Colheita de embriões

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Universidade Estadual do Ceará 
Faculdade de Veterinária 
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias 
 
Edilson Soares Lopes Júnior 
 
 
 
 
COLHEITA, CRIOPRESERVAÇÃO E 
TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES OVINOS DA 
RAÇA MORADA NOVA (VARIEDADE BRANCA) 
EM UM PROGRAMA DE PRESERVAÇÃO 
 
 
 
 
 
 
 
Fortaleza – Ceará 
Dezembro – 2005 
 
 
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L864c Lopes Júnior, Edilson Soares 
 Colheita, criopreservação e transferência de embriões 
ovinos da raça Morada Nova (variedade branca) em um 
programa de preservação / Edilson Soares Lopes Júnior.__ 
Fortaleza, 2005. 
 142p. 
 Orientador: Prof. Dr. Vicente José de Figueirêdo Freitas 
 Tese (Doutorado Acadêmico em Ciências Veterinárias) 
– Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária. 
 1. Ovino. 2. Transferência de embriões. I. Universidade 
Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária. 
 CDD: 636.3 
 
 
3 
Universidade Estadual do Ceará 
Faculdade de Veterinária 
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias 
 
Edilson Soares Lopes Júnior 
 
 
 
COLHEITA, CRIOPRESERVAÇÃO E 
TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES OVINOS DA 
RAÇA MORADA NOVA (VARIEDADE BRANCA) 
EM UM PROGRAMA DE PRESERVAÇÃO 
 
 
Tese apresentada ao Curso de Doutorado em 
Ciências Veterinárias do Programa de Pós-
Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade 
de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, 
como requisito parcial para a obtenção do grau de 
Doutor em Ciências Veterinárias. 
Área de Concentração: Reprodução Animal. 
Orientador: Prof. Dr. Vicente José de Figueirêdo 
Freitas. 
 
 
 
Fortaleza – Ceará 
Dezembro – 2005 
 
 
4 
Universidade Estadual do Ceará 
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias 
 
Título do trabalho: Colheita, criopreservação e transferência de embriões ovinos da 
raça Morada Nova (variedade branca) em um programa de 
preservação 
 
Autor: Edilson Soares Lopes Júnior 
 
Defesa em: 14/12/2005 Conceito obtido: _____________ 
 Nota obtida: ________________ 
 
 
Banca Examinadora: 
 
____________________________________ 
Vicente José de Figueirêdo Freitas, Prof. Dr. 
Orientador 
 
 
_____________________________________ _____________________________ 
Arturo Bernardo Selaive Villarroel, Prof. Dr. Davide Rondina, Prof. Dr. 
 Examinador / Co-orientador Examinador / Co-orientador 
 
_____________________________ _____________________________________ 
 Aurino Alves Simplício, Dr. Marcos Antônio Lemos de Oliveira, Prof. Dr. 
 Examinador Examinador 
 
____________________________________ 
Ana Paula Ribeiro Rodrigues, Profa. Dra. 
Examinadora 
 
 
5 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Aos estudantes de iniciação científica, 
minha razão de existir, enquanto 
profissional de ensino e pesquisa, 
 
Dedico. 
 
 
6 
AGRADECIMENTOS 
 
À Deus, por me dar força e perseverança para alcançar meus objetivos na 
estrada difícil e tortuosa da vida. 
À minha mãe, Maria de Lourdes Costa Lopes, por me manter 
economicamente e sempre me mostrar que, embora na rua eu ainda tenha pessoas que 
me queiram mal, eu sempre vou ter o seu colo pra chorar e recarregar as minhas 
forças, me concedendo, ainda a oportunidade de ver meus desafetos tombarem na 
minha frente, mesmo sem mover uma palha pra que isso aconteça. 
A meu pai, Edilson Soares Lopes, por me servir de exemplo de profissional, 
executando com seriedade as atividades ligadas ao engrandecimento técnico e 
científico, mas também por me ensinar a ser honesto e a, não só, assumir os meus 
erros, mas também pagar por eles. 
À Rita de Cássia Soares Cardoso, minha companheira de sempre, por 
manter-se sempre à minha disposição, atendendo à maioria das minhas necessidades e 
nunca desistindo de estar perto de mim, me incentivando e me dando alento nos piores 
momentos. 
Ao meu orientador e amigo Prof. Dr. Vicente José de Figueirêdo Freitas, 
por participar ativamente do meu experimento nos momentos mais necessários e 
difíceis, por me ensinar que orientador pode errar e pedir desculpas ao seu orientando 
e por sempre confiar em mim, me dando a grande responsabilidade de, junto, com 
meus colegas de pós-graduação, ajudar a moldar o caráter técnico-científico e pessoal 
de estudantes de iniciação científica. Além disso, por me apresentar o delicioso ato de 
lecionar, minha razão de existir, enquanto profissional. 
Ao Prof. Dr. Arturo Bernardo Selaive Villaroel pelas sugestões realizadas 
tanto durante o experimento, como na tese, bem como pela concessão das doadoras e 
receptoras de embriões utilizadas no experimento. Além disso, pela oportunidade de 
poder, mesmo por pouco tempo, ministrar aulas para os alunos de graduação e de pós-
graduação do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Ceará. 
Ao Prof. Dr. Davide Rondina, pelas sugestões realizadas durante o 
experimento, bem como pela execução da análise estatística dos dados coletados. 
 
 
7 
Ao Prof. Dr. Marcos Antônio Lemos de Oliveira, pelas sugestões realizadas 
durante o experimento e pela oportunidade de trabalhar com um de seus estudantes de 
mestrado, por ocasião das ultra-sonografias das receptoras de embriões, visando o 
diagnóstico de gestação das mesmas. 
Ao Dr. Aurino Alves Simplício, pelas sugestões realizadas tanto durante o 
experimento, como na tese, bem como pela constante orientação profissional, a qual 
decorre de 1999, por ocasião de meu estágio supervisionado na EMBRAPA-CNPC, e 
continua até hoje, indicando as possíveis possibilidades dentro do meio acadêmico-
científico. 
À Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues, pelas sugestões realizadas na 
tese. 
À Dra. Alfa Maria Gurgel de Almeida do Laboratório Clementino Fraga, 
pelas dosagens de progesterona realizadas de forma eficiente. 
A todos os pesquisadores, professores e funcionários do Programa de Pós-
Graduação em Ciências Veterinárias que, direta ou indiretamente, contribuíram para a 
execução do meu curso de doutorado. 
Ao funcionário e amigo Selmar Alves da Silva, pelo rotineiro e importante 
trabalho de manejo e observação dos animais experimentais. 
Ao funcionário e amigo Antônio César Camelo, por ser, pra mim, um 
exemplo de trabalhador, procurando, de forma incansável, algo pra colaborar, bem 
como por me fazer sorrir, mesmo nos momentos mais tempestuosos. 
Aos funcionários do Setor de Transportes da Universidade Estadual do 
Ceará, pela concessão de veículos para transportar os animais experimentais. 
Aos estudantes de graduação do curso de Zootecnia, bem como mestrandos 
e doutorandos do Setor de Caprino e Ovinocultura do Centro de Ciências Agrárias da 
Universidade Federal do Ceará, nas pessoas do doutorando Antônio Nunes de Oliveira 
e dos mestrandos Ludmila Beliche Alves Costa e Michael Nogueira de Medeiros, pelo 
apoio e ajuda constante ao experimento, quando realizado nas dependências do Setor 
de Caprino e Ovinocultura do Centro de Ciências Agrárias da UFC e da Fazenda Vale 
do Curu, em Pentecoste. 
 
 
8 
Aos funcionários da Fazenda-Escola Vale do Curu, situada em Pentecoste, 
pelo transporte, alojamento, refeições e ajuda nos centros de manejo. 
Ao colega Maico Henrique Barbosa dos Santos, pela execução dos 
diagnósticos de gestação das receptoras. 
A turma de doutorado 2005.2, pelo companheirismo demonstrado, por 
ocasião das disciplinas e dos poucos momentos de lazer. 
Ao amigo e irmão Emanuel Luís Maciel Medeiros Maia, por ser a minha 
concepção de estudante de iniciação científica, bem como por executar, muitas vezes 
de forma incansável, o nosso experimento, por me dar força em vários momentos 
difíceise por me encher de orgulho a cada sucesso seu, inclusive obtendo o primeiro 
lugar na competição de estudantes de iniciação científica da Semana Universitária da 
UECE de 2004, apresentando uma parte da presente tese. 
À amiga Juliana Bezerra Lima Verde, por manipular os embriões nas 
primeiras sessões de colheita e por me ensinar a, sempre, saber recomeçar na vida, 
com o mesmo entusiasmo e força. 
Aos amigos Dárcio Ítalo Alves Teixeira e Ney Rômulo de Oliveira Paula, 
pelas participações efetivas nas colheitas e manipulações dos embriões, bem como 
pelo constante respeito a minha pessoa, mesmo nas condições mais adversas, onde nos 
deparávamos com certas diferenças de pensamento. 
Ao já amigo João Batista Cajazeiras, por, mesmo sem me conhecer direito, 
confiar em mim e me dar força nos últimos momentos da minha tese. Além disso, por, 
nos momentos em que estive ausente, proteger e ajudar aos meus entes mais queridos 
do nosso ambiente de trabalho. 
À Maria Luciana Lira de Andrade, por me mostrar como o “diferente” pode 
ser tão belo como o “igual”, bem como por me permitir fazer parte da sua estória 
profissional e pessoal, me dando lições de vida em cada um de seus atos que, para 
alguns, possam não significar nada, mas que, para mim, representaram um novo sopro 
de vida a cada “bom dia” ou a cada tradicional café da manhã tomado em nosso 
laboratório. 
Às amigas Karlliely de Castro Almeida, Alexsandra Fernandes Pereira, 
Camila Pontes Albuquerque, Deborah Melo Magalhães, Raylene Ramos Moura e à 
 
 
9 
Suely Reanata Gaya Avelar, pelas, essenciais, lealdade e credibilidade. Estas pessoas 
nunca deixaram de crer em mim, como profissional e, acima de tudo, como ser 
humano, fechando os ouvidos pra todas as injúrias, difamações e calúnias declaradas 
sobre mim. 
Aos amigos Iracelma Julião de Arruda, Aline Lima de Sousa e Anderson 
Pinto Almeida, pela ajuda no experimento, parceria e ensinamentos passados, me 
mostrando que a gente sempre tem o que aprender um com o outro. 
Ao amigo italiano Giaime Niccolai pela importante ajuda no experimento, 
pela constante vontade de aprender, pelo bom humor ao trabalhar, pelo 
companheirismo e por constituir-se num grande amigo nos momentos adversos. 
À menina luz Janaína Bittencourt Loos, por me guiar nos momentos mais 
difíceis. 
Aos(às) colegas Elizabeth Saraiva Peixoto Pinheiro, Roberto Maia Matos, 
Daniel Holanda Soares, João Davi Araújo da Silva, Francisco Carlos de Sousa e 
Isadora Machado Teixeira Lima, pelo apoio extremamente eficiente e importante 
no desempenho das minhas funções como colaborador do Setor de Caprino e 
Ovinocultura da Universidade Estadual do Ceará e como membro do Laboratório 
de Fisiologia e Controle da Reprodução. 
Ao amigo e caprinocultor Tufy Said, proprietário do Capril do Said, pela 
credibilidade confiada ao Médico Veterinário Edilson Soares Lopes Júnior. 
Aos amigos e colaboradores Marcílio e Maurício Chaves, proprietários do 
Capril do Estácio, pela confiança e credibilidade confiada ao Médico Veterinário 
Edilson Soares Lopes Júnior, consultando a nossa equipe, a cada passo dado, bem 
como colaborando com o Setor de Caprino e Ovinocultura da UECE em diversos 
aspectos, não esperando nada em troca. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
10 
RESUMO 
 
A fim de verificar as variáveis envolvidas na produção in vivo de embriões de 
ovinos Morada Nova (variedade branca) e posterior transferência dos embriões congelados-
descongelados, 25 ovelhas adultas foram utilizadas como doadoras e 14 ovelhas mestiças, 
como receptoras. Após tratamento de sincronização de estro e superovulação, as doadoras 
foram submetidas à colheita de embriões por laparotomia. Os embriões criopreservados pelo 
método clássico foram descongelados em etilenoglicol (ETG) ou sacarose (SAC). As ovelhas 
receptoras, após sincronização do estro, foram inovuladas por semi-laparoscopia. O 
diagnóstico de gestação por ultra-sonografia foi realizado 30 dias após a inovulação. 
Verificou-se que as ovelhas doadoras jovens (≤ 2 anos) apresentaram melhores resultados do 
que doadoras mais velhas (> 3 anos), no que diz respeito à taxa de ovulação, estruturas 
colhidas e fecundadas. As análises de regressão linear e multifatorial demonstraram que a taxa 
de ovulação total e o número de embriões colhidos são as variáveis mais importantes na 
predição do número de embriões congeláveis. Os embriões descongelados em ETG 
apresentaram maiores taxas de sobrevivência e de fertilidade quando comparados aos 
descongelados em SAC. Em conclusão, a conservação de ovelhas Morada Nova (variedade 
branca) pode ser efetuada através do processo de múltipla ovulação e transferência de 
embriões, sendo que a idade da doadora, a taxa de ovulação e o número de embriões colhidos 
interferem no sucesso do processo. Finalmente, os embriões devem ser descongelados em 
ETG antes de sua transferência para receptoras. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
11 
ABSTRACT 
 
In order to verify the variables linked to in vivo embryo production and transfer of 
frozen-thawed embryos in Morada Nova (variety white) sheep breed, twenty-five adult ewes 
were used as embryo donors and 14 crossbred ewes as embryo recipients. After estrus 
synchronization and superovulatory treatments, donors were subjected to embryo recovery by 
laparotomy. Frozen embryos by classic freezing were thawed in ETG or in sucrose (SUC). 
After estrus synchronization, embryo recipients were subjected to embryo transfer that it was 
performed by semi-laparoscopy. Pregnancy was diagnosed 30 days after embryo transfer by 
ultrasound. Considering ovulation rate, recovered and fertilized structures, it was verified that 
young embryo donors (≤ 2 anos) presented better results than old ones (> 3 anos). Simple and 
multifactor linear regression analysis showed that ovulation rate and number of recovered 
embryos are the most important variables predicting the number of embryos to be frozen. 
ETG group showed higher embryo survival and fertility rate than compared to SUC group. In 
conclusion, preserving of Morada Nova (variety white) ewes can be performed using multiple 
ovulation and embryo transfer with age of embryo donor, ovulation rate and the number of 
recovered embryos influencing in the success of procedure. In addition, embryos might be 
thawed in ETG before to be transferred to recipients. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
12 
SUMÁRIO 
 
Lista de abreviaturas e/ou símbolos.............................................................................. 14 
Lista de figuras e tabelas .............................................................................................. 17 
Introdução .................................................................................................................... 20 
Capítulo 1: Revisão de Literatura................................................................................. 22 
 1.1. Caracterização da raça Morada Nova ........................................................... 23 
1.2. Uso de tecnologias reprodutivas na preservação de rebanhos nativos.......... 25 
 1.3. Produção in vivo de embriões........................................................................ 27 
 1.3.1. Sincronização do estro ........................................................................ 27 
 1.3.2. Superovulação ..................................................................................... 28 
 1.3.3. Fecundação ......................................................................................... 30 
 1.3.4. Colheita de embriões........................................................................... 31 
 1.3.5. Avaliação e classificação dos embriões............................................... 38 
 1.3.6. Criopreservação de embriões............................................................... 41 
 1.3.7. Inovulação............................................................................................49 
Justificativa .................................................................................................................. 51 
Hipótese Científica ....................................................................................................... 52 
Objetivos....................................................................................................................... 53 
Geral .................................................................................................................... 53 
Específicos ........................................................................................................... 53 
Capítulo 2: Efeito da idade da doadora sobre a produção embrionária em ovelhas 
Morada Nova (variedade branca) participando de um programa de conservação 
no Brasil............................................................................................................... 54 
2.1. Material e métodos........................................................................................ 55 
2.2. Resultados..................................................................................................... 57 
2.3. Discussão....................................................................................................... 62 
2.4. Conclusões..................................................................................................... 65 
2.5. Referências bibliográficas............................................................................. 65 
 
 
13 
Capítulo 3: Perfis de progesterona, taxa de ovulação, produção de embriões e 
sobrevivência, após inovulação em receptoras, de embriões da raça Morada 
Nova (variedade branca)...................................................................................... 69 
3.1. Material e métodos........................................................................................ 70 
3.2. Resultados..................................................................................................... 74 
3.3. Discussão....................................................................................................... 80 
3.4. Conclusões..................................................................................................... 86 
3.5. Referências bibliográficas............................................................................. 86 
Discussão geral .............................................................................................................91 
Conclusões gerais .........................................................................................................94 
Perspectivas .................................................................................................................. 94 
Referências bibliográficas............................................................................................. 95 
Anexos........................................................................................................................ 111 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
14 
LISTA DE ABREVIATURAS E/OU SÍMBOLOS 
 
• ANOVA = Análise de Variância 
• ARCO = Associação Brasileira de Criadores de Ovinos 
• Be = Blastocisto eclodido 
• Bi = Blastocisto inicial 
• Bl = Blastocisto 
• Bn = Blastocisto em eclosão 
• BSA = Bovine Serum Albumin (Albumina Sérica Bovina) 
• Bx = Blastocisto expandido 
• 1 C = 1 célula 
• 2 C = 2 células 
• 4 C = 4 células 
• 8 C = 8 células 
• CaCl2 = Cloreto de cálcio 
• CENARGEN = Centro Nacional de Pesquisa de Recursos Genéticos e 
Biotecnologia 
• CIDR = Controlled Internal Device Release (Dispositivo Interno de Liberação 
Controlada) 
• CLs = Corpos lúteos 
• DMSO = Dimetil-sulfóxido 
• dp = desvio padrão 
• DPBS = Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (Solução Salina Fosfato-
Tamponada de Dulbecco) 
• eCG = Equine Chorionic Gonadotrophin (Gonadotrofina Coriônica Eqüina) 
• EMBRAPA = Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária 
• ep = erro padrão 
• EPV = espaço perivitelínico 
• et al. = e outros (e colaboradores) 
• ETG = etilenoglicol 
 
 
15 
• F = fecundação 
• FGA = fluorogestone acetate (acetato de fluorogestona) 
• FSH = Follicle Stimulating Hormone (Hormônio Folículo Estimulante) 
• G = gravidade 
• g = gramas 
• GnRH = Gonadotrophin Releasing Hormone (Hormônio Liberador de 
Gonadotrofina) 
• h = hora 
• H2O = água 
• I = Implantação 
• IBGE = Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística 
• IEP = Intervalo entre-partos 
• KCl = Cloreto de potássio 
• kg = kilograma 
• K2HPO4 = Fosfato de Potássio Dibásico 
• LFCR = Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução 
• LH = Luteinyzing hormone 
• MAP = Medroxiprogesterone acetate (acetato de medroxiprogesterona) 
• Mi = mórula inicial 
• min = minutos 
• Mc = mórula compacta 
• MgCl2 = Cloreto de magnésio 
• MHz = megahertz 
• mm = milímetro 
• mg = miligramas 
• mL = mililitro 
• M = Mórula 
• M = Molar 
• MOTE = Múltipla Ovulação e Transferência de Embriões 
• n = número 
 
 
16 
• NaCl = cloreto de sódio 
• Na2HPO4 = Fosfato de sódio dibásico 
• ng = nanogramas 
• NRC = National Research Council (Conselho Nacional de Pesquisa) 
• O = oócito 
• OPS = Palheta Estreita e Aberta 
• Ov = ovário 
• P = probabilidade 
• PBS = Phosphate Buffered Saline (Solução Salina Fosfato-Tamponada) 
• pFSH = Porcine Follicle Stimulating Hormone (Hormônio Folículo-Estimulante 
Suíno) 
• PGE1 = Prostaglandina E1 
• PGF2α = Prostaglandina F2α 
• PN = pró-nuclear 
• PV = peso vivo 
• r = coeficiente de correlação 
• RE – IE = retirada da esponja e início do estro 
• RPCL = regressão prematura de corpo lúteo 
• rpm = rotações por minuto 
• SAC = sacarose 
• SAS = Statistical Analysis System 
• SE = sem estro 
• SEM = standard error mean (erro padrão da média) 
• TCM-199 = tissue culture medium 199 (meio de cultivo tecidual 199) 
• TRA = Tecnologias reprodutivas assistidas 
• U = útero 
• µg = microgramas 
• UI = unidades internacionais 
• µL = microlitros 
• vs = versus 
 
 
17 
 LISTA DE FIGURAS E TABELAS 
 
Lista de Figuras 
 
• Figura 1 – Machos e fêmeas da raça Morada Nova (variedade vermelha)........ 24 
• Figura 2 – Machos e fêmeas da raça Morada Nova (variedade branca)............ 25 
• Figura 3 – Diferentes estruturas encontradas no trato genital de cabras e ovelhas 
entre a ovulação e a implantação. (Ov = ovário, O = oócito, F = fertilização, 
PN = pré-nuclear, 1 C = 1 célula, 2 C = 2 células, 4 C = 4 células, 
8 C = 8 células, M = Mórula, Bl = Blastocisto, I = Implantação, 
U = útero)........................................................................................................... 34 
• Figura 4 – Disposição dos instrumentos para a colheita de embriões por 
laparoscopia em pequenos ruminantes............................................................... 36 
• Figura 5 – Distribuição da ocorrência de estro em ovelhas Morada Nova 
(variedade branca) submetidas a um tratamento superovulatório. 
(SE: sem estro)................................................................................................... 59 
• Figura 6 – Estruturas recuperadas de ovelhas Morada Nova (variedade branca), 
submetidas a tratamento superovulatório: (A) não-fecundadas, a um aumento 
de 400 X; (B) zona pelúcida rompida, a um aumento de 200 X; (C) mórula, a 
um aumento de 400 X; (D) vários embriões de boa qualidade recuperados de 
uma única doadora a um aumento de 400 X. Fotografias realizadas em 
microscópio invertido equipado com contraste de modulação de Hoffman...... 61 
• Figura 7 – Relação entre os perfis de progesterona (P4) de ovelhas 
superovuladas e o número de corpos lúteos funcionais no diada colheita de 
embriões............................................................................................................. 77 
• Figura 8 – Relação entre número de bons embriões de ovelhas superovuladas 
e o número de corpos lúteos funcionais no dia da colheita de embriões........... 77 
• Figura 9 – Relação entre o intervalo retirada da esponja e início do estro 
(RE-IE) de ovelhas superovuladas e o número de corpos lúteos funcionais 
no dia da colheita de embriões........................................................................... 78 
 
 
18 
• Figura 10 – Relação entre o intervalo retirada da esponja e início do estro 
(RE-IE) de ovelhas superovuladas e a concentração de progesterona (P4) 
no dia da colheita de embriões........................................................................... 78 
• Figura 11 – Relação entre os perfis de progesterona (P4) de receptoras 
ovinas e o número de corpos lúteos funcionais no dia da transferência de 
embriões............................................................................................................. 80 
 
Lista de Tabelas 
 
• Tabela 1 – Meio de colheita e conservação de embriões (solução Salina 
Fosfato Tamponada – PBS)............................................................................... 33 
• Tabela 2 – Efeito da repetição da colheita de embriões por laparotomia 
sobre a taxa de recuperação embrionária........................................................... 35 
• Tabela 3 – Taxa de recuperação embrionária após colheitas sucessivas de 
embriões por laparoscopia................................................................................. 37 
• Tabela 4 – Estádios embrionários e suas respectivas características................. 39 
• Tabela 5 – Qualidade embrionária e suas respectivas características................ 40 
• Tabela 6 – Resposta estral e ovulatória de ovelhas Morada Nova 
(variedade branca) submetidas a um tratamento superovulatório...................... 58 
• Tabela 7 – Taxas de ovulação e de regressão prematura de corpo lúteo 
(RPCL) de ovelhas Morada Nova (variedade branca) após tratamento 
superovulatório................................................................................................... 60 
• Tabela 8 – Taxas de recuperação e de fecundação de estruturas do lavado 
uterino em ovelhas Morada Nova (variedade branca) após tratamento 
superovulatório................................................................................................... 61 
• Tabela 9 – Resposta ovariana, concentração plasmática de progesterona (P4) 
de ovelhas Morada Nova (variedade branca) sem RPCL, no dia da colheita de 
embriões, bem como momento e duração do estro............................................ 75 
• Tabela 10 – Taxas de recuperação e de fecundação, em ovelhas 
Morada Nova (variedade branca) superovuladas sem RPCL............................ 75 
 
 
19 
• Tabela 11 – Qualidade de embriões colhidos de ovelhas Morada Nova 
(variedade branca) superovuladas...................................................................... 76 
• Tabela 12 – Coeficientes de correlação múltipla, utilizando o número 
de embriões colhidos (EMB) e a taxa de ovulação (TO) para 
prever o número de bons embriões (BONS) em ovelhas superovuladas 
da raça Morada Nova (variedade branca).......................................................... 79 
• Tabela 13 – Taxas de gestação e de parição, número de crias nascidas e 
sobrevivência embrionária em ovelhas mestiças submetidas à transferência de 
embriões............................................................................................................. 80 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
20 
Introdução 
 
A espécie ovina vem ganhando cada vez mais destaque na agropecuária 
mundial, destacando-se, sobretudo, na produção de carne e pele, deixando, já algum 
tempo, de constituir-se numa criação de subsistência. 
No tocante ao rebanho ovino brasileiro, este consiste de, aproximadamente, 
14 milhões de animais com, aproximadamente, 56% deles explorados na região 
Nordeste (IBGE, 2002). Além de destacar-se pelo seu efetivo, o rebanho ovino 
explorado no Nordeste assume grande importância como uma fonte alternativa de 
produção de proteína de elevado valor biológico. O rebanho ovino explorado nesta 
região é composto, em grande parte, por raças ovinas formadas a partir da adaptação e 
seleção natural de raças européias que foram trazidas para o Brasil na época da 
colonização. 
Geralmente, os ovinos nativos do Nordeste do Brasil são de pequeno porte, 
porém, eficientes em termos de adaptação, fertilidade, sobrevivência e resistência às 
doenças infecciosas e parasitárias. Os mesmos, até o momento, receberam pouca 
atenção no tocante ao melhoramento genético, não sendo, portanto, especializados na 
produção de carne ou de leite. 
Desta forma, raças prolíficas estão, gradativamente, substituindo raças 
locais as quais estão sendo consideradas sob risco de extinção. Todavia, uma raça 
utilizada em um sistema de baixa produção não é, necessariamente, menos 
economicamente produtiva que outra, utilizada em um sistema de alta produtividade 
(Gandini & Oldenbroek, 1999). Além disso, as condições de mercado e os sistemas de 
preço podem mudar de forma, relativamente, tão rápida que características 
consideradas de alto valor econômico hoje podem apresentar um baixo valor no futuro 
(Ruane, 2000). 
Uma das mais importantes raças ovinas exploradas no Nordeste do Brasil é 
a Morada Nova, a qual pode ser encontrada nas variedades vermelha e branca. Esta 
raça é caracterizada por apresentar uma alta prolificidade, quando comparada às 
demais raças ovinas existentes nesta região brasileira (Rajab et al., 1992). Contudo, 
assim como as demais raças locais, a Morada Nova (variedade branca) está em real 
 
 
21 
risco de extinção e o seu desaparecimento, provavelmente, acarretará na definitiva 
perda de características relevantes associadas à adaptabilidade às condições adversas. 
Em pequenos ruminantes, a múltipla ovulação e transferência de embriões 
(MOTE) é uma ferramenta não somente para o aumento da taxa reprodutiva de 
doadoras selecionadas (Cognié, 1999), no controle sanitário e no intercâmbio de 
germoplasma (Thibier & Guérin, 2000), mas também para a preservação de raças 
nativas em risco de extinção (Solti et al., 2000). 
Recentemente, na região Nordeste do Brasil, instituições governamentais de 
pesquisa e de ensino iniciaram um programa de conservação da raça Morada Nova 
(variedade branca) utilizando a MOTE. Contudo, a resposta das doadoras de embriões 
de várias raças ovinas é extremamente variável e, desta forma, vários fatores, dentre 
eles a idade das doadoras (Alabart et al., 2003), parecem ser responsáveis por essa 
variabilidade. Além disso, informações sobre a produção embrionária de raças ovinas 
locais exploradas no Nordeste do Brasil são escassas (Cordeiro et al., 2003). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
22 
CAPÍTULO 1 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
REVISÃO DE LITERATURA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
23 
1.1. Caracterização da raça Morada Nova 
 
Os ovinos da raça Morada Nova constituem-se numa das principais raças 
nativas de ovinos deslanados do Nordeste do Brasil, sendo explorados para carne e 
pele, as quais são altamente apreciadas nos mercados nacional e internacional. Por 
serem animais de pequeno porte e bem adaptados às condições climáticas do semi-
árido, são importantes, particularmente, nas pequenas e médias propriedades, onde 
constituem fontede proteína para alimentação da população rural (Fernandes et al., 
2001). 
No que concerne à origem desta raça, as raças primitivas de arietinos 
(ovinos descendentes do "Ovis aries") pareciam possuir genes para a produção de lã e 
genes para a produção de pêlos ou fibras meduladas. Portanto, as raças de formação 
mestiça, como a bordaleira de Portugal, apresentam a possibilidade de gerar ovinos 
deslanados, quando os seus descendentes forem submetidos a uma seleção natural num 
ambiente impróprio para o desenvolvimento da lã, como é o caso do Nordeste 
brasileiro, onde o ambiente dificultou a disseminação dos ovinos portadores de uma 
capa de lã (velo), enquanto que favoreceu aqueles despojados dela (os deslanados) e, 
portanto, recobertos de pêlos (ARCO, 2005). 
Segundo Otávio Domingues, que pesquisou a origem dos deslanados do 
Nordeste, e que os denominou de deslanados de Morada Nova, estes formavam uma 
população descendente do bordaleiro de Portugal, particularmente do bordaleiro 
churro (ARCO, 2005). 
Dessa maneira, tanto a variação genética como a ação seletiva do ambiente 
quente e seco do Nordeste agiram no sentido desfavorável à formação de lã, e 
favorável à multiplicação e sobrevivência dos indivíduos deslanados. Portanto, os 
ovinos Morada Nova são deslanados, mochos, podendo ser encontrados na pelagem 
vermelha ou branca. Além disso, os machos e as fêmeas têm peso variando de 40 kg a 
60 kg e de 30 kg a 50 kg, respectivamente. A cabeça destes animais apresenta-se larga, 
alongada, perfil sub-convexo, focinho curto bem proporcionado, orelhas bem inseridas 
na base do crânio e terminando em ponta, além de olhos amendoados. O pescoço 
apresenta-se bem inserido no tronco, com ou sem brincos. Já o corpo possui como 
 
 
24 
características uma linha dorso-lombar reta, admitindo-se ligeira proeminência de 
cernelha nas fêmeas. A garupa destes animais apresenta-se curta com ligeira 
inclinação, enquanto a cauda é fina e média, não passando dos jarretes. Com relação 
aos membros, estes se apresentam finos, bem aprumados e com cascos pequenos e 
escuros (ARCO, 2005). 
Animais da variedade vermelha (Figura 1) apresentam pelagem vermelha 
em suas diversas tonalidades, cor mais clara na região do períneo, bolsa escrotal, úbere 
e cabeça, pele escura, espessa, elástica e recoberta de pêlos curtos, finos e ásperos 
(ARCO, 2005). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1 – Machos e fêmeas da raça Morada Nova (variedade vermelha). 
Fonte: ARCO, 2005. 
 
Já aqueles da variedade branca (Figura 2) apresentam pelagem branca, 
sendo permissíveis mucosas e cascos claros. Apresentam, ainda, pele escura, espessa, 
elástica e resistente (ARCO, 2005). 
Com relação às sua eficiência reprodutiva, a ovelha Morada Nova, 
apresenta uma ciclicidade regular, apresentando estros a cada 17 dias. No que diz 
respeito à duração da gestação, esta apresenta duração de 150 dias, enquanto o 
intervalo entre-partos é considerado reduzido, quando comparado a outras raças 
deslanadas locais, como, por exemplo, a Santa Inês, a qual apresentou um intervalo 
entre-partos de 325,02 ± 7,66 dias contra 284,81 ± 5,17 dias de ovelhas Morada Nova 
 
 
25 
(Fernandes et al., 2001). Os autores atribuíram a aparente longa duração do intervalo 
entre-partos, em ambas as raças, à alta variabilidade entre os animais e a quase 
completa ausência do uso de práticas de manejo reprodutivo (Fernandes et al., 2001). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2 – Machos e fêmeas da raça Morada Nova (variedade branca). 
Fonte: LFCR, 2005. 
 
1.2. Uso de tecnologias reprodutivas na preservação de rebanhos nativos 
 
Os efeitos deletérios da homogeneidade genética que resultam da 
diminuição dos tamanhos da população são bem conhecidos, sendo a alta mortalidade 
pós-natal, o baixo desempenho reprodutivo e a maior susceptibilidade a doenças as 
conseqüências mais documentadas (Ralls et al., 1979; Brem et al., 1989; Lasley et al., 
1994). Muitas das espécies e raças consideradas sob risco de extinção, possuem certas 
características que as tornam bem adaptadas ao seu habitat, sejam fisiológicas, 
evidenciando-se a alta tolerância ao estresse térmico e a resistência a patógenos 
endêmicos específicos, bem como morfológicas, destacando-se os cascos de estrutura 
sólida, o excesso de pele e chifres grandes. No entanto, estas características, em geral, 
são encontradas em raças de baixa produtividade e não são, devidamente, valorizadas. 
Todavia, mudanças climáticas, de mercado, dentre outras, podem tornar tais 
características, atualmente, consideradas comuns e sem expressão, de extremo valor no 
futuro. Por estas razões, a preservação destas raças é importante. Assim, diversas 
 
 
26 
tentativas estão sendo feitas para conservar genomas e / ou genes individuais através 
do uso de tecnologias reprodutivas assistidas (TRA) aplicadas (inseminação artificial e 
múltipla ovulação e transferência de embriões) e fundamentais (transferência nuclear e 
clonagem). E o sucesso do uso das TRA no aumento da produtividade de animais de 
produção sugere que estas tecnologias possam ser utilizadas, também de forma bem 
sucedida, na preservação de raças em risco de extinção (Solti et al., 2000). 
Programas de conservação têm reconhecido a importância da preservação 
do material genético oriundo de espécies raras ou em risco de extinção. Em 1991, a 
Associação Americana de Animais Aquáticos e de Zoológico organizou um grupo 
científico abordando o Banco de Recursos Genômicos, o qual é definido como “a 
colheita organizada, estocagem e o uso de biomateriais” (Wildt, 1992). Programas de 
crioarmazenamento de gametas e embriões têm, similarmente, sido realizados na 
preservação de variedades valiosas de animais de laboratório, assim como de animais 
transgênicos (Wildt et al., 1992). Para este fim, programas de pesquisa têm sido 
iniciados para elucidar vários aspectos da conservação de material genético através da 
reprodução assistida em animais de produção nativos. 
No início da década de 80, o Centro Nacional de Pesquisa de Recursos 
Genéticos e Biotecnologia (CENARGEN) da Empresa Brasileira de Pesquisa 
Agropecuária (EMBRAPA) decidiu incluir a conservação de recursos genéticos 
animais no seu programa de pesquisa denominado Conservação e Utilização de 
Recursos Genéticos o qual, até então, só havia enfocado a conservação vegetal. Uma 
das razões para essa inclusão foi o fato de que todo o rebanho de bovinos de raças 
mochas, na época, consistia de três touros e oito vacas, os quais se encontravam no 
estados de São Paulo e Minas Gerais. A partir de então, iniciaram-se as colheitas de 
sêmen e de embriões (Mariante & Egito, 2002). 
A equipe de reprodução do CENARGEN, trabalhando na conservação de 
recursos genéticos animais aumentou e iniciou o desenvolvimento de novas 
tecnologias. Para tanto, dois laboratórios foram criados: uma para o desenvolvimento 
de novas tecnologias, utilizando o camundongo como um modelo biológico e outro 
para aplicar as técnicas desenvolvidas nos grandes animais da fazenda experimental do 
CENARGEN. Foram trabalhadas técnicas referentes à colheita e a congelação de 
 
 
27 
sêmen a campo, a colheita, congelação, descongelação e transferência de embriões 
para receptoras, além da micromanipulação de embriões. Esta levou a produção de 
gêmeos idênticos a partir de um único embrião. Mais recentemente, a fecundação in 
vitro e a clonagem foram também desenvolvidas nestes laboratórios, mostrando o grau 
de maturidade profissional deste grupo de pesquisa (Mariante & Egito, 2002). 
Um núcleo de conservação deve trabalhar, criopreservando sêmen, 
embriões e oócitos de espécies ou raças domésticas em risco de extinção. Por esta 
razão, ambas as formas de conservação, in situ e ex situ, são extremamente 
importantes e complementares (Mariante & Egito, 2002). 
 
1.3. Produção In Vivo de Embriões 
 
1.3.1. Sincronizaçãodo Estro 
 
A sincronização do estro tem por finalidade fazer com que um grupo de 
fêmeas entre em estro em um curto período, favorecendo a execução da cobertura 
natural ou inseminação artificial. De acordo com Baril et al. (1995), nas fêmeas 
doadoras, a sincronização ou a indução do estro permite obter embriões no mesmo 
estádio de desenvolvimento; já para as receptoras a finalidade seria fazer coincidir o 
seu estado fisiológico com o das doadoras, condição esta que favorece aos embriões 
uma melhor sobrevivência e desenvolvimento pós-transferência. 
A sincronização do estro pode ser alcançada tanto através do uso de 
prostaglandina F2α (PGF2α) como de progestágenos. Ao se aplicar a PGF2α ou seus 
análogos sintéticos, dentre eles o d-cloprostenol e o luprostiol, é possível sincronizar o 
estro através da luteólise, utilizando, para tanto, um esquema de duas injeções 
intramusculares, intervaladas por 11 dias, em fêmeas cíclicas (Deligiannis et al., 
2005). 
No que concerne aos progestágenos, estes são utilizados por um período de 
10 a 16 dias, utilizando-se dispositivos intravaginais impregnados com 300 mg de 
progesterona (Iida et al., 2004), 50 mg a 60 mg de acetato de medroxiprogesterona 
(Boscos et al., 2002; Evans et al., 2004) ou 30 mg a 40 mg de acetato de fluorogestona 
 
 
28 
(Zeleke et al., 2005), além de implantes auriculares contendo 2 mg a 6 mg de 
norgestomet (Stenbak et al., 2003). Estes tratamentos têm sido efetivos na 
sincronização do estro de ovelhas durante as estações sexual e não-sexual (Barrett et 
al., 2004). É importante ressaltar que o uso da gonadotrofina coriônica eqüina (eCG) 
nos protocolos de sincronização do estro em ovinos também está bem estabelecido. 
Uma única aplicação de eCG, após tratamento progestágeno, aumenta a resposta 
ovariana, as taxas de fecundação e concepção e o percentual de nascimentos múltiplos 
(Dias et al., 2001; Barrett et al., 2004). 
O método de sincronização mais utilizado no Brasil é o do tratamento por 
12 dias, utilizando-se esponjas intravaginais impregnadas com progestágenos 
sintéticos (MAP ou FGA) e aplicação de eCG no final do tratamento progestágeno, por 
via intramuscular. O estro ocorre em torno de 36 a 48 horas após a retirada das 
esponjas (Dias et al., 2001). 
 
1.3.2. Superovulação 
 
A superovulação pode ser definida como o processo pelo qual um número 
maior de folículos ao, geneticamente, estabelecido durante um ciclo estral natural, é 
recrutado e selecionado para chegar à ovulação. Dois tipos de fatores têm sido 
sugeridos como determinantes na resposta ovariana: (1) fatores exógenos, relacionados 
especificamente com o tipo e forma de administração das gonadotrofinas; e, (2) fatores 
endógenos, relacionados com o "status" ovariano do animal, isto é o número de 
folículos susceptíveis de responder às gonadotrofinas no início de sua aplicação 
(Alvarez, 1994). 
Os princípios da indução da superovulação em caprinos e ovinos são 
semelhantes àqueles conhecidos para bovinos. Aplica-se uma gonadotrofina folículo-
estimulante durante a parte final da fase luteal do ciclo estral, ou seja, entre os dias 11 
e 13, ou em torno de 1 a 2 dias antes do fim do tratamento de sincronização do estro 
(Ishwar & Memon, 1996). 
As duas preparações gonadotróficas mais, largamente, utilizadas para a 
superovulação são a eCG e o hormônio folículo-estimulante (FSH). A eCG é 
 
 
29 
administrada como uma única injeção intramuscular (1000 a 2000 UI), 1 dia antes do 
fim do tratamento de sincronização do estro (Cognié, 1999). A eCG tem como 
vantagens: aplicação simplificada, baixo custo e facilidade de obtenção. As suas 
principais desvantagens são: resultados heterogêneos, variabilidade entre partidas, 
possibilidade de reações anafiláticas, maior incidência de cistos foliculares, número 
significativo de embriões degenerados, formação de anticorpos anti-eCG (Baril et al., 
1995) e uma meia-vida longa. Devido a esta última desvantagem, a ação prolongada 
da eCG pode resultar em uma alta incidência de folículos não ovulatórios junto com 
elevados níveis de estradiol produzidos por estes folículos (Blanco et al., 2003). 
Já o FSH é administrado em seis a oito doses decrescentes, intervaladas por 
12 horas, durante três a quatro dias, iniciadas dois a três dias antes da remoção do 
progestágeno, sendo, atualmente, o principal hormônio utilizado em programas de 
superovulação (D’Alessandro et al., 2005; Veiga-Lopez et al., 2005). Em revisão 
sobre o tema, Cognié (1999) cita que o FSH tem se comportado como sendo superior à 
eCG em termos de taxas de ovulação e fecundação e em produção de embriões de boa 
qualidade. Recentemente, as eficácias da eCG e do FSH foram comparadas quanto à 
resposta superovulatória em ovelhas, nas quais foi verificada uma taxa de ovulação 
média maior naquelas tratadas com FSH do que com eCG. Além disso, a incidência de 
grandes folículos que falharam em ovular foi sutilmente maior nas fêmeas tratadas 
com eCG do que com FSH, enquanto que, com relação ao número de embriões 
transferíveis, os animais tratados com FSH apresentaram valores bem superiores 
(Blanco et al., 2003). 
Ainda abordando a comparação entre eCG e FSH, observa-se a ocorrência 
de múltiplos cistos foliculares nas doadoras de embriões submetidas ao tratamento 
superovulatório com eCG, o que não se observa naquelas tratadas com FSH. Isto pode 
ser devido a uma metabolização, consideravelmente, mais rápida do FSH do que da 
eCG (Armstrong et al., 1983; Blanco et al., 2003), implicando numa maior resposta 
estrogênica à eCG do que ao FSH. 
Um importante problema, mais freqüentemente associado à superovulação 
de cabras, porém também observado em ovelhas, é a regressão prematura de corpo 
lúteo (Riesenberg et al., 2001; Maia et al., 2004), a qual foi relatada em mais de 27% 
 
 
30 
das fêmeas doadoras (Tervit et al., 1986). Este fenômeno pode estar associado com o 
retorno precoce ao estro, antes da época normal para a colheita de embriões. Nestes 
casos, são observadas taxas de recuperação embrionárias reduzidas e esta característica 
parece estar associada com uma alteração no transporte embrionário através das tubas 
uterinas (Tervit, 1987; Riesenberg et al., 2001). 
Uma alta variabilidade na resposta superovulatória é observada em ovelhas, 
prejudicando o processo de fecundação. Independente do tipo de tratamento 
superovulatório, a falha de fecundação ocorre, particularmente, em ovelhas mostrando 
uma alta resposta ovulatória (Armstrong & Evans, 1983; Hawk et al., 1987). Esta falha 
na fecundação parece ser devida ao transporte inadequado de espermatozóides através 
da cérvice, podendo este problema ser sanado com a deposição do sêmen, diretamente, 
no útero (Murray et al., 1994). 
 
1.3.3. Fecundação 
 
Para que ocorra a fecundação, é necessária a presença, dentro do trato genital da 
fêmea, de um número satisfatório de espermatozóides móveis no momento adequado. 
Três técnicas podem ser utilizadas na tentativa de obter-se a fecundação das fêmeas: a 
monta natural, a inseminação artificial (transcervical ou por laparoscopia) e a 
fecundação in vitro. No entanto, em qualquer um dos casos, faz-se necessária a 
utilização de machos de fertilidade comprovada. No caso de fecundação por monta 
natural, os machos escolhidos deverão apresentar condições físicas e aptidão sexual 
suficientes para realizar montas repetidas. Quando da inseminação artificial, as 
qualidades particularmente consideradas, serão a aptidão do macho para ejacular em 
vagina artificial e a qualidade do sêmen produzido (Baril et al., 1995). 
Ainda segundo os mesmos autores, a monta natural está limitada pelo fato de que 
os melhores reprodutores, em geral, encontram-se nos grandes centros de inseminação 
artificial. Em monta livre, machos e fêmeas ficam juntos na proporção de um macho 
para três a quatro fêmeas; os machos podem, ainda, serem equipados comum 
dispositivo marcador para identificar as fêmeas cobertas. Na monta controlada, os 
machos só ficam com as fêmeas em tempos determinados de cobertura, pelo menos, 
 
 
31 
duas vezes, durante o período de estro, com intervalo de 12 horas. As montas mais 
eficazes são aquelas realizadas 12 e 24 horas após o início do estro. 
As falhas de fecundação são, igualmente, evidentes em ovelhas, naturalmente ou 
artificialmente, inseminadas, parecendo ser devido ao processo de transporte 
espermático através da cérvice (Murray et al., 1994). Este problema pode ser 
solucionado pela deposição de sêmen no lúmen uterino através de métodos cirúrgicos 
(Trouson & Moore, 1974) ou por inseminação laparoscópica (Ehling et al., 2003), em 
ovelhas superovuladas. Em ovinos, a inseminação artificial por laparoscopia tem sido 
utilizada (Lymberopoulos et al., 2001) com sucesso, resultando em melhores taxas de 
fecundação quando comparada à monta natural. Esta, em contrapartida, tem levado a 
melhores resultados de fecundação do que a inseminação artificial transcervical (Baril 
et al., 1995). 
A fecundação bem sucedida de fêmeas doadoras de embriões é também 
dependente da sincronia entre o momento da inseminação e as ovulações. Tanto a 
redução na variabilidade da amplitude do período em que as ovulações ocorrem, como 
um aumento na taxa de ovulação podem ser obtidos utilizando uma aplicação de 
GnRH em um momento fixo após a retirada do progestágeno (Walker et al., 1989). 
Contudo, após as ovulações induzidas por GnRH, uma nova ocorrência de ovulações 
tem sido observada 12 a 24 h após a primeira, em 60% das ovelhas tratadas (Cognié et 
al., 1987). Outra alternativa é o uso de um antagonista de GnRH, 12 horas após a 
remoção da esponja, seguido por uma aplicação de LH, 24 horas depois. Este 
procedimento mimetiza o pico pré-ovulatório de LH e permite a inseminação 
programada em fêmeas superovuladas (Cognié, 1999). 
 
1.3.4. Colheita de Embriões 
 
Em geral, os procedimentos atuais de colheita de embriões utilizados em 
ovelhas têm sido pouco aperfeiçoados, quando comparados àqueles descritos por 
Hunter et al. (1955). A colheita de embriões pode ser realizada pelos métodos 
cirúrgico, semi-cirúrgico e não-cirúrgico. 
 
 
 
32 
1.3.4.1. Colheita Cirúrgica – Laparotomia 
 
Possivelmente, a técnica de colheita de embriões mais em uso em caprinos 
e ovinos ainda é a laparotomia (Ishwar & Memon, 1996; Folch et al., 2001; Naqvi et 
al., 2002; Selvaraju et al., 2003). 
Por este método, os embriões podem ser colhidos com sucesso tanto do 
oviduto como do útero. Independente do local de colheita, as doadoras de embriões 
devem ser, previamente, submetidas a jejuns hídrico, por 12 horas, e alimentar, por 24 
horas, para, em seguida, serem submetidas à anestesia geral. As fêmeas são sedadas 
com cloridrato de xilazina, na proporção de 0,11 mg/kg PV, recebendo ketamina, na 
razão de 5,5 mg/kg PV, dez minutos depois, sendo ambas as aplicações por via 
intramuscular (Pendleton et al., 1992). O plano anestésico pode ser mantido pela 
anestesia inalatória com metaphano após a aplicação da ketamina (Nuti et al., 1987). 
Deve-se ainda realizar uma aplicação local e subcutânea de cloridrato de lidocaína (0,1 
g/animal) na linha alba, onde será realizada uma incisão de 15 a 20 cm de 
comprimento, cranialmente à base do úbere (Ishwar & Memon, 1996). A 
exteriorização dos cornos uterinos, tubas uterinas e dos ovários deve ser feita com a 
fêmea em decúbito dorsal, em maca apropriada, com uma inclinação antero-posterior 
de 30º a 45º. Com a exteriorização dos ovários, é realizada a contagem dos corpos 
lúteos, a qual permitirá a avaliação da eficácia do método cirúrgico de colheita de 
embriões através da obtenção da taxa de recuperação embrionária. A lavagem das 
fêmeas, quer seja uterina ou tubária, é realizada com PBS a 37 oC (Tabela 1). 
A colheita tubária deve ser realizada dois a quatro dias após o início do 
estro (Baril et al., 1995), sendo os ovidutos cateterizados através do infundíbulo com 
um cateter plástico. Em seguida, após a inserção de uma agulha 25 g acoplada a uma 
seringa de 20 mL na junção útero-tubárica, o meio de lavagem é injetado em direção 
ao infundíbulo (Ishwar & Memon, 1996). 
 
 
 
 
 
 
33 
Tabela 1 – Meio de colheita e conservação de embriões (solução Salina Fosfato 
Tamponada – PBS). 
Solução 1 mg/litro Solução 2 Unidade Por litro 
CaCl2 2H2O 
MgCl2 6H2O 
132,5 
100,0 
NaCl 
KCl 
K2HPO4 
Na2HPO4 
BSA (fração V) 
D - glicose 
Piruvato de sódio 
Sulfato de 
estreptomicina 
Penicilina-G sódica 
Mg 
mg 
mg 
mg 
mg 
mg 
mg 
 
mg 
UI 
8000 
200 
200 
1150 
4000 
1000 
36 
 
50 
1000000 
Fonte: Baril et al., 1995. 
 
 
A colheita uterina deve ser realizada cinco a seis dias após o início do estro 
(Figura 3). Para tanto, uma punção na base do corno uterino é realizada para introduzir 
um cateter de colheita na luz uterina, a qual deve ser obstruída através de compressão 
digital ou pelo uso de pinça atraumática. Então, uma seringa de 50 mL acoplada a uma 
agulha de 18 g é inserida na luz uterina, próximo à junção útero-tubárica e 30 mL a 40 
mL de meio de lavagem a 37 oC são injetados no interior de cada corno uterino e fora 
do cateter de Foley. Os lavados são colhidos em placas de Petri, plásticas, para 
avaliação imediata e contagem em estereomicroscópio em um aumento de 80 vezes. 
A colheita cirúrgica é o método de recuperação, utilizado em pequenos 
ruminantes, mais eficiente quanto às taxas de recuperação, as quais variam entre 70% 
e 90% (Baril et al., 1995). Greyling et al. (2002) ao colherem embriões do útero por 
este método verificaram um percentual de recuperação embrionária de 80% e 94%, 
trabalhando com cabras nativas selvagens da África do Sul e Boer, respectivamente. 
 
 
 
34 
 
Figura 3 – Diferentes estruturas encontradas no trato genital de cabras e ovelhas entre 
a ovulação e a implantação: Ov = ovário, O = oócito, F = fecundação, PN = pré-
nuclear, 1 C = 1 célula, 2 C = 2 células, 4 C = 4 células, 8 C = 8 células, M = Mórula, 
Bl = Blastocisto, I = Implantação, U = útero. 
Fonte: Sathananthan et al., 1993. 
 
A exteriorização do trato reprodutivo por laparotomia, com o objetivo de 
colher embriões, envolve algum grau de trauma cirúrgico e, freqüentemente, leva a 
formação de aderências pós-operatórias, as quais podem envolver o útero e os ovários. 
A colheita cirúrgica de embriões, realizada de forma repetida na mesma doadora, afeta 
negativamente a taxa de recuperação embrionária, o que a torna de uso limitado, 
particularmente em animais de alto valor genético (Tabela 2). No entanto, é possível 
minimizar os efeitos negativos deste método de colheita de embriões pela aspersão do 
útero e dos ovários com soro fisiológico heparinizado (50 UI de heparina sódica/mL) 
ou com solução de dextran 70 g a 6,0%. A sutura, por sua vez, pode ser realizada com 
um padrão simples interrompido com fio de poliglactina 2-0 (Ishwar & Memon, 1996). 
 
 
35 
Tabela 2 – Efeito da repetição da colheita de embriões por laparotomia sobre a taxa de 
recuperação embrionária. 
 Ordem de colheita 
Espécie 1 2 3 Fonte 
Ovina 
Caprina 
88,0% (18) 
85,0% (10) 
52,0% (17) 
85,7% (10) 
24,0% (15) 
78,2% (9) 
Torres & Sevellec, 1987 
Andrioli et al., 1999 
( ) Número de animais. 
 
1.3.4.2. Colheita Semi-cirúrgica – Laparoscopia 
 
Este método foi, inicialmente, usado na ovelha (McKelvey et al., 1986) 
com o objetivo de ampliar as possibilidades da repetição da colheita de embriões, na 
mesma fêmea, tornando, assim, possível usá-la por várias vezes. 
Alimento e água são, geralmente, retirados 24 h antes da laparoscopia. 
Aplica-se sulfato de atropina, na proporção de 0,048 mg/kg PV, por via subcutânea, 
seguida, pela aplicação do miorrelaxante xilazina, na razão de 0,22 mg/kgPV, por via 
intramuscular. Cinco minutos após a aplicação da xilazina, injeta-se cloridrato de 
ketamina na proporção de 11 mg/kg PV, por via endovenosa. A combinação ketamina-
xilazina produz um plano anestésico, o qual é mantido com halotano e oxigênio, via 
canulação endotraqueal. Após a contenção do animal em uma mesa cirúrgica em 
decúbito dorsal, a cabeça é mantida para baixo a um ângulo de 45o e a região 
abdominal cranial ao úbere é tricotomizada para a anti-sepsia cirúrgica. 
Em seguida, é realizada uma primeira punção, quatro a cinco centímetros 
cranialmente ao úbere e 10 a 15 cm à esquerda da linha alba para colocar uma cânula, 
a qual deve ser conectada a um endoscópio. Depois de haver insuflado ar filtrado na 
cavidade abdominal para separar as vísceras dos órgãos abdominais (criação de 
pneumoperitônio), se coloca uma segunda cânula no lado oposto à primeira punção, 
tomando como referência a linha alba, objetivando assim, introduzir uma pinça 
atraumática para a manipulação do trato genital (Figura 4). Em seguida, posiciona-se 
um dos cornos uterinos pela base para puncioná-lo com uma agulha de Mintz. Coloca-
se uma terceira cânula no nível da linha alba a 15 centímetros do úbere, para passar 
 
 
36 
uma sonda de três vias, introduzindo a extremidade da mesma pelo orifício da punção 
dentro da luz uterina (Baril et al., 1995). 
O bulbo localizado na extremidade da sonda é, então, inflado com ar, 
mediante uma seringa, visando obstruir a luz uterina na base do corno. Em seguida, se 
introduz a extremidade de um cateter, inserido no corpo da sonda, o mais próximo 
possível da junção útero-tubárica. Fixa-se a pinça sobre o istmo com o fim de evitar 
que o líquido de colheita passe para a tuba uterina. O líquido de colheita (40 mL a 50 
mL) é injetado através da sonda. A pressão criada no interior do corno uterino 
possibilita a colheita do líquido pelo cateter (Figura 4). 
A colheita de embriões por laparoscopia resulta em uma menor quantidade 
de aderências (Baril et al., 1989; Flores-Foxworth et al., 1992; Bari et al., 2003), mas 
requer equipamento especial e pessoal altamente treinado (Baril et al., 1995). 
As taxas de recuperação embrionárias por laparoscopia são 10% a 15% 
inferiores àquelas obtidas por laparotomia, mas a repetição da colheita por 
laparoscopia não diminui a eficácia do método (McKelvey et al., 1986; Andrioli et al., 
1999) (Tabela 3). 
 
 
 
Figura 4 – Disposição dos instrumentos para a colheita de embriões por laparoscopia 
em pequenos ruminantes. 
Fonte: Freitas & Simplício, 2001. 
 
 
37 
Tabela 3 – Taxa de recuperação embrionária após colheitas sucessivas de embriões por 
laparoscopia. 
 Ordem de colheita 
Espécie 1 2 3 Fonte 
Caprina 
Ovina 
87,2% (10) 
35% (8) 
64,5% (10) 
76% (8) 
62,1% (10) 
66% (8) 
Andrioli et al., 1999 
McKelvey et al., 1986 
( ) Número de animais. 
 
1.3.4.3. Colheita Não Cirúrgica – Transcervical 
 
Esse método foi desenvolvido com o objetivo de abolir os efeitos adversos 
da colheita de embriões por laparotomia, maximizando a utilização de uma mesma 
fêmea em colheitas sucessivas. 
Visando minimizar os traumas e diminuir a relação custo-benefício da 
técnica cirúrgica, procurou-se adaptar a ovelha, a técnica de colheita pela via cervical, 
utilizada com êxito na vaca. Todavia, uma das dificuldades do uso desta técnica na 
ovelha está no arranjo irregular dos anéis cervicais, restringindo a passagem do cateter. 
Visando solucionar este problema, várias manobras auxiliares vêm sendo testadas tais 
como a aplicação prévia de PGF2α, o uso de cateter de calibre reduzido, dentre outras. 
Para a realização desta técnica, os animais devem ser anestesiados pela via 
epidural e contidos em brete de contenção apropriado. Através de um espéculo com 
fonte luminosa, visualiza-se a cérvice e, após o tracionamento e fixação desta, 
introduz-se uma sonda de três vias guiada por um cateter de aço inoxidável, infla-se o 
balão, inicia-se a lavagem uterina com PBS por uma das vias e, o seu recolhimento em 
filtro de colheita (Barry et al., 1990). 
Soonen et al. (1991) compararam dois métodos de recuperação embrionária 
em ovelhas: pela via transcervical e por laparotomia. As taxas de recuperação obtidas 
foram de 36,5% e 51,0%, respectivamente. 
Devido à complexidade da anatomia cervical, Mylne et al. (1992) 
conseguiram ter sucesso com a técnica em somente 40% das fêmeas tratadas. Já 
Wulster-Radcliffe et al. (1999) testaram o efeito da utilização de estrógeno seguido da 
 
 
38 
administração de ocitocina sobre a dilatação cervical e a taxa de recuperação 
embrionária, encontrando que o tratamento estrógeno-ocitocina pode ser utilizado para 
garantir o sucesso da transferência de embriões pela via transcervical em ovelhas, sem 
afetar a função luteal. 
Já Silva (2005), comparando duas formas de dilatação cervical para a 
colheita de embriões em ovelhas da raça Santa Inês, verificou que a aplicação 
intramuscular de 50 µg de prostaglandina F2α (PGF2α), 12 horas antes da colheita 
resultou numa taxa de passagem transcervical de 58,8%. Enquanto que a aspersão no 
fundo de saco vaginal com solução à base de um análogo sintético da prostaglandina 
E1 (PGE1) (misoprostol) resultou numa taxa de passagem transcervical de 63,1%. A 
mesma autora, trabalhando com ovelhas da raça Dorper e utilizando o protocolo com 
PGE1, conseguiu passar o cateter de colheita em 94,8% das ovelhas e obteve um total 
(média ± dp) de 6,02 ± 3,6 estruturas. Almeida et al. (2002), por sua vez, utilizando o 
mesmo protocolo com misoprostol, verificaram a total impossibilidade de passagem 
transcervical do cateter de colheita de embriões em ovelhas da raça Morada Nova, bem 
como um percentual de 80% de passagem transcervical do cateter de colheita em 
ovelhas Santa Inês, evidenciando, assim, a influência da variabilidade racial sobre esta 
técnica de colheita de embriões. 
 
1.3.5. Avaliação e Classificação dos Embriões 
 
A avaliação morfológica dos embriões estabelece padrões morfológicos que 
julgam a forma, porém não a viabilidade do embrião. A classificação embrionária 
proposta pela Sociedade Internacional de Transferência de Embriões (IETS) para a 
avaliação morfológica dos embriões é dividida em nove categorias (Robertson & 
Nelson, 1999) (Tabela 4) 
 
 
 
 
 
 
 
39 
Tabela 4 – Estádios embrionários e suas respectivas características. 
Estádio Embrionário Características 
1 célula 
 
 
 
2-16 células 
 
 
Mórula inicial (Mi) 
 
 
Mórula compacta 
(Mc) 
 
Blastocisto inicial 
(Bi) 
 
 
Blastocisto (Bl) 
 
 
 
Blastocisto expandido 
(Bx) 
 
 
 
Blastocisto em 
eclosão (Bn) 
 
Blastocisto eclodido 
(Be) 
zigoto recém formado, com apenas uma célula circundada pela 
zona pelúcida e apresentando o 2o. corpúsculo polar no espaço 
perivitelínico (EPV). 
 
estádio onde ocorrem as clivagens iniciais, sendo possível 
contabilizar o número de blastômeros. 
 
massa de células com separação nítida entre os blastômeros 
ocupando quase a totalidade do EPV. 
 
blastômeros agregados entre si formando uma massa compacta, 
ocupando 60% a 70% do EPV. 
 
início da formação da blastocele e diferenciação entre o 
trofoblasto e o botão embrionário; o embrião ocupando 70% a 
80% do EPV. 
 
evidente diferenciação entre as células do trofoblasto e do botão 
embrionário; as células do botão embrionário estão 
compactadas, a blastocele é predominante. 
 
o embrião aumenta 1,2 a 1,5 vezes o seu diâmetro e a zona 
pelúcida diminui em 1/3 a sua espessura; é evidente a pressão 
do líquido da blastocele, que empurra o trofoblasto contra a 
zona pelúcida. 
 
o embrião está iniciando o processo de saída da zona pelúcida. 
 
 
o embrião está completamente livre da zona pelúcida; ainda é 
nítida a presença da blastocele 
 
 
 
40 
Na avaliaçãoindividual dos embriões são várias as características a serem 
observadas tais como: tamanho, forma, cor, homogeneidade do citoplasma, forma e 
integridade da zona pelúcida, tamanho e presença de células no EPV e presença de 
vesículas (Rumpf et al., 1997). 
Considerando os parâmetros descritos, os embriões recebem uma 
identificação, que varia segundo os autores. A Tabela 5 mostra como a IETS classifica 
os embriões. 
 
Tabela 5 – Qualidade embrionária e suas respectivas características. 
Qualidade 
embrionária 
Características 
Embrião I 
(excelente ou bom) 
 
 
 
Embrião II (regular) 
 
 
 
 
Embrião III (pobre) 
 
 
 
 
Embrião IV (morto 
ou degenerado) 
massa embrionária simétrica e esférica; os blastômeros são 
uniformes em tamanho, cor e densidade; irregularidades devem 
ser relativamente menores e, ao menos, 85% do material celular 
deve ser de massa embrionária viável intacta. 
 
irregularidades moderadas na forma geral da massa embrionária 
ou no tamanho, cor e densidade das células individuais; ao 
menos 50% do material celular deve compor uma massa 
embrionária viável, intacta. 
 
irregularidades maiores na forma da massa embrionária ou no 
tamanho, cor e densidade das células individuais; ao menos 25% 
do material celular deve formar uma massa embrionária viável, 
intacta. 
 
embrião que não apresenta uma forma definida, sendo 
impossível determinar o estádio de desenvolvimento; é evidente 
a desorganização celular. 
 
 
 
 
41 
Os embriões classificados como I, II e III são passíveis de transferência. No 
entanto, para a micromanipulação e a criopreservação, somente os embriões I e II são 
utilizáveis (Rumpf et al, 1997). 
 
1.3.6. Criopreservação de Embriões 
 
O primeiro relato de crias nascidas de embriões congelados-descongelados 
foi na espécie murina (Whittingham et al., 1972). Desde então, a criopreservação de 
embriões tem sido relatada em várias espécies mamíferas (Palasz & Mapletoft, 1996; 
Guignot, 2005). Vários protocolos têm sido desenvolvidos durante os últimos 25 anos 
os quais têm resultado em criopreservações de embriões bem sucedidas. Dentre os 
fatores que podem influenciar a formação de danos celulares destacam-se a velocidade 
de congelação e de descongelação, tamanho e estádio de desenvolvimento 
embrionário, propriedades osmóticas e de permeabilidade celular, toxicidade dos 
crioprotetores e o conteúdo lipídico intracelular (Palasz & Mapletoft, 1996). 
Atualmente, diferentes protocolos, empregando uma variedade de crioprotetores, bem 
como lentas e rápidas taxas de resfriamento e aquecimento, têm sido aplicadas em todo 
o mundo (Datena et al., 2000; Baril et al., 2001; Cocero et al., 2002; Garcia-Garcia et 
al., 2005). Todos estes protocolos têm sido desenvolvidos no sentido de proteger os 
embriões da formação de cristais de gelo intracelulares durante o processo de 
congelação e da recristalização por ocasião da descongelação. Visando inibir a 
formação intracelular de cristalização de gelo, a água intracelular é comumente 
substituída por crioprotetores e, desta forma, os embriões são desidratados numa 
velocidade de resfriamento, relativamente baixa. A recristalização durante a 
descongelação, tende a ser mínima quanto mais rápida for realizada a descongelação. 
As atuais técnicas de congelação permitem a criopreservação bem sucedida de 
embriões da maioria das espécies domésticas por, praticamente, períodos ilimitados de 
tempo (Dufrain, 1976). 
 
 
 
 
 
42 
1.3.6.1. Crioprotetores e Soluções de Congelação 
 
Os crioprotetores são necessários nas soluções de congelação para prevenir 
os danos celulares durante a congelação e a descongelação. Os três principais grupos 
de crioprotetores utilizados são (1) aqueles permeáveis e de baixo peso molecular, tais 
como metanol (Papis & Dziuk, 1988), etilenoglicol (Cocero et al., 2002), propanodiol 
(Renard & Barbinet, 1984), dimetilsulfóxido (Wilmut & Rowson, 1973), butanodiol 
(Boutron, 1990), glicerol (De paz et al., 1994) e outros álcoois; (2) aqueles 
impermeáveis e de baixo peso molecular, assim como a galactose (Leibo & Oda, 
1993), glicose (Storey & Storey, 1988), sacarose (Renard et al., 1982), trealose 
(Rudolph & Crowe, 1985) e outros açúcares; e (3) aqueles impermeáveis e de alto 
peso molecular, assim como polivinilpirrolidona (Franks et al., 1987), álcool 
polivinílico (Seidel et al., 1990), ialuronato de sódio (Palasz et al., 1993). 
Embora as ações crioprotetoras destes diferentes compostos não sejam 
inteiramente compreendidas, os crioprotetores de cada grupo desempenham diferentes 
papéis durante os processos de resfriamento e descongelação. A presença de 
crioprotetores permeáveis de baixo peso molecular é absolutamente necessária, pois 
eles substituem osmoticamente a água intracelular embrionária antes do resfriamento 
e, associados às taxas lentas e controladas de resfriamento, reduzem as trocas de 
volume celular e minimizam a formação de cristais de gelo dentro das células 
embrionárias (Palasz & Mapletoft, 1996). A ação dos crioprotetores impermeáveis de 
baixo peso molecular é baseada na desidratação das células embrionárias antes do 
resfriamento, o qual resulta na formação reduzida de cristais de gelo durante a 
congelação (Palasz & Mapletoft, 1996). Contudo, estes compostos devem ser 
combinados aos crioprotetores permeáveis de baixo peso molecular para proteger, 
eficientemente, as células durante a congelação. Os crioprotetores impermeáveis e de 
alto peso molecular protegem as células embrionárias durante a congelação e o 
aquecimento pela alteração da formação de cristal de gelo para um tamanho e forma 
inócuos (Palasz & Mapletoft, 1996). 
Na prática, a crioconservação de embriões utilizando as técnicas 
convencionais de congelação envolve mais freqüentemente o uso de um simples 
 
 
43 
crioprotetor como o glicerol, etilenoglicol ou o propanodiol (Voelkel & Hu, 1992). 
Enquanto que a congelação rápida ou ultra-rápida e a vitrificação envolvem o uso de 
misturas de crioprotetores como glicerol e etilenoglicol, glicerol e propanodiol ou 
etilenoglicol e propanodiol em combinação com sacarose, trealose ou galactose (Leibo 
& Oda, 1993; Rall, 1987; Rayos et al., 1992; Scheffen et al., 1986; Shaw et al., 1991; 
Szell & Windsor, 1994; Valdez et al., 1992). As variadas propriedades dos diferentes 
crioprotetores sugerem que cada um deles protege os embriões contra a injúria da 
congelação de uma forma específica e a solução crioprotetora mais eficaz seria a 
mistura de crioprotetores a qual deve, ainda, ser estabelecida. 
As soluções crioprotetoras são comumente preparadas em meio tamponado 
com um pH estabilizado entre 7,2 e 7,4. Embora a solução salina fosfato-tamponada de 
Dulbecco seja a mais freqüentemente utilizada, outros meios tamponados de cultivo 
embrionário tais como o TCM-199 ou a simples solução salina fisiológica têm também 
sido utilizados com sucesso (Palasz & Mapletoft, 1996). 
A velocidade de congelação empregada é crítica para o sucesso desta 
técnica, sendo documentadas três formas de criopreservação: (1) congelação lenta 
controlada; (2) congelação rápida / ultra-rápida e (3) vitrificação. 
 
1.3.6.2. Métodos de Criopreservação 
 
Congelação Lenta Controlada e Descongelação 
 
Apesar dos avanços obtidos na criobiologia desde a última década, poucos 
protocolos de congelação embrionária têm sido postos em prática. A grande maioria 
dos embriões mamíferos é congelada pelos métodos convencionais, utilizando 
crioprotetores de permeabilidade, relativamente, lenta e taxas de resfriamento lenta e 
controlada, além de taxas de aquecimento rápidas. 
Os crioprotetores utilizados neste método são: glicerol, etilenoglicol, 
DMSO e o propanodiol. Ressalte-se que, atualmente, existe uma tendência desses 
crioprotetores serem adicionados de uma única vez, embora este procedimento 
também possa ser realizado em algumasetapas. Para tanto, os crioprotetores são 
 
 
44 
adicionados em concentrações crescentes, intervaladas por alguns minutos, visando, 
assim, evitar um significativo choque osmótico. Os embriões são envasados em 
palhetas de 0,25 mL para serem submetidos à congelação, necessitando, para tanto, de 
um aparelho de congelação programável para regular as diferentes quedas sucessivas 
de temperatura (Guignot, 2005). 
Inicialmente, a temperatura cai de 25 oC a – 7 oC a uma velocidade que 
pode variar de 1 a 3 °C/min, permanecendo estável por cinco minutos até a indução da 
cristalização (seeding). Esta consiste no resfriamento realizado, localmente, utilizando 
uma pinça previamente imersa em nitrogênio líquido. A cristalização funciona 
induzindo o resfriamento rápido das células embrionárias, a fim de evitar uma 
congelação das células a uma temperatura muito baixa, provocando um choque forte 
de temperatura dentro da palheta, provocando, conseqüentemente, danos celulares. A 
temperatura para a realização do seeding depende do ponto de congelação da solução e 
dos crioprotetores utilizados. Após o seeding, a temperatura cai de – 7 oC a – 30 oC a 
uma velocidade que pode variar de 0,1 a 0,3 °C/min, provocando a desidratação dos 
embriões. Dependendo do protocolo utilizado, a queda de temperatura pode ir de – 25 
°C até – 35 °C. Então, as palhetas são imersas em nitrogênio líquido a – 196 °C, 
evitando que ocorra uma desidratação muito intensa, a qual seria letal para o embrião 
(Guignot, 2005). 
No tocante à descongelação, este procedimento deve ser realizado de forma 
rápida, evitando, assim, o fenômeno da recristalização. Para tanto, as palhetas devem 
ser mergulhadas em banho-maria a uma temperatura variando de 22 °C a 37 °C, a uma 
velocidade de 2 500 °C/min. Neste processo, os crioprotetores são removidos em uma 
única ou em sucessivas etapas, em concentrações decrescentes do crioprotetor 
utilizado na congelação, podendo ser utilizado sozinho ou associado à sacarose 
(Guignot, 2005). 
Como vantagens, nesta técnica os tempos dos banhos são, relativamente, 
longos, permitindo maior tranqüilidade na execução da congelação. Além disso, neste 
método, existe a possibilidade de se realizar a transferência direta (Baril et al., 2001; 
Martinez et al., 2002). 
 
 
45 
Por outro lado, a congelação lenta requer, obrigatoriamente, a utilização de 
um aparelho de congelação programável. Além disso, alguns dos crioprotetores 
utilizados nesta técnica, por ocasião do último banho, em sua concentração máxima, 
são muito tóxicos. Esta técnica não é conveniente a todas as espécies, sobretudo a 
suína, nem a todos os estádios embrionários (estádios de desenvolvimento inicial, 
embriões produzidos in vitro, embriões biopsados), devido à maior sensibilidade 
destes estádios embrionários às temperaturas compreendidas entre + 15 °C e – 5 °C 
(Pollard & Leibo, 1994). 
Embora esta técnica esteja bem estabelecida, nos últimos 25 anos, a 
pesquisa básica e aplicada relacionada à criopreservação de embriões mamíferos tem 
sido direcionada, principalmente, para a simplificação dos procedimentos de 
congelação e aquecimento. Neste contexto, a vitrificação e a congelação rápida e ultra-
rápida têm sido bastante estudadas, particularmente no tocante à viabilidade 
embrionária pós-descongelação e desenvolvimento de soluções crioprotetoras eficazes, 
especialmente aquelas que não necessitam do uso de substâncias de origem biológica 
(Massip et al., 1993; Mahmoudzadeh et al., 1995; Van Wagtendonk-De Leeuw et al., 
1995). 
 
Vitrificação 
 
A definição física de vitrificação é a solidificação de uma solução a baixas 
temperaturas sem formação de cristal de gelo. O processo pode ser considerado como 
um aumento extremo de viscosidade e requer tanto taxas rápidas de resfriamento (107 
°C/s) ou o uso de soluções crioprotetoras, as quais reduzem a formação de cristais de 
gelo e aumentam a viscosidade em baixas temperaturas (Rall, 1987; Vajta, 2000). Até 
recentemente, a taxa de resfriamento de procedimentos comuns de vitrificação foi 
limitada àquela a qual poderia ser alcançada pela imersão de uma palheta de 0,25 mL 
selada, diretamente em nitrogênio líquido, ou seja, aproximadamente, 2500 °C / min 
(Palasz & Mapletoft, 1996). Por outro lado, para evitar fraturas de zona pelúcida e de 
embriões nas palhetas seladas, tanto as taxas de resfriamento como de aquecimento 
não podem ser completamente alcançadas (Kasai, 1997). Estas taxas de resfriamento 
 
 
46 
requerem o uso de crioprotetores em concentrações de, aproximadamente, 5 M a 7 M, 
as quais são várias vezes maior que aquela necessária para a congelação convencional, 
isto é, 1 M a 2 M (Massip et al., 1989). Fatores adicionais, assim como um pequeno 
volume de solução ou um considerável aumento da pressão hidrostática, pode também 
facilitar a vitrificação (Fahy et al., 1984). 
Controversamente, algum grau de vitrificação ocorre em qualquer método, 
resultando na criopreservação bem sucedida, mesmo na congelação convencional, 
como uma conseqüência da concentração das soluções no interior ou em torno dos 
embriões, causada pela formação gradual de gelo (Rall et al., 1984). 
A estratégia da vitrificação é, basicamente, diferente daquela utilizada pela 
congelação lenta. A lenta taxa de resfriamento objetiva manter um preciso balanço 
entre os vários fatores, os quais podem resultar em danos, tais como a formação de 
cristais de gelo, injúrias osmóticas, efeito tóxico dos crioprotetores, eletrólitos 
intracelulares concentrados, injúrias de resfriamento, fraturas de zona pelúcida e de 
embriões, alterações de organelas intracelulares e no citoesqueleto (Dobrinsky, 1996), 
enquanto a vitrificação elimina, totalmente, a formação de cristais de gelo. 
Uma conseqüência negativa desta técnica é a probabilidade aumentada de 
ocorrer, aproximadamente, todas as formas de injúria, exceto aquelas causadas pela 
formação de cristais de gelo. Diferentes procedimentos são utilizados para minimizar 
as injúrias tóxicas e osmóticas. A aplicação de compostos menos tóxicos, a 
combinação de dois ou três crioprotetores, adição por etapas e / ou exposição de 
células a soluções concentradas pré-resfriadas (Palasz & Mapletoft, 1996). 
Por outro lado, a estratégia radical da vitrificação tem resultado em algumas 
conseqüências positivas independente da eliminação total da formação de cristais de 
gelo. A alta taxa de resfriamento diminui as injúrias causadas pelo resfriamento, como, 
por exemplo, danos de gotas lipídicas intracelulares, nas membranas lipídicas e no 
cito-esqueleto, passando, rapidamente, pela faixa de temperatura de + 15 °C a – 5 °C 
(Massip et al 1995; Zeron et al., 1999). Além disso, a vitrificação não requer 
congeladores programáveis de alto custo ou alguma habilidade especial, podendo ser 
realizada muito rapidamente. 
 
 
47 
Como desvantagens, este método requer a utilização de crioprotetores em 
três fortes concentrações, aumentando o risco de toxicidade aos embriões. A duração 
de tempo das passagens nos banhos, portanto, é uma etapa crítica neste processo de 
criopreservação, pois a desidratação embrionária deve ocorrer em um tempo preciso, 
dependendo da velocidade de difusão do crioprotetor e de sua concentração (Guignot, 
2005). 
Comparada à congelação lenta, a vitrificação induz desidratação e retração 
celulares mais pronunciadas. Para o aquecimento das palhetas, assim como na 
congelação lenta, as palhetas são, rapidamente, imersas em banho-maria a uma 
temperatura que varia de 25 °C a 30 °C. Então, o conteúdo da palheta é vertido e os 
crioprotetores são eliminados dos embriões por difusão passiva, assim como na 
congelação lenta, graças à presença de açúcares os quais aumentam a pressão osmótica 
do meio extracelular (Vajta, 2000). 
 
Vitrificação Rápida e Ultra-rápida 
 
Embora os potenciais efeitos benéficos das taxas adicionais