DIAGNÓSTICO PRÉ-IMPLANTACIONAL

Prévia do material em texto

DIAGNÓSTICO PRÉ-
IMPLANTACIONAL
Hellen Caldas - Medicina
Indicação:
• Oligozoospermia
• Mosaicismo gonadal
• Idade materna avançada
• Mutações gênicas
• Rearranjos estruturais
• Abortos anteriores – causas desconhecidas
Hellen Caldas - Medicina
Triagem no óvulo e no 
espermatozoide
CONCEPÇÃO
Primeiras divisões 
celulares
Remoção de 1 ou 
2 blastômeros
Análise genética
Evitar implantação de 
embrião inviável
Sem prejuízo: 
Células totipotentes
Hellen Caldas - Medicina
FISH
• Hibridação in situ por Fluorescência (FISH) 
• Técnica de citogenética molecular 
• Sondas de DNA marcadas com fluorescência
• Detecta anomalias cromossômicas: microdeleções e rearranjos 
complexos que estão além do poder de resolução da citogenética 
clássica. 
• É possível investigar tecidos preservados, tecidos fixados em formol, 
preparações para citogenética convencional, amostras de sangue 
periférico, medula óssea e as amostras pré-natais como vilosidade 
coriônica, líquido aminiótico, sangue fetal e material de abortamento.
Hellen Caldas - Medicina
PCR
• Modelo de amplificação de 
DNA in vitro
• Baseia-se na amplificação 
de pequenos fragmentos 
do DNA (não tem como 
fazer com todo o genoma, 
500 pares de base, no 
máximo), visando melhor 
visualização. 
• Situações em que eu 
preciso visualizar uma 
pequena quantidade de 
DNA. 
ESTRUTURA DO DNA
2 fitas antiparalelas 
Bases nitrogenadas, fosfato e pentose. 
O DNA se transcreve em RNA, que forma 
proteínas.
Hellen Caldas - Medicina
Quando eu quiser amplificar o DNA:
Extrair o DNA total
Adicionar no tubo o primer específico (A 
PRIMASE NÃO VAI AGIR NESSE CASO!!) para 
sequência que eu quero identificar. 
Se o primer conseguir se alinhar: processos normais 
começam → amostra testada é PCR positivo. 
Os primers mostram qual 
região do DNA vai ser 
amplificada. 
Processo in vivo: 
Toda a molécula de 
DNA tem que ser 
amplificada para 
completar a 
replicação. 
Primers: sequências que vão 
se ligar nas regiões de 
interesse, iniciando a 
duplicação do DNA.
São BEM específicos. Se o 
desenho do primer for ruim, 
pode dar errado, porque vai 
afetar a especificidade. 
Quanto maior o primer, mais 
específico ele vai ser 
(também não pode ser 
muito grande, pois dificulta 
o trabalho dele).
Hellen Caldas - Medicina
• Vários ciclos com variações de temperatura 
• Só vou trabalhar com a polimerase. 
• As demais enzimas? Substituídas por variações de temperatura. 
• O  de temperatura rompe as pontes de hidrogênio → Descarta helicase
e girase. 
• A  da temperatura promove o reanelamento→ Descarta primase
Hellen Caldas - Medicina
Reagentes da reação de PCR: 
• DNA a ser amplificado;
• Primers (forward e reverse) – tornam a reação específica;
• dNTPs (nucleotídeos que a polimerase utiliza para fazer a extensão da fita 
de DNA depois que o primer é colocado);
• DNA polimerase (extraída de bactérias que tem resistência à variação de 
temperatura);
• MgCl2 – cofator para o funcionamento da DNA polimerase, ativando-a;
• H2O RNAse e DNAse free (água sem essas enzimas que digerem material 
genético);
• Tampão – mantém o pH ideal constante para o funcionamento da DNA 
polimerase. 
Hellen Caldas - Medicina
• Polimerase: depois da ação do primer (necessário para sua ação), 
duplica uma fita simples de DNA. 
• Taq polimerase: enzima polimerase do Thermus aquaticus. 
Sua temperatura de duplicação é de 70-72 graus.
Adiciona uma adenina ao final da duplicação da sequência de DNA. 
Hellen Caldas - Medicina
ETAPAS DA REAÇÃO
1. Aquecimento a mais de 90 graus para a separação da dupla fita 
(desnaturação). Separa tanto a fita de DNA original, quanto seus 
produtos de amplificação. Permite o anelamento dos primers.
2. Anelamento/hibridização dos primers: Temperatura varia entre 40-70 
graus, conforme o par de primers. Determina a especificidade da ligação. 
3. Extensão dos primers (duplicação do DNA): Temperatura ótima em torno 
de 72 graus. Termociclador é utilizado na reação. 
4. Ao final da reação, a quantidade de DNA amplificado em relação ao DNA 
inicial é igual a 2^n, sendo que n= número de ciclos da PCR. 
5. -Efeito Plateau: desvio da quantidade teórica - perda da atividade da 
polimerase, acúmulo de inibidores, limitação dos componentes, 
competição entre produtos, pareamento produto X molde, competição 
com anelamento dos primers.
Hellen Caldas - Medicina
Hellen Caldas - Medicina