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Giovanna D. Cavalcante Alcântara
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
♥ Conceito: reação de polimerização em cadeia (polymerase chain reaction - PCR) é a técnica que permite a
amplificação do DNA in vitro, usando uma reação enzimática catalisada pela enzima polimerase cuja atividade
depende de íons Mg 2+.
♥ Esse método imita in vitro o que ocorre in vivo (na fase S do ciclo celular, nossa célula consegue tirar uma cópia
quase que fidedigna do nosso genoma em apenas 8 horas).
♥ Vantagens do PCR: rápido, eficiente, altamente específico e reprodutível, além do que qualquer sequência alvo
de DNA pode ser amplificada por PCR.
CONTEXTO HISTÓRICO
♥ Inventada em 1985 por Mullis. Ele conseguiu especificidade na cópia de apenas segmentos específicos,
introduzindo o conceito de primer de PCR e na utilização de uma DNA polimerase termoestável.
EM QUE CONSISTE A PCR?
♥ Técnica de amplificação de fragmentos específicos de DNA a partir de uma pequena porção. À medida que o
processo avança, o DNA gerado é usado como base para a nova replicação.
♥ A replicação é feita em ciclos – cada ciclo dá origem a 2 novas cadeias de DNA.
♥ Inicia-se uma reação em cadeia na qual o DNA amplia-se exponencialmente.
NO PROCESSO DE REPLICAÇÃO DO DNA
♥ Era preciso: DNA polimerase, helicase, ligase, primase e topoisomerase / as bases nitrogenadas (dATP’s
-desoxinucleotídeos trifosfato) / o DNA molde / Magnésio (como cofator). 
Observação: a dificuldade de reproduzir in vitro algo que acontece in vivo é que faz-se necessário a presença de
várias enzimas, e cada uma precisa ter suas respectivas temperatura e pH ideais. Logo, qualquer variação desses
fatores ou desnatura essas enzimas ou elas não cumprem a sua função de forma correta. Desse modo, a proposta foi
eliminar elas e tentar substituí-las por outros fatores, estratégias que fizessem elas cumprirem a sua função.
COMO SUBSTITUIR AS ENZIMAS?
♥ HELICASE (separa a fita dupla de DNA): substituída pelo calor, pois as pontes de hidrogênio são fracas, facilmente
rompidas.
♥ GIRASE OU TOPOISOMERASE (estabiliza o lado oposto do DNA que está sendo aberto): o DNA vai ser todo aberto pelo
calor (não há forquilha), então não será necessária a presença dessa enzima para estabilizar.
♥ LIGASE (liga os fragmentos de okazaki): não será útil, pois o DNA será replicado de uma ponta a outra, ambas de
forma contínua. Não terá uma fita contínua e uma descontínua.
♥ PRIMASE: forma os primers (sequência fita simples com função de fornecer à DNA polimerase a extremidade
3’OH): Esse primer é preciso, porém empresas podem fazer esses fragmentos, não precisa de uma enzima para
isso.
NO PROCESSO DE REPLICAÇÃO IN VITRO DO DNA
♥ Era preciso: DNA Polimerase / Bases nitrogenadas / DNA molde / Magnésio (cofator importante para a DNA
Polimerase).
Observação: A temperatura em média para abrir o DNA é de 94 Graus. Assim, essa temperatura não é ideal, pois a
DNA polimerase só “resiste” a 37 graus Celsius.
Giovanna D. Cavalcante Alcântara
♥ PCR em banho maria:
1. Aquecia o DNA a 94ºC em banho maria, abria o DNA.
2. Retirava os tubos com DNA do banho maria.
3. Adicionava a DNA Polimerase.
4. Colocava de novo em banho maria a 37°C para que a DNA Polimerase cumprisse a sua função.
5. Repetia o processo novamente.
Observação: Essa técnica acontecia, mas não tinha reprodução.
Posteriormente, Mullis- considerado inventor da PCR- identificou o gene que produz a DNA polimerase de
arqueobactérias que sobrevivem a altas temperaturas e clonou esse gene em E. Coli assim, a E.Coli começou a
produzir essas enzimas que aguentam a altas temperaturas (até 90°C, mas a ideal para ação é de 72°C) e não
desnaturam, dando reprodutibilidade para a técnica PCR.
Essa enzima é chamada de Taq DNA polimerase, pois o acrônimo dela vem de Thermus Aquaticus, que são essas
arqueobactérias. 
CARACTERÍSTICAS DA DNA POLIMERASE
♥ A DNA polimerase que usamos em PCR é isolada de uma arqueobactéria e clonada em Escherichia coli, pois
em cerca de 20 minutos são capazes de originar outra bactéria. Assim, ele patenteou a PCR e inventou os
primers.
ALGUMAS CARACTERÍSTICAS DO MÉTODO
♥ A replicação é feita em ciclos, cada ciclo origina 2 novas cadeias de DNA, ou seja, inicia-se uma reação em
cadeia, na qual o DNA é ampliado de forma exponencial.
INSULINA HUMANA
♥ Produzida por Escherichia coli (grupo de bactérias), para isso foi preciso isolar o gene humano da insulina, porque
ele está dentro de um cromossomo com vários outros genes. Assim, usa-se a PCR; ela retira o gene e faz cópias
dele, depois pega essas cópias e coloca em um plasmídeo (Escherichia coli), então a bactéria começa a produzir a
insulina humana. 
PRINCÍPIOS DA PCR
♥ Melting ou desnaturação (94 – 96 graus Celsius): consiste na separação da dupla fita do DNA a ser amplificado
em 2 fitas simples. Após aberto, o DNA fita simples continua íntegro por causa das suas ligações covalentes.
♥ Annealing, anelamento ou hibridização (37 – 65 graus Celsius): ligação do iniciador ou “primer” ao DNA a ser
amplificado nos sítios específicos da fita simples.
♥ Extension ou extensão: polimerização propriamente dita. DNA polimerase acrescenta os dNTPs à fita, de acordo
com o pareamento de bases. Temperatura ideal: 72 °C.
Observação: Quanto menos se aquece, melhor, porque apesar da taq polimerase ser termoestável esse ciclo se
repetirá 30 vezes, e ela começará a se degradar. 
♥ Os tubos são colocados no termociclador e aquecidos a 94°C, depois resfriados a 37°C. O processo é
automatizado e realizado em 2 horas, em seguida o aparelho diminui a temperatura para 4°C para conservar a
amostra. Devem ser adicionados a DNA polimerase, o par de primers, o cloreto de magnésio, as bases, o tampão
(responsável por fornecer um PH ideal para a reação) e o DNA molde. Os primers garantem a especificidade da
reação. 
Giovanna D. Cavalcante Alcântara
O QUE MUDA DE UMA DETECÇÃO DE HPV E H1N1?
♥ Apenas os primers, porque o par é específico para o gene que se quer amplificar. 
♥ O que é um primer? É um segmento de DNA ou RNA de 15 a 20 bases, baseado geralmente na sequência já
conhecida do ácido nucleico, sintetizado quimicamente por instrumentos automáticos. Eles fornecem os grupos
OH para o início da síntese, além de definir os limites do DNA a ser amplificado.
♥ Como funcionam os primers? E por que um par de primers? Para qualquer reação é sempre um par de primers,
porque um primer vai pegar uma das fitas e o outro pega a outra fita. Um chamamos de sense e o outro de
antisense, ou um foward e outro reverse. Resumindo: um 5’-3’ e o outro 3’-5’. Obviamente, o primer que é 5’-3’
vai hibridizar com a fita que tem a polaridade invertida que é 3’-5’ e vice-versa.
♥ Qual a função do primer? Ele vai identificar a região alvo.
♥ Como construir um primer específico? Por exemplo, quando se identifica o tipo de HPV utilizando um
sequenciamento, ou seja pega-se uma amostra do HPV na paciente, faz um sequenciamento dele para saber qual
o tipo. Se pegar uma sequência específica e dois primers com uma média de 20 bases, o programa fará isso
comparando com todas as sequências já submetidas e fará também uma checagem se o mesmo será realmente
específico para HIV, da mesma forma, analisando todas as informações do banco de dados com uma velocidade
muito grande.
♥ O próprio NCBI te dá ferramentas para construção de primers, indo na opção “primer” e o próprio site pega a
referência da sequência já utilizada, dando várias opções; como o tamanho do primer, a temperatura ideal e etc.
Pois dependendo do tamanho do primer e da região, a temperatura se altera. Dando um par, eles vão ter 20
nucleotídeos de tamanho, com temperatura ideal de 60 graus e a maioria das regiões dadas tem em sua maioria
guanina e citosina, devido a questão das pontes de hidrogênio e a força de ligação. Após isso, se pega o primer,
copia a sequência e envia para uma empresa para que se possa ser feito, a mesma envia para sua casa e esse
primer irá identificar HIV do tipo 1 especificamente.
CICLO 1
1. Aos 94ºC, o DNA abre (Meltingou desnaturação).
2. Ao baixar a temperatura, os primers acham a região complementar. Observa-se que o tamanho da sequência é
maior que o primer, pois ele só vai identificar as pontas; e a DNA polimerase faz o resto da sequência
(Anelamento).
Observação: Por que a DNA polimerase ficou nesse lado, polimerizou para esse lado? Porque pela polaridade desse
primer e pelo sentido da síntese da DNA polimerase, ela não adiciona nada nessa extremidade 5’ – 3’. Só terá uma
molécula alvo solta a partir do terceiro ciclo.
♥ Muda-se a temperatura, subindo para 94 graus Celsius, acabando a fase de extensão. Assim, o DNA não
apresenta região de forquilha, pois ele já foi aberto pelo calor. Agora há 2 DNAs moldes, 4 fitas.
CICLO 2
♥ Os primers vão entrar, no sentido 5’-3’. A fita vai estar só no fragmento alvo, porque a DNA polimerase vai fazer
até onde tiver homologia, ou seja, até o final da sequência, ela não vai continuar, porque não tem nada.
CICLO 3
♥ Neste ciclo, tem-se as primeiras sequência alvos solta. Elas continuam servindo de molde e essas continuam
servindo de molde” e os primers entrando e sendo consumidos pela reação, ficando na sequência.
♥ Porque ela usa ciclos? Porque ele vai fazendo cópias a cada ciclo e eles precisam ter a temperatura de
desnaturar, de anelar e dar Taq, para depois voltar para a temperatura inicial. 
♥ Por que 30 ciclos? Porque com 30 ciclos ela tem mais de 1 bilhão de cópias (1.073.741.824).
♥ Eu poderia fazer 60 ciclos? Poderia, mas com 1 bilhão já possível ver a olho nu. 
CINÉTICA DA PCR
Giovanna D. Cavalcante Alcântara
♥ É baseada no número de fragmentos gerados, que recebem o nome de amplicons. O primer é menor que a
sequência alvo então vai só para as pontas, e o resto da sequência quem vai fazer é a DNA polimerase. Exemplo:
Vírus de HPV (DNA) com 9 mil bases no genoma, é utilizado um fragmento de 450 pares, ou seja, os primers
reconhecem uma região de 450 pares, mas cada primer só tem 20 bases e cada um se conecta na ponta da
sequência.
♥ Fases da PCR
♥ Screening: o número de amplicons é muito pequeno porque é a fase que os primers ainda estão procurando a
região alvo. (no gráfico é o ciclo 0).
♥ Exponencial: o número de amplicons está aumentando porque o fragmento alvo já foi encontrado e está sendo
replicado de forma exponencial. (no gráfico é do ciclo 0 ao 30).
♥ Platô: os reagentes já saturaram (DNA polimerase já foi degradada, acabaram os primers e as dNPTs). (no gráfico
é a partir do ciclo 30).
♥ 30 ciclos é a quantidade suficiente para analisar e a concentração utilizada é baseada nessa quantidade.
Poderiam ser feitos mais ciclos, porém não é necessário.
OBS: Se você parar a máquina no ciclo 20 e observar que não tem nenhuma banda no gel, significa que a reação não
ocorreu (por causa dos reagentes ou porque não tinha o dna alvo), então não adianta continuar pois nada vai
acontecer.
Para ver o resultado da PCR é necessário fazer uma eletroforese (correr o gel).
VANTAGENS DA PCR
♥ É muito sensível (ela pode amplificar a partir de uma única cópia).
♥ Grande quantidade de DNA em pouco tempo.
♥ Baixo custo.
♥ A amostra não precisa estar altamente purificada (a parte do DNA a ser pesquisada estará misturada com a parte
não desejada e isso não compromete a técnica de PCR).
DESVANTAGENS DA PCR
♥ Requer técnicas específicas para conduzir o teste e avaliar o resultado;
♥ Muita atenção na hora de produzir amostras.
Observação: como o procedimento exige um número muito grande de amostras, geralmente é feita uma mistura com
os produtos (Mg2+, tampão, Taq, etc.) em um recipiente maior e depois é dividido para 50 amostras em tubos
pequenos já com DNA contidos. Assim, o risco de algum erro para quem está preparando se torna muito menor.
Giovanna D. Cavalcante Alcântara
ELETROFORESE
♥ É uma técnica que usa duas características para separar os fragmentos de DNA: carga e peso molecular (tamanho
do fragmento). Pode ser feito também para proteína e RNA.
♥ São utilizados dois eletrodos, um positivo e um negativo, e como o DNA tem carga negativa ele é colocado no
eletrodo negativo. Ele vai migrar no gel até o positivo, e quando a amostra é muito grande o fragmento vai
ficando retido no gel, e isso são bandas que se veem quando analisa o gel. Quanto menor o fragmento, mais
perto ele fica do eletrodo positivo.
♥ Foram colocadas as três amostras ao mesmo tempo, na mesma voltagem (mesmo gel - polímero), e as mesmas
ficaram em locais diferentes devido ao peso molecular ser diferente de acordo com a quantidade de bases (500,
300 e 100 bases). Como a de 100 bases é menor, migra mais rápido. 
Observação: a concentração do gel também influencia no deslocamento.
♥ Os marcadores são as referências, ou seja, já possuem tamanhos determinados para utilizar como
comparativo. O controle positivo é uma amostra positiva para o que está testando. Participa de todas as reações
novas. Nela sempre aparecerá a banda (se não aparecer – o teste não é confiável). O controle negativo apresenta
todos os reagentes menos o DNA – para que não amplifique. Se ele amplificar, na hora da manipulação houve
contaminação. 
Observação: Às vezes você olha no gel e encontra uma banda bem mais forte que a outra. Ambas são positivas, mas
a que está mais forte tem mais fragmentos. Quando uma banda está bem mais grossa e brilhosa do que a outra é
porque contém mais fragmentos. Isso mostra que a carga viral inicial é maior.
VARIAÇÕES DA PCR
NESTED PCR (PCR DA PCR)
♥ Quando se quer amplificar um fragmento muito pequeno, primeiro amplifica-se o fragmento maior no qual o
pequeno está contido. Fazendo isso, aumenta-se a chance de encontrar o menor.
♥ Aumenta a quantidade de produto final e a sensibilidade da técnica.
RT-PCR (REVERSE TRANSCRIPTASE CHAIN REACTION)
Giovanna D. Cavalcante Alcântara
♥ É a PCR de transcriptase reversa.
♥ Faz-se o cDNA (DNA complementar). Além de todos os reagentes que são usados na PCR convencional, na RT-PCR
é usada a enzima de transcriptase reversa.
♥ Compra-se o kit e a reação de conversão RNA-DNA é automática quando a enzima é colocada para reagir. Ex.:
Ferramenta útil em estudos de HIV.
CUIDADO! Alguns autores consideram a sigla da RT-PCR como a Real Time PCR, e não como Reverse Transcriptase
PCR.
CLONAGEM
♥ Isolamento do gene a ser clonado. 
♥ Amplificação do gene por PCR.
♥ Inserção dos genes em plasmídeos. 
♥ Introdução do plasmídeo no organismo e expressão do gene.
PCR REAL TIME
♥ Técnica desenvolvida devido a algumas limitações da PCR convencional, que no caso seria que a avaliação do
resultado só é possível após o gel está pronto, o que demanda muito TEMPO.
♥ O acompanhamento do processo se dá em tempo real. Com isso, durante as fases da cinética (screening,
exponencial e platô) o pesquisador analisa os dados pelo computador.
♥ Existem variações da PCR realtime. Exemplo: qPCR ( PCR realtime quantitativa) – o próprio termo quantitativa já
restringe à realtime.
♥ Existem várias técnicas utilizadas na PCR real time 
♥ TECNEN - Utiliza um primer a mais do que a convencional, esse primer com auxílio de uma sonda será colocado
no meio da sequência alvo. Quando há o encontro do primer convencional com esse novo primer, este último é
ejetado e libera substâncias fluorescentes que são detectadas pelo laser do computador. Isso permite identificar
a região por onde passou o primer convencional e quantificá-los. Essa técnica mostra a cinética da PCR, então
você liga e espera alguns minutos iniciais, por que os fragmentos não vão aparecer, pois ainda está na fase de
screening.
♥ Se chegar à exponencial e a linha continuar reta é por que o resultado é negativo. Dessa forma, pode-se desligar
a máquina e dá o resultado. Se a linha começar a subir: é sinal de que o resultado é positivo. Porém, precisa
esperar até o final para máquina contar a carga viral.
♥ Desde a coleta do material, extração do DNA, usando a técnica em real time, em 1h: 30 min já é possível ter o
resultado com diagnóstico preciso.
QUESTÃO DO PROFESSOR
Giovanna D. CavalcanteAlcântara
 
♥ 30.000 bases: é o tamanho do genoma dele (o nosso tem 3,2 bilhões de bases). 
♥ ... O que pôde ser feito por RT-PCR... Se não tivesse sido escrito isso, vocês saberiam que é transcriptase reversa
porque é um vírus de RNA. .
♥ Então, aqui ele está mostrando a região alvo do RNA do vírus e ele pede para que você ache os primers. Nesse
caso ele só colocou as extremidades porque é onde o primer vai ser ligado. 
♥ Com isso, ele pede para achar qual seria o primer. 
♥ Tem duas dicas para essa questão: 
♥ Como é um vírus de RNA, a primeira coisa a ser feita é a transcrição reversa. Então, a partir desse RNA, deveria
ser feito um DNA complementar e aí construir um primer para esse DNA. 
♥ Se você olhar as setinhas, onde ele coloca iniciador I e iniciador II, ele mostra onde o primer vai iniciar. 
Resposta correta: Letra A.