão rápida • In vivo 1. Medula óssea (vertebrados) 2. Baço (mamíferos) 3. Intestino (répteis) 4. Brânquias (peixes) 5. Testículo – meiose 6. Meristema apical das raízes de plantas (por exemplo: raiz da cebola que tem crescimento rápido) • In vitro (cultura celular) 1. Leucócitos (Linfócitos T) + análise rápida - vida curta 2. Fibroblastos + cultura permanente - mais invasivo • Cromossomos – Análise Cariotipagem: Representação do conjunto cromossômico Homólogos emparelhados • Coloração comum • Bandeamento (marcação de bandas no cromossomo) • Importância: o Individualização dos cromossomos o Observação de polimorfismos o Outras colorações diferenciais: Banda R (solução salina e calor), Banda Q (quinacrina mostarda), Nitrato de prata (RON) As bandas C – cromossomos são tratados com hidróxido de bário e corados com Giemsa por exemplo, eles são corados em regiões específicas que correspondem à heterocromatina constitutiva, que é o centrômero (por isso se chama banda C). Então na imagem da banda C, é possível ver a heterocromatina corada. No caso do cromossomo 1, ele é do tipo metacêntrico, pois dá pra visualizar que a cromatina está localizada bem no centro do cromossomo. No caso do cromossomo 3, posso dizer que está corado próximo do braço P, então é bem
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