Micotoxinas em alimentos

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Micotoxinas em alimentos e seus métodos de análise
Docente: Flávia Carolina Alonso Buriti
Discente: Rayane Cibele da Silva Nascimento
Universidade Estadual da Paraíba
Departamento de Farmácia
Componente curricular: Bromatologia e Análises Bromatológicas
MICOTOXINAS
 ‘Mykes’ = Fungo
Origem do termo 
 ‘Toxican’ = Toxinas
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Os fungos apresentam-se em diversas matrizes alimentares, todavia algumas apresentam maior suscetibilidade que outras nestas contaminações. Grãos, cereais e subprodutos de cereais (essencialmente em trigo, mas também milho, soja e outros), mandioca, soja integral, girassol integral, algodão, farinha de soja, glúten de arroz e produtos submetidos a peletização são as matrizes organizadas por ordem decrescente de suscetibilidade, devido à natureza, composição e uso. (INÁCIO, B, F, T., 2017).
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As micotoxinas são toxinas produzidas por fungos filamentosos patogênicos. São metabolitos secundários, ou seja, metabolitos não essenciais ao crescimento, desenvolvimento e reprodução dos fungos, mas que são produzidos pelos mesmos em situações de stress para lhe conferir vantagem na competitividade com outros fungos e bactérias;
Podem causar doenças ou morte quando ingeridas pelo homem ou animais. São produzidas somente quando certas condições ambientais, tais como temperatura e umidade, além das características bioquímicas dos produtos que servem como substrato, e são propícias para a sua produção. (IAL, 2008).
Outro fator muito importante na produção das micotoxinas é a integridade física do cereal. A contaminação poderá ocorrer mesmo em material armazenado, porque lesões mecânicas ou provocadas por insetos ou durante o processamento, tornam os cereais muito susceptíveis à proliferação de fungos;
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Os principais fungos produtores de micotoxinas que contaminam os alimentos são em sua maioria os dos géneros Aspergillus spp., Penicillium spp. e Fusarium spp. Estes três gêneros são responsáveis pela produção de centenas de micotoxinas diferentes, em quantidades e com toxicidades díspares; (INÁCIO, B, F, T., 2017).
Entre as principais micotoxinas de interesse na área de alimentos citamos: aflatoxinas, patulina, ocratoxina, zearalenona, tricotecenos, fumonisinas entre outras. As aflatoxinas são as que apresentam maior importância sob o ponto de vista toxicológico. (IAL, 2008).
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Fig.3 - Fusarium spp. 
Fig.1- Aspergillus spp
 Fig.2 - Penicillium spp.
MICOTOXINAS
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LEGISLAÇÃO
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RESOLUÇÃO Nº 7, DE 18 DE FEVEREIRO DE 2011
Estabelece limites máximos tolerados (LMT) para a presença de micotoxinas em alimentos. O descumprimento da Resolução é considerado uma infração sanitária;
Art. 3º: Este Regulamento aplica-se às empresas que importem, produzam, distribuam e comercializem as seguintes categorias de bebidas, alimentos e matérias primas:  - amendoim e seus derivados; café torrado (moído ou em grão) e solúvel; cereais e produtos de cereais; especiarias; frutas secas e desidratadas; nozes e castanhas; amêndoas de cacau e seus derivados; suco de maçã e polpa de maçã; suco de uva e polpa de uva; vinho e seus derivados; leite e produtos lácteos; leguminosas e seus derivados entre outros. (ANVISA)
São metabolitos secundários dos fungos toxigénicos do gênero Aspergillus spp. e compostos heterocíclicos altamente oxigenados derivados das furanocumarinas (KWIATKOWSKI, 2007);
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Uma série de aflatoxinas são produzidas por fungos, destacando–se B1 , B2 , que apresentam fluorescência azul violeta e G1 e G2. A aflatoxina B1 é a mais tóxica das aflatoxinas, causando uma variedade de efeitos adversos e, em alguns casos podem ser letais, em diferentes espécies animais e humanos (IAMANAKA, B, T. et al., 2010);
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As aflatoxinas M1 e M2 são metabólitos hidroxilados das aflatoxinas B1 e B2 e podem estar presentes no leite e produtos derivados obtidos de animais que ingeriram ração contaminada com estas aflatoxinas. É reconhecido que as espécies produtoras de aflatoxinas são Aspergillus flavus, produtores de aflatoxinas do grupo B, A. parasiticus e A. nomius, produtores de aflatoxinas do grupo B e G e não produtoras de CPA. (IAMANAKA, B, T. et al., 2010).
Fonte: (INÁCIO, 2017)
AFLATOXINAS
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A contaminação por aflatoxina pode ocorrer no campo, antes e após a colheita, durante o transporte e armazenamento do produto;
Os principais produtos alimentícios susceptíveis ao desenvolvimento desse fungo são por exemplo: amendoim (cru ou torrado), milho, trigo, arroz, castanha do Pará, temperos, cacau entre outros, que normalmente são utilizados na composição de alimentos e rações; Assim os animais também estão sujeitos a contaminação por aflatoxinas (KWIATKOWSKI, 2007)
O Brasil, devido a prevalência de clima tropical, apresenta condições ideais para o desenvolvimento desses fungos. O Aspergillus sp. se desenvolve em temperatura que varia de 25° a 30°C, mas também tolera temperaturas na faixa de 12° a 45°C;
O fígado é o principal órgão atingido após uma ingestão aguda por aflatoxinas, devido a sua ação hepatocarcinogênica.
Fig.1 - Amendoim com casca
Fig.2 – Amendoim sem casca
Fig.3 - Milho
AFLATOXINAS
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É uma micotoxina nefrotóxica, neurotóxica, imunossupressora, genotóxica, carcinogênica e teratogênica que pode estar presente esm alimentos como: cereais, pão, farinha, cacau, café, soja, leguminosas, frutos secos, também em cerveja, vinho, sumo de uva, alcaçuz, entre outros. Os níveis de ocratoxina A nos alimentos estão intimamente relacionados às condições de produção e conservação;
É muito estável, incolor, solúvel em solventes orgânicos polares, ligeiramente solúveis em água, com características de ácido fraco e capaz de emitir fluorescência quando excitada por luz ultravioleta (ABREU, A, R. et al, 2011).
Fig.1- Grãos de café
Fig.2- Cacau
Fig.3- Vinho
OCRATOXINA A
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Tem como principal produtor a espécie Aspergillus ochraceus, embora também outras espécies de Aspergillus spp. e Penicillium spp. possam ser produtoras. As espécies de Aspergillus spp. são endémicas de regiões tropicais e subtropicais (INÁCIO, B, F, T. 2017).
Fig.1 Aspergillus ochraceus
Fig.2 Penicillium verrucosum
Fig.3 Aspergillus niger
Pode causar câncer em animais de laboratório e em suínos. Os danos e o efeito letal podem variar de acordo com o animal e o tipo de ingestão. Alguns animais são mais sensíveis à ocratoxina, como os cães e porcos, por exemplo; (IAL. 2008).
OCRATOXINA A
Produzidas por F. verticillioides, F. proliferatum e várias outras espécies de Fusarium. Existem pelo menos três fumonisinas ocorrendo naturalmente FB1, FB2 e FB3. A FB1 ocorre em concentração maior seguida pela FB2 e FB3. (IAMANAKA, B, T, et al., 2010);
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Fusarium verticillioides está associado a doenças em todas as fases de desenvolvimento do milho, causando danos em plântulas e podridão de raiz, colmo e espiga, assim como danos em milho armazenado. 
As fumonisinas chamadas de FB1 e FB2 isoladas de cepa F. verticillioides pode ser fatal para alguns animais, como os eqüinos, nos quais causa a leucoencefalomalacia. O efeito das fumonisinas em humanos não estão bem esclarecidos, no entanto, evidências sugerem a ocorrência de câncer de esôfago; (MAZIERO, M, T; 2010).
As fumonisinas são metabólitos fúngicos secundários. São moléculas fortemente polares, solúveis em água e insolúveis em solventes orgânicos;
Fig.1 – Milho apodrecido
FUMONISINAS
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DESOXINIVALENOL (DON)
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Pertence à família dos tricotecenos, esta família está dividida em quatro grupos, cada um com semelhanças estruturais: A, B, C e D.Desoxinivalenol se encontra inclusa no grupo B, que é o mais comum, embora seja o menos tóxico deste grupo. Não é destruído através do processamento dos alimentos, por ser termoestável;
Produção de DON deve-se ao género Fusarium spp., porém outros também podem ser responsáveis, como por exemplo: Myrothecium spp., Cephalosporium spp. e Trichoderma spp;
Esta contaminação não é usual durante a armazenagem, sendo que ocorre geralmente antes da colheita e, ainda que possa ocorrer em diversas matrizes, encontra-se principalmente em cereais, nomeadamente em trigo, cevada, milho, aveia, centeio e, em menor quantidade, em arroz e sorgo, e derivados destes. (INÁCIO, B, F, T., 2017).
Fig.1 – Micotoxinas no trigo
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ZEARALENONA (ZEA)
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É uma micotoxina não esteroidal, cujo principal metabólito é α-zearalenol com efeitos estrogênicos, que pode causar distúrbios reprodutivos como a síndrome de estrogenismo;
O cenário clínico de intoxicação por ZEA varia de acordo com a quantidade de toxinas ingeridas, período de ingestão, sexo e estágio reprodutivo de cada paciente.  (TEIXEIRA, L, C et al, 2011).
Ocorre principalmente, no milho contaminado por F. graminearum e F. culmorum. Esta toxina é um análogo do estrógeno e causa o hiperestrogenismo em suínos femininos (IAL, 2008);
Os porcos são particularmente expostos à zearalenona por terem sua dieta geralmente composta de milho e por serem particularmente sensíveis aos seus efeitos tóxicos;
Fonte: Envirologix
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PATULINA
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É produzida por diversos tipos de fungos, no entanto, o Penicillium expansum apresenta-se como o mais importante deles, devido a sua capacidade de produzir grandes quantidades da micotoxina, podendo infectar diferentes frutas e vegetais, porém tem preferência por maçãs sendo os produtos alimentícios à base dela as principais fontes de exposição à patulina para os seres humanos;
Há evidências que a intoxicação aguda poderia levar a complicações de saúde como: hiperemia gástrica e duodenal, distensão abdominal, lesões histopatológicas incluindo ulceração e inflamação do estômago e do intestino;
A maçã e seus derivados são os alimentos que possuem uma maior incidência de contaminação por patulina devido as propriedades físico-químicas da fruta;
Além disso, diferentes origens genéticas e condições de crescimento moldam as características físicas e químicas da maçã, que determinam a capacidade de cicatrização de feridas, bem como a susceptibilidade ao desenvolvimento de bolor e patulina em maçãs silvestres ou cultivadas (BASSO, T. 2019).
401/IV Determinação de aflatoxina M1 em leite por cromatografia em camada delgada:
Este método baseia-se na extração com solvente orgânico, limpeza com celite e partição liquido-liquido, extração com clorofórmio, separação por cromatografia em camada delgada (CCD), quantificação visual por comparação com padrão e confirmação por derivatização com ácido trifluoroacético. O limite de quantificação do método é 0,3 µg/L; 
 
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402/IV Determinação de aflatoxina M1 em leite por CCD ou CLAE após separação em coluna de imunoafinidade: 
Aflatoxina M1 parece estar associada à fração protéica do leite (caseína), estando assim presente não somente nos tipos fluido ou em pó como também em seus produtos derivados. Este método é aplicado para determinação de Aflatoxina M1 em amostras de leite. O limite de quantificação (LQ) do método é 0,02 µg/L;
403/IV Determinação de aflatoxinas por cromatografia em camada delgada:
Este método é aplicado para a determinação de aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 em sementes oleaginosas, cereais e seus produtos e também em rações. As aflatoxinas são extraídas com clorofórmio e com posterior remoção de interferentes por partição líquida com metanol-água-hexano. Os componentes são determinados pela comparação da intensidade de fluorescência das amostras com a dos padrões por cromatografia em camada delgada. O método pode alcançar um limite de detecção de 2,0 µg/kg (ppb) e limite de quantificação de 3,0 µg/kg (ppb);
METÓDOS DE ANÁLISE
 
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404/IV Determinação de aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 por CCD após separação em coluna de imunoafinidade:
O objetivo do método refere-se à determinação das aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 em milho, amendoim e produtos derivados. As aflatoxinas são extraídas com solução aquosa de metanol e purificadas em uma coluna de imunoafinidade, onde anticorpos monoclonais específicos ligam-se aos antígenos, as aflatoxinas, sendo posteriormente eluídas, cromatografadas em placas de sílica gel e visualizadas as fluorescências sob luz ultravioleta. O limite de quantificação (LQ) do método é 2 µg/kg;
METÓDOS DE ANÁLISE
405/IV Determinação de desoxinivalenol:
O princípio do método baseia-se na extração da micotoxina com mistura de solventes, purificação em uma coluna de carvão, eluição, cromatografia em cromatoplacas de sílica gel G, derivatização com AlCl3 e visualização do composto fluorescente formado; 
406/IV Determinação de fumonisina B por CCD ou CLAE, após separação em coluna de imunoafinidade:
Este método é aplicável para a determinação da Fusarium moniliforme em milho e produtos derivados, utilizando coluna de imunoafinidade, onde anticorpos monoclonais específicos ligam-se aos antígenos, as fumonisinas, sendo posteriormente eluídos e separados pelas técnicas: cromatografia em camada delgada (LQ: 1 mg/kg) ou por cromatografia liquida de alta eficiência (LQ=0,78 mg/kg);
 
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METÓDOS DE ANÁLISE
407/IV Determinação de aflatoxinas, ocratoxina A e zearalenona por cromatografia em camada delgada:
Aplicado para a determinação simultânea de aflatoxinas (B1, B2, G1 e G2), ocratoxina A e zearalenona em diversos alimentos. O limite de quantificação do método é 2,0 µg/kg;
408/IV Determinação de ocratoxina A em café verde por CCD e CLAE após separação por coluna de imunoafinidade – Método 1:
A principal matéria-prima alimentar que pode apresentar contaminação com ocratoxina A é o cereal. Os sucos de uva, vinhos tintos, cafés, cacau, frutas secas, entre outros produtos, também podem apresentar o mesmo problema. Limite de detecção (LD) por CCD = 3 µg/kg e LD por CLAE = 0,6 µg/kg;
409/IV Determinação de ocratoxina A em café verde por CCD e CLAE após separação por coluna de imunoafinidade - Método 2 
 
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METÓDOS DE ANÁLISE
410/IV Determinação de ocratoxina A em café cru em grão por cromatografia em camada delgada:
Refere-se a determinação simultânea de Aflatoxinas (B1, B2, G1 e G2), ocratoxina A e zearalenona em arroz, amendoim, feijão, milho, mandioca e, com algumas pequenas modificações, a determinação específica de ocratoxina A (OTA) em café cru em grão;
411/IV Determinação de patulina em suco de maçã:
Este método é aplicável às análises de patulina em amostras de suco e concentrados de maçã, cujo limite de quantificação (LQ) é igual a 25 µg/L.
Fig.1 - CCD
Fig.2 - Cromatografia Liquida de Alta Eficiência- CLAE
MÉTODOS DE ANÁLISE
401/IV Determinação de aflatoxina M1 em leite por cromatografia em camada delgada:
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Agite 75 mL de leite com 300 mL de metanol e 25 g de celite em frasco Erlenmeyer, por 30 min em agitador mecânico;
Filtrar em papel de filtro, recolha a fase metanólica em funil de separação e adicionar 225 mL de solução de NaCl a 4%. Acrescentar 100 mL de hexano e agitar por 3 min; 
. Recolher a fase metanólica e descartar a fase hexânica. Repetir mais 2x. Adicionar 100 mL de clorofórmio na fase metanólica, agitar por 3min e recolher o clorofórmio. Repetir 2x;
Evapore o conteúdo do frasco âmbar sob corrente de nitrogênio até resíduo e proceda à separação e quantificação; 
Recolha o clorofórmio, evapore até próximo à secura e transfira,quantitativamente com clorofórmio, para um frasco âmbar;
Junte as porções de clorofórmio em um funil de separação e adicione 300 mL de NaCl a 4%. Agite e filtre a fase clorofórmica em papel de filtro com sulfato de sódio anidro;
Ressuspenda a AFM1 com 100 µL de tolueno-acetonitrila). Aplique, sobre a placa cromatográfica, 20 µL deste extrato e também pontos de 1 a 5 µL de solução-padrão de AFM1 a 0,2 µg/mL. 
Compare a intensidade de fluorescência da mancha da AFLAM1 da amostra com as do padrão determinando qual mancha do padrão corresponde à da amostra;
Se a intensidade da fluorescência da amostra for maior ou menor que a dos padrões, dilua ou concentre e recromatografe. 
404/IV Determinação de aflatoxinas B1 , B2 , G1 e G2 por CCD após separação em coluna de imunoafinidade:
O objetivo do método refere-se à determinação das aflatoxinas B1 , B2 , G1 e G2 em milho, amendoim e produtos derivados. As aflatoxinas são extraídas com solução aquosa de metanol e purificadas em uma coluna de imunoafinidade, onde anticorpos monoclonais específicos ligam-se aos antígenos, as aflatoxinas, sendo posteriormente eluídas, cromatografadas em placas de sílica gel e visualizadas as fluorescências sob luz ultravioleta. O limite de quantificação (LQ) do método é 2 µg/kg (IAL, 2008).
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Procedimento para preparação da amostra
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 Pese 50 g da amostra previamente triturada, e 4 g de NaCl, e transfira para o copo do liqüidificador juntamente com 250 mL de uma solução de metanol-água deionizada. Triture por 1 minuto em alta velocidade. 
Após o tempo, adicione 250 mL de água deionizada. Misture e filtre aproximadamente (25 a 50) mL em papel de filtro Whatman. Transfira 10 mL do filtrado para a seringa de vidro acoplada à coluna de imunoafinidade sobre o manifold. 
Na coluna de imunoafinidade, passe a amostra em um fluxo de 2 a 3 mL por min, lave com 20 mL de água deionizada e elimine toda a água residual da coluna. Elua as aflatoxinas passando 2 mL de metanol e colete em frasco âmbar. Evapore até à secura sob corrente de N
404/IV Determinação de aflatoxinas B1 , B2 , G1 e G2 por CCD após separação em coluna de imunoafinidade:
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CCD: Ressuspenda o resíduo em clorofórmio ou toluenoacetonitrila em quantidade adequada, normalmente 100 µL e utilize banho de ultra-som por cerca de 30s para assegurar total dissolução das aflatoxinas. Aplique, em cromatofolha ou cromatoplaca de sílica gel, 10 µL da amostra 2x. 
Sobre a 2ª mancha do extrato, aplique uma quantidade adequada dos padrões (B1, B2, G1, G2). Na mesma placa aplique: 1, 3, 5 e 7 µL de padrão de aflatoxinas. Desenvolva o cromatograma em cuba cromatográfica previamente saturada com tolueno-acetato de etila-ácido fórmico (5:4:1) ou clorofórmio-acetona.
Remova a placa após 12 cm de desenvolvimento e deixe secar naturalmente ao ar. Sob luz UV de comprimento de onda longa, localize as manchas fluorescentes com o mesmo Rf e mesma tonalidade do padrão. As amostras suspeitas de conterem aflatoxinas devem ser quantificadas e confirmadas.
Quantificação: Para a quantificação de aflatoxinas, separe-as previamente desenvolvendo as placas em clorofórmio-acetona ou tolueno-acetato de etila-ácido fórmico. 
Compare a intensidade da fluorescência da mancha da amostra com a do padrão e determine qual das manchas da amostra corresponde a um dos padrões.
Se a intensidade da fluorescência da mancha de menor volume de amostra for maior que a do padrão, faça a diluição necessária e recromatografe.
402/IV Determinação de aflatoxina M1 em leite por CCD ou CLAE após separação em coluna de imunoafinidade:
Este método baseia-se na extração com solvente orgânico, limpeza com celite e partição liquido-liquido, extração com clorofórmio, separação por cromatografia em camada delgada (CCD), quantificação visual por comparação com padrão e confirmação por derivatização com ácido trifluoroacético. O limite de quantificação do método é 0,3 µg/L (IAL, 2008).
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Agite 75 mL de leite com 300 mL de metanol e 25 g de celite em frasco Erlenmeyer, por 30 min, em agitador mecânico. Filtre em papel de filtro, recolha a fase metanólica em funil de separação e adicione 225 mL de solução de NaCl a 4%;
Acrescente 100 mL de hexano e agite por 3 min. Recolha a fase metanólica e descarte a fase hexânica. Repetir 2x. Adicione 100 mL de clorofórmio na fase metanólica e agite por 3min e recolha o clorofórmio; 
Repita esta operação mais duas vezes. Junte as porções de clorofórmio em um funil de separação e adicione 300 mL de solução de NaCl a 4%;
Ressuspenda a AFM1 com 100 µL de tolueno-acetonitrila (9:1). Aplique, sobre a placa cromatográfica, 20 µL deste extrato e também pontos de 1 a 5 µL de solução-padrão de AFM1 a 0,2 µg/mL;
Evapore o conteúdo do frasco âmbar sob corrente de nitrogênio até resíduo e proceda à separação e quantificação;
Agite e filtre a fase clorofórmica em papel de filtro com sulfato de sódio anidro. Recolha o clorofórmio, evapore até próximo à secura e transfira, quantitativamente com clorofórmio, para um frasco âmbar;
Desenvolva a placa em fase móvel de clorofórmioacetona-isopropanol (87:10:3). Seque a placa na temperatura ambiente e visualize sob luz UV (λ=366 nm);
Quantificação: Compare a intensidade de fluorescência da mancha da aflatoxina M1 da amostra com as do padrão, determinando qual mancha do padrão corresponde à da amostra;
Se a intensidade da fluorescência da amostra for maior ou menor que a dos padrões, dilua ou concentre e recromatografe.
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FUMONISINAS
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Micotoxinas em alimentos e seus métodos de análise
SILVA, J, O.; CÂNDIDO, L, M, B. et al Ocorrência de aflatoxinas em arroz consumido por militares do exército brasileiro por cromatografia em camada delgada e cromatografia líquida de alta eficiência Ciênc. agrotec., Lavras, v. 32, n. 4, p. 1238-1244, jul./ago., 2008.
IAMANAKA, B, T.; OLIVEIRA, S, I.; TANIWAKI.; M, H. Micotoxinas em Alimentos. Universidade Federal de Pernambuco. Anais da academia pernambucana de ciências agronômica, Vol.7, p. 138-161, 2010.
GABRIEL, L, C.; PEREIRA, C, B. et al Avaliação da resistência de genótipos de milho pipoca ao acúmulo de fumonisinas e à podridão de fusarium da espiga. Summa phytopathol. vol.44 no.3 Botucatu July/Sept. 2018. 
ABREU, A, R.; ARMENDÁRIZ, C, R. et al La ocratoxina A en alimentos de consumo humano: revisión. Nutrição hospitalaria, 26(6):1215-1226. Espanha, 2011. 
 SALVAT, A, E.; BALBUENA, O. et al Presencia de zearalenona en pasturas del este de Chaco. Repositorio Institucional Biblioteca Digital. Argentina, abril, 2013.	
REFERÊNCIAS
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Micotoxinas em alimentos e seus métodos de análise
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INÁCIO, B, F, T.; Avaliação Do Risco À Exposição A Micotoxinas (De Aflatoxinas E Ocratoxina A E De Desoxinivalenol E Zearalenona), Por Via Alimentar Em Crianças E Jovens. Dissertação de mestrado, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia. Novembro, 2017.
BASSO, T. Quantificação De Patulina Em Sucos De Maçã Disponíveis No Mercado Sul Brasileiro. Dissertação de mestrado, Universidade Fernando Pessoa. Porto, julho de 2019.
KWIATKOWSKI, A.; ALVES, A, P, F. Importância Da Detecção E Do Controle De Aflatoxinas Em Alimentos. Revista de Saúde e Biologia, v. 2, n. 2 p. 45-54. dezembro de 2007.
MAZIERO, M, T.; BERSOT, L, S. Micotoxinas Em Alimentos Produzidos No Brasil. Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, v.12, n.1, p.89-99, 2010 ISSN 1517-8595. 2010. 
REFERÊNCIAS
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