Espectrofotometria na Bioquímica

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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS 
ESCOLA SUPERIOR DE CIÊNCIAS DA SAÚDE 
 
Disciplina: Bioquímica – ESA-0222 
AULA PRÁTICA – Espectrofotometria 
 
1. Objetivos 
 
- Conhecer os conceitos da Lei de Lambert-Beer na espectrofotometria de absorção. 
- Compreender a finalidade e a utilização na prática laboratorial da espectrofotometria e da determinação da 
absorbância. 
- Descrever o funcionamento e a calibração do espectrofotômetro. 
- Plotar e analisar espectro ou curva de absorção e curva-padrão ou de calibração ou de referência. 
- Empregar equação da reta de curva-padrão para determinar concentração em amostra de concentração 
desconhecida. 
 
2. Espectrofotometria 
 
A fotometria estuda a medição das grandezas relativas à emissão, à recepção e à absorção da luz. A 
absorbância ou absorvância é a quantidade de luz absorvida pela matéria ou meio e a transmitância é a fração da luz 
incidente em um comprimento de onda específico, que passa por uma amostra de matéria. Muitos métodos 
utilizados em bioquímica clínica estão baseados na medida quantitativa da absorção de luz pelas soluções. A 
capacidade que as diversas substâncias químicas têm de absorverem luz em determinados comprimentos de onda 
pode ser utilizada para a sua determinação quantitativa e qualitativa, uma vez que o espectro de absorção é 
característico para uma determinada substância e a quantidade de absorção (intensidade) é dependente da 
concentração do composto. A determinação espectrofotométrica de compostos corados (cromóforo) são efetuadas 
por instrumentos chamados de espectrofotômetros. Este equipamento mede a quantidade de luz que é absorvida e 
transmitida pela solução em estudo. 
A intensidade da cor de uma solução é proporcional à concentração da substância. Quanto mais concentrada for a 
solução, maior será a absorção de luz. A absorção de luz depende basicamente da concentração das moléculas 
absorventes e da espessura da solução – caminho óptico. 
A espectrofotometria de absorção por medir absorção ou transmissão de luz, permite que componentes 
desconhecidos de uma solução possam ser identificados por seus espectros característicos na região do espectro 
eletromagnético UV-Vís (ultravioleta – visível) e IV (infravermelho). Os métodos colorimétricos são específicos e 
muitos sensíveis. Um exemplo de aplicabilidade em bioquímica clínica é a determinação de glicose, por meio da 
realização da leitura da análise no comprimento de onda (λ) em 505 nm. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Segundo a Lei de Lambert-Beer, a absorbância é diretamente proporcional à concentração: A = ε x b x c, 
onde: 
ε = absortividade molar, a fração de um comprimento de onda luminosa específico absorvido por 
determinado tipo de molécula 
b = comprimento da trajetória da luz através da solução 
c = concentração das moléculas absortivas 
Esta lei é válida para condições restritas, em que a luz seja aproximadamente monocromática, as soluções 
sejam diluídas (baixas concentrações) e não deve ter a interferência da presença em solução de mais de uma 
substância absorvente de luz. 
Na prática laboratorial, a aplicação quantitativa da lei de Lambert-Beer é realizada pelo emprego de 
espectrofotômetros, onde são lidas as absorbâncias de uma solução-teste e de uma solução-padrão de concentração 
conhecida. Assim, a determinação da concentração de um soluto em uma solução problema por espectrofotometria 
 
envolve a comparação da absorbância da solução problema com a solução de referência, na qual já se conhece a 
concentração do soluto. 
É aplicado a relação: Concentração do padrão/ Absorvância do padrão = Concentração do teste/ 
Absorvância do teste. 
Quando um feixe de luz monocromática atravessa uma cubeta de espectrofotômetro que contém uma 
solução de moléculas absorventes de luz, parte da luz sofre refração, reflexão, absorção pelos reagentes e outras 
interações indesejáveis. Para eliminar tais interferências, deve-se zerar o aparelho com uma solução que é 
denominada branco. O branco deve conter todos os constituintes do sistema, exceto o composto a ser estudado. A 
cada conjunto de determinações, bem como após alterar o comprimento de onda, o aparelho deve ser sempre 
zerado com o conteúdo do tubo branco. Ainda, em geral, emprega-se absorbância de uma amostra padrão 
conhecida ou uma equação de reta fornecida por uma curva-padrão como referência para a análise. Uma curva-
padrão é obtida a partir da preparação de diluições de uma solução-padrão na proporção necessária para obtenção 
das diferentes concentrações (pontos) desejados, que tem sua absorbância determinada. Com os valores de 
absorbância e de concentrações conhecidos, pode-se traçar um gráfico cujo perfil é conhecido como “curva-
padrão” ou “curva de calibração”. Nesse gráfico, a reta, que deve passar obrigatoriamente pela origem, indica a 
proporcionalidade entre o aumento da concentração e da absorbância e a porção linear correspondente ao limite de 
sensibilidade do método espectrofotométrico para o soluto em questão. Por meio do emprego de uma equação de 
regressão linear: y = ax + b, obtida de uma curva-padrão do analito, pode-se determinar a concentração deste soluto 
em uma amostra, onde: Y = valor da absorbância e X = concentração do analito a ser determinado. 
 
Referências 
 
BISHOP, M. L.; FODY, E. P.; SCHOEFF, L. Química clínica: princípios, procedimentos, correlações. Barueri: 
Manole, 2010. 
MOTTA, V. T. Bioquímica clínica para o laboratório – Princípios e interpretações. 5ª ed. Rio de Janeiro: 
MedBook, 2009. 
NARDY, M. B. COMPRI; STELLA, M. B. E OLIVEIRA, C. Práticas de Laboratório de Bioquímica e 
Biofísica: uma visão integrada. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2011. 
NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger Princípios de Bioquímica. 6 ed. Porto Alegre: Artmed, 2014.