Replicação do DNA e suas fases

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Replicação
· Em uma replicação da molécula de DNA, estima-se que possa acontecer uma mutação nucleotídica a cada 109 nucleotídeos. Há cerca de 3 bilhões de pares de bases de DNA em seu genoma, os quais devem ser copiados com precisão quando qualquer uma de seus trilhões de células se divide.
· A replicação do DNA é semiconservativa, o que significa que cada fita na dupla hélice atua como modelo para a síntese de uma nova fita complementar.
· A replicação ocorre apenas em uma fase do ciclo de divisão celular, denominada fase S, ou fase síntese de DNA.
Início da replicação
· A replicação sempre começa em locais específicos no DNA, que são chamados de origens de replicação e são reconhecidos pela sua sequência, rica em adenina e timina. Proteínas especializadas reconhecem a origem, ligam-se a este sítio, e abrem o DNA. Conforme o DNA se abre, duas estruturas com formato de Y, chamadas de garfos ou forquilhas de replicação, são formadas, juntas compõem o que é chamada uma bolha de replicação. Os garfos de replicação movem-se em direções opostas à medida que a replicação acontece.
· Os procariotos, como as bactérias, possuem apenas uma única origem de replicação em seu cromossomo. Isso não poderia ocorrer no eucarioto, visto que um cromossomo nosso tem um tamanho médio de 150 milhões de pares de nucleotídeos, e, através dos estudos, descobriram que a taxa de replicação é de 3kb/min, e que se houvesse apenas uma origem de replicação, a replicação de um cromossomo levaria aproximadamente 34 dias, tempo inviável visto que a fase S tem duração de mais ou menos 8 horas. Então, as células eucariotas criaram vários sítios de origens de replicação (assincrônica), ou seja, a replicação do DNA inicia-se em diferentes sítios simultaneamente. São, em média, de 20 a 80 origens de replicação.
· Essas forquilhas em algum momento se fundem, formando o que conhecemos como as duas fitas lineares de DNA:
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· Como há diversas origens de replicação, deve haver um controle da iniciação desse processo. Esse controle se dá dividindo as origens em diferentes fases do ciclo celular: algumas proteínas podem se ligar na origem apenas na fase G1 e a formação de proteínas para a formação da forquilha ocorre somente na fase S; além disso, regiões diferentes de um cromossomo são replicadas em diferentes momentos na fase S do ciclo celular:
· Na fase G1, proteínas iniciadoras denominadas complexo de reconhecimento de origem (OCR) reconhecem e se ligam a estas origens de replicação no DNA. Ao se ligarem, essas proteínas atraem a enzima helicase para a forquilha de replicação e permanece inativa por proteínas inibidoras, também atraídas pelo complexo. (quando ativa, tem a função de abrir a dupla fita de DNA). A helicase, junto com as proteínas iniciadoras e as inibidoras formam o complexo pré-replicativo.
· Então, na fase S, as proteínas inibidoras de helicase desocupam a origem de replicação, permitindo que a enzima helicase desenrole a dupla fita de DNA para ter início da replicação (a helicase rompe as ligações de hidrogênio entre as bases), formando a “bolha”.
Componentes necessários para a replicação do DNA:
(1) Molde de DNA: As duas fitas mãe de molde.
(2) dNTPs: desoxirribonucleotídeos trifosfatados
(3) Enzima DNA polimerase.
(4) Iniciador (primer): pequena sequências de RNA produzida pela enzima Primase
(5) Enzimas adicionais: helicase, primase, topoisomerases, DNA-ligase, Rnase H e SSBs
· Uma nova fita, tanto de DNA quanto de RNA só pode ser polimerizada no sentido 5’ para 3’. Como as duas fitas-filhas de DNA são polimerizadas nessa direção, o DNA sintetizado na fita descontínua, denominada de fita tardia, deve ser feito em uma série de pequenos segmentos de DNA, os fragmentos de Okasaki, que são sintetizados em sequência.
A polimerização é feita da seguinte forma: o dNTP é incorporado na -OH do carbono 3’ da pentose, então, ele desprende dois fosfatos (pirofosfato), que libera a energia necessária para haver a incorporação do nucleotídeo à nova fita. Dessa forma, a enzima polimerase poderá atuar.
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· A estrutura da enzima DNA polimerase se assemelha com uma mão direita, na qual a palma, dos dedos e o polegar seguram o DNA formando o sítio ativo da enzima. O posicionamento correto do dNTP (pareamento) provoca um “aperto dos dedos” da enzima e a liberação do pirofosfato provoca a “liberação dos dedos”, de modo que a molécula de DNA pode se translocar em um nucleotídeo.
· Ela é uma enzima que possui duas atividades: endonuclease 5’-3’ (adiciona nucleotídeos à nota fita; e exonucleases 3’-5’ (remove nucleotídeos com pareamento inadequado = ligações de hidrogênio fracas, os “dedos da DNA polimerase” não se fecharão, não haverá mudança conformacional).
· Iniciador (primer): São sequências de 10 a 60 nucleotídeos de RNA adicionados pela enzima Primase na fita contínua e descontínua da Forquilha de Replicação, que servirão de “guia” ou “marcadores” para que a DNA Polimerase continue o alongamento da nova fita a partir deles, como ocorre com a adição de OH no carbono 3’ da pentose. Na fita descontínua, os Primers apresentam cerca de 10 nucleotídeos de comprimento e estão dispostos em intervalos de 100 a 200 nucleotídeos (estes intervalos serão preenchidos com os Fragmentos de Okasaki)
· Rnase e DNA ligase: após a polimerização das duas fitas da forquilha de replicação, a enzima Rnase H remove os primers. Nestes espaços sem primers, a DNA polimerase adiciona dNTPs. Uma outra enzima denominada DNA ligase une os fragmentos de Okasaki da fita descontínua.
· Outras enzimas: SSB (se ligam às fitas simples do DNA, fazendo com que estas permanecem abertas); topoisomerases (reduz o stress contorcional da dupla fita na extremidade da forquilha de replicação).
· Resumo do processo de replicação: