Relatório 1 -Prática de química dos alimentos

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Introdução
As proteínas tem como unidade fundamental os aminoácidos e são construídas através de ligação amida entre os aminoácidos. Os aminoácidos são moléculas orgânicas que possuem ligadas ao mesmo carbono denominado de carbono α um átomo de hidrogênio, um grupo amino, um grupo carboxílico e uma cadeia lateral R (característica para cada aminoácido).Essa cadeia que difere os aminoácidos em estrutura, tamanho e propriedade físico-química(Francisco Jr e Francisco 2006). Para separar e identificar esses aminoácidos são utilizados métodos químicos como:
1-Reação com ninhidrina: A reação de ninhidrina é uma reação corada própria de aminoácidos, quando os aminoácidos são aquecidos em uma solução com excesso de ninhidrina, as ligações amida sofrem hidrólise liberando os aminoácidos constituintes, todos os aminoácidos que contem grupamento amino livre produzem um composto de cor púrpura, conhecido como púrpura de Ruehmann. Essa reação também pode ser utilizada para detectar peptídeos e proteínas que possuem grupamento amino livre. A intensidade da cor produzida é proporcional à concentração de aminoácidos, peptídeos ou proteínas presentes na solução. A prolina é uma exceção já que sua reação com ninhidrina produz uma coloração amarela, pois a prolina é um iminoácido, portanto contém uma cadeia alifática e não possui um grupamento amino livre.
2-Hidrólise enzimática de uma proteína: As proteases são enzimas que atuam catalisando a hidrólise de ligações peptídicas presentes em proteínas e polipeptídeos que resulta em aminoácidos ou peptídeos menores.
3-Reação com biureto: Esta reação é positiva para proteínas e aminoácidos com três ou mais resíduos de aminoácidos e para substâncias que contêm duas carbonilas ligadas diretamente ou através de um único átomo de carbono ou nitrogênio. Quando o biureto reage com os íons Cu2+ em meio alcalino resulta na formação de um complexo de cór púrpura, resultante da coordenação dos átomos de nitrogênio das ligações peptídicas com o íon Cu2+, as ligações existentes nas reações de biureto são muito parecidas com as ligações peptídicas estabelecidas entre os aminoácidos formadores das cadeias peptídicas que originam as proteínas. Dessa fora é possível determinar a concentração da proteína.
Materiais e Métodos
A) Coloração dos aminoácidos com a Ninidrina
	
Materiais: 5 tubos de ensaio
Soluções de aminoácidos a 0,1%
Solução de ninidrina a 0,2% em acetona
Banho Maria
Foi realizado o experimento como indicado na tabela abaixo:
	Tubos
	H2O
	GLY
	PHE
	LEU
	PRO
	1
	1 mL
	-
	-
	-
	-
	2
	-
	1 mL
	-
	-
	-
	3
	-
	-
	1 mL
	-
	-
	4
	-
	-
	-
	1 mL
	-
	5
	-
	-
	-
	-
	1 mL
Em seguida, acrescentou-se 10 gotas da solução de ninidrina em cada tubo e aqueceu-se em banho maria por 5 minutos. Observou-se os resultados.
B) Hidrólise ácida de uma proteína e identificação dos aminoácidos por cromatografia em papel
Materiais: gelatina comercial
	 HCl 6 M
	 n-butanol
	 ácido acético glacial
	 solução a 0,2% de ninidrina em acetona
	 papel whatman número 1
	 cuba para cromatografia
	 padrões de aminoácidos 0,1% (GLY, PHE, LEU, PRO, ASP)
Procedimento experimental:
a) Hidrólise do colágeno (foi feita antes da aula prática).
	Pesou-se 100 mg de gelatina comercial, dissolveu-se em 1 mL de HCl, e transferiu-se para uma ampola. Selou-se a ampola num maçarico e a aqueceu a 110oC por 24 horas. O material resultante é o hidrolisado do colágeno (H).
b) Cromatografia
	Numa tira de papel Whatman no 1, de 20 x 6 cm, traçou-se um risco à lápis a 2 cm da extremidade e marcou-se 5 pontos, distantes 1 cm entre si (como no modelo abaixo):
H
PHE
GLY
PRO
LEU
	Com auxílio de capilares, aplicou-se 3 gotas do hidrolisado do colágeno no ponto H, e 3 gotas dos aminoácidos padrões, como indicado no modelo acima. 
	Deixou-se secar e colocou o papel numa cuba contendo o solvente butanol/ácido acético/H2O na proporção de 3:1:1. O desenvolvimento da cromatografia se dará em mais ou menos 2 horas. Depois desse tempo, retirou-se o papel da cuba e o secou a 100oC em estufa. Em seguida, molhou-se o papel na solução de ninidrina a 0,2% e aqueceu-o a 110 oC por 5 minutos. Tente interpretar os resultados obtidos.
C) Hidrólise enzimática de uma proteína
Materiais: gelatina comercial a 5%
	 Solução de papaína do mamão ou amaciante de carne “zurita”.
	 Solução de papaína fervida durante 15 minutos a 100 oC.
	 3 tubos de ensaio
Procedimento experimental: Preparou-se os tubos de acordo com a tabela abaixo:
	Tubos
	Solução de gelatina a 5 %
	H2O
	Enzima
	1
	2 mL
	1 mL
	-
	2
	2 mL
	-
	1 mL (papaína)
	3
	2 mL
	-
	1 mL (papaína fervida)
Deixou-se os tubos à temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida, colocou-os na geladeira, esperou-se por mais 20 minutos e, após esse período, verificou-se o que aconteceu em cada tubo. 
D) Curva padrão para a determinação da concentração de proteínas utilizando-se a reação do biureto.
	Introdução: Peptídeos e proteínas reagem com o reagente de biureto (sulfato de cobre alcalino) formando um complexo de cor púrpura, resultante da coordenação dos átomos de nitrogênio das ligações peptídicas com o íon Cu++. Esta reação é chamada reação do biureto, e pode ser utilizada como um método para se determinar a concentração de proteínas.
	Procedimento: utilizou-se a tabela abaixo.
	Tubos
	Solução de caseína a 2 % (mL)
	H2O (mL)
	Reativo do biureto (mL)
	1
	-
	1,0
	3,0
	2
	0,1
	0,9
	3,0
	3
	0,2
	0,8
	3,0
	4
	0,3
	0,7
	3,0
	5
	0,4
	0,6
	3,0
	6
	0,5
	0,5
	3,0
	7
	0,3 mL de uma solução X
	0,7
	3,0
1. Esperou-se 15 minutos à temperatura ambiente e depois fez-se um “scan” de absorbância das proteínas no espectrofotômetro. Em seguida selecionou-se no espectrofotômetro o comprimento de onda no qual foi observada a absorbância máxima e efetuou-se a leitura dos demais tubos, ajustando-se a absorbância zero com o branco (tubo 1).
1. Construiu-se um gráfico, relacionando as concentrações de caseína em mg/mL (eixo X) com os valores de absorbância (eixo Y), observadas para cada tubo.
1. Determinou-se a concentração de proteínas em mg/mL da sua solução X.
Resultados e Discussão
1. COLORAÇÃO DOS AMINOÁCIDOS COM NINIDRINA
		Em cada tudo de ensaio foram adicionados 1 mL de cada aminoácido (Glicina, Phenilalanina, Leucina e Prolina) a 0,1% e 1 em um tubo foi adicionado somente água. Em seguida, acrescentou-se 10 gotas de ninidrina e os tubos foram aquecidos em banho maria por 5 minutos. Após realizar o experimento, observou-se os seguintes resultados:
	Tubos :
	Coloração :
	1 (H2O)
	Incolor
	2 (GLY)
	Violeta
	3 (PHE)
	Violeta
	4 (LEU)
	Violeta
	5 (PRO)
	Laranja
		Na reação da ninidrina, o aquecimento da solução de proteínas desestabelece a estrutura tridimensional do peptídeo. A ninhidrina, então, reage com o grupamento amina (sendo positiva para proteínas, peptídeos, aminoácidos, aminas primárias e amônia) presente nos aminoácidos, formando como produto final um complexo de coloração azul-violeta. Com a prolina, forma-se um produto de coloração amarelada.
A diferente coloração da prolina deve-se ao fato de que a prolina, diferente dos demais aminoácidos, apresenta uma estrutura cíclica alifática e o nitrogênio está ligado a dois átomos de carbono. O grupo amina da prolina é, então, uma amina secundária, enquanto os grupos aminas de todos os outros aminoácidos são aminas primárias.
	O tubo de ensaio com solução de proteínas apresentou coloração azulada, a solução com água destilada no lugar da solução de proteínas não apresentou alteração de coloração.Os resultados podem ser visualizados na figura:
Figura 1: Coloração dos aminoácidos com ninidrina
A) HIDRÓLISE ÁCIDA DE UMA PROTEÍNA E IDENTIFICAÇÃO DOS AMINOÁCIDOS POR CROMATOGRAFIA EM PAPEL
	Numa tira de papel Whatman nº1, de 20x6 cm, forma traçados 5 pontos, um correspondendo ao colágeno (H) e os outros a um aminoácido (PHE, GLY, PRO e LEU) e pingou-se gotas de cada um sobre os pontos. Em seguida, deixou-se secar e o papel foi colocado em uma cuba contendosolvente butanol/ácido acético/H2O na proporção 3:1:1. Apód 2 horas, retirou-se o papel da cuba e seco-se em estufa a 100ºC. Em seguida, o papel foi molhado na solução ninidrina a 0,2 % e aqueceu-se a 110ºC por 5 min, obtendo-se os seguintes resultados como mostrado na figura: 
Figura 2: Identificação dos aminoácidos por cromatografia em papel
	Pode-se observar que cada aminoácido apresetou um comportamento característica, sendo, portanto, possível a sua separação quando componentes de uma proteína. A diferença de comportamento deve-se a reação de polaridade entre estes e o solvente, sendo que outros fatores também podem estar envolvidos, como: temperatura, pH, tempo, peso molecular das substâncias utilizadas, concentração, entre outras.
B) HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE UMA PROTEÍNA
	
	Em 3 tubos de ensaio, colocou-se 2 mL de solução de gelatina 5%. No primeiro, foi adicionado 1 mL de água, no segundo 1 mL de papaína do mamão, e no terceiro, 1 mL de papaína do mamão fervida por 15 minutos a 100ºC. Os tubos foram deixados à tempreatura ambiente por 20 minutos e em seguida, colocados na geladeira por 20 minutos. Após esse período, verificou-se os seguintes resultados:
Tabela 2: Hidrólise enzimática de uma proteína
	Tubos
	Solução de gelatina a 5 %
	H2O
	Enzima
	Resultados
	
1
	
2 mL
	
1 mL
	
-
	
Ficou solidificado
	
2
	
2 mL
	
-
	
1 mL (papaína)
	
Ficou líquido
	
3
	
2 mL
	
-
	
1 mL (papaína fervida)
	
Ficou solidificado e com formação de bolhas
	A gelatina é um derivado alimentar do colágeno composta por uma mistura de polipeptídeos. Sua obtenção é realizada pela hidrólise parcial do colágeno. Uma das principais características da gelatina é sua capacidade de gelatinização. Em temperaturas não muito elevadas, a gelatina apresenta a propriedade de reter moléculas de água, formando assim um gel. Como mostra a Tabela 2, a gelatinização é observada nos experimentos 1 e 3, por outro lado, no experimento 2 a gelatinização não é verificada à hidrólise enzimática das ligações peptídicas da gelatina. Em contrapartida, quando se utiliza os reagentes fervidos, as enzimas neles presentes são desnaturadas pela temperatura, fato que impede as mesmas de catalisarem a hidrólise das ligações peptídicas da gelatina.
D) CURVA PADRÃO PARA A DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS UTILIZANDO-SE A REAÇÃO DO BIURETO.
		A Reação do Biureto é utilizada para determinar a concentração de proteínas. As proteínas ou peptídeos, quando tratados por uma solução diluída de sulfato de cobre em meio alcalino, apresentam uma coloração púrpura característica. 
		Como na tabela a seguir, em cada tubo de ensaio foram adicionadas diferentes quantidades de caseína 2%, sendo que no tubo 7, a concentração de proteínas na solução X de caseína era desconhecida, diferentes quantidades de água e 3 mL de Reativo do Biureto em todos os tubos. Observou-se os seguintes resultados:
Tabela 3: Determinação da concentração de proteínas utilizando-se a Reação de Biureto
	Tubos
	Solução de caseína a 2 % (mL)
	H2O (mL)
	Reativo do Biureto (mL)
	Coloração
	Absorbância
	1
	-
	1,0
	3,0
	Lilás
	Branco (0,00 abs)
	2
	0,1
	0,9
	3,0
	Lilás
	0,095 abs
	3
	0,2
	0,8
	3,0
	Lilás
	0,257 abs
	4
	0,3
	0,7
	3,0
	Lilás
	0,381 abs
	5
	0,4
	0,6
	3,0
	Lilas
	0,487 abs
	6
	0,5
	0,5
	3,0
	Lilás
	0,603 abs
	7
	0,3 mL de uma solução X
	0,7
	3,0
	Lilás
	0,234 abs
	
	Após 15 minutos da adição das substâncias nos tubos, fez-se a leitura da absorbância dos tubos no espectrofotômetro a 540 nm.
	Os tubos apresentaram, coloração lilás, que foi aumentando gradativamente a intensidade da cor, conforme se aumentava a quantidade de caseína adicionada nos tubos. Esses resultados podem ser vistos na figura:
Figura 3: Coloração dos tubos após a adição do Reativo de Biureto
	
	Os números de mol de caseína foram calculados conforme segue:
Volume da solução de caseína * 0,02 = volume de caseína
O volume de caseína encontrado foi divido pelo seu peso molecular (23g) encontrando-se o número de mols.
	Os dados encontram-se na tabela abaixo.
Tabela 4: Número de mols de caseína
	Volume de solução (mL)
	Volume de caseína (mL)
	Número de mols de caseína
	0,0
	0,0
	0,0
	0,1
	0,002
	0,087 x 10-3
	0,2
	0,004
	0,174 x 10-3
	0,3
	0,006
	0,261 x 10-3
	0,4
	0,008
	0,348 x 10-3
	0,5
	0,01
	0,430 x 10-3
	Um gráfico relacionando o número de mols de caseína (eixo X) com os valores de absorbância (eixo Y) observadas para cada tubo foi construído no Excel.
Obteve-se a seguinte equação de reta:
y = 1449,4 x – 0,0122
	Através dessa equação da curva padrão, podemos determinar a concentração desconhecida da solução X:
	A solução X apresentou absorbância igual a 0,234, e substituindo temos:
y = 1,232x – 0,004
0,234 = 1449,4x – 0,01224
1449,4x = 0,2462
x = 0,169 
x ~ 0,17 mols de caseína
Fazendo-se uma regra de 3, temos:
0,17 mols de caseína ---- 0,006 mL
Número de mols de caseína ---- 1000 mL
Número de mols de caseína em 1000 mL = 28,16 mols
Relacionando o volume da caseína na soluçao com o volume da solução, encontra-se a concentração da solução.
M1V1 = M2V2
28,16 x 0,006 = M2 x 0,3
M2 = 0,567 mol/L
Portanto, a concentração molar da substância X é de 0,567 mol/L.
Conclusão 
	A partir dos resultados observados, conclui-se que é possível determinar a presença de proteínas em solução com o auxílio de algumas reações químicas conhecidas, bem como a natureza de alguns aminoácidos presentes nestas proteínas. É possível identificar as proteínas como moléculas carregadas e reconhecer os fatores ligados a solubilidade das proteínas.
	Os métodos utilizados nos itens A, B, C e D podem ser considerados eficazes, pois através deles foi possível obter resultados de coloração, cromatografia em papel, hidrólise enzimática e curva padrão de proteínas 
Referências
 
· FRANCISCO Jr., W.E.F. e FRANCISCO, W. Proteínas: hidrólise, precipitação e um tema para o ensino de química. Química Nova na Escola, n. 24, p. 12-16, 2006.
· ALMEIDA, Vanessa Vivian; CANESIN , Edmilson Antônio; SUZUKI, Rúbia Michele e PALIOTO,Graciana Freitas; Análise quantitativa de proteínas em alimentos por meio de reação de complexação do íon cúprico. Química Nova na Escola, p. 34-40, 2012.
· PATROCINIO, Daniele do Espírito Santo; Sensibilidade da protease de papaína de Carica papaya a agentes utilizados em técnicas de imobilização, Universidade Estadual Paulista - Faculdade de Ciências e Letras – Assis/SP p 02486-02489.
· UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO; <www.ufpe.br/dbioq/portalbq04/arquivos/apostila%202007.doc> acessado em 16/11/2013.
· UNIVERSIDADES ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”; <http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_proteinas/reacoes_coradastres.htm > acessado em 16/11/2013.
Absorbância x número de mols de caseína
absorbância	8.7000000000000001E-5	1.74E-4	2.61E-4	3.48E-4	4.2999999999999999E-4	9.5000000000000001E-2	0.25700000000000001	0.38100000000000001	0.48699999999999999	0.60299999999999998	Número de mols de caseína
Absorbância (540nm)
1