Clonagem Gênica e Terapia Gênica Somática

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Humberto Azzi
2P - Medicina
FCMS/JF
Clonagem Gênica
- Utilizada para gerar cópias de fragmentos superiores a 40kb quando possui genes sem o 
conhecimento da sequencia ou quando não é possível fazer PCR
Estágio de Amplificação
- Construção do DNA recombinante. Para que isso ocorra é preciso que uma enzima de restrição 
clive uma região não essencial do DNA circularizado, para que possa haver a inserção do gene 
alvo.
- Após a inserção do Gene Alvo, há a transformação que consiste em inserir esse plasmídeo na 
célula competente, que pode ser uma Bactéria ou Levedura, e é necessário que haja apenas 
um plasmídeo por célula transformada (célula com DNA recombinante).
- Conforme elas se reproduzem, replicam o plasmídeo e o transmitem para seus descendentes, 
produzindo cópias do DNA que ele contém.
Estágio de Transformação
- Bactéria ou Levedura normal é tratada com Cloreto de Cálcio (CaCl2), para que este se torne 
uma célula competente.
- Ao se transformar em célula competente, o plasmídeo se prende a membrana celular e é 
transportado para dentro. Esse processo se chama Transfecção, quando é a inserção de um 
Fago na célula
Estágio de Separação
- Em alguns casos há a amplificação de mais de um plasmídeo por placa (região onde as 
bactérias formam sua cultura)
- A Separação é necessária para que se consiga escolher as bactérias contendo DNA 
Recombinante específico
- Para que esse fenômeno possa ocorrer é necessário que no plasmídeo sejam produzidos 
marcadores de seleção (são proteínas de resistência a antibióticos), logo após a transformação.
Como Identificar o Vetor Recircularizado contendo a inserção do DNA?
- Usado como exemplo a pBR322, que possui resistência tanto a Ampicilina quanto a Tetracidina
- Pode-se inserir o DNA Recombinante invalidando uma das duas resistências deixando-a 
resistente a Tetracidina ou a Ampicilina 
- Após isso, as células são colocadas em um meio contendo antibiótico em que as duas são 
resistentes e as deixam multiplicar
- Com as colonias formadas, encosta-se numa outra placa onde há colônias para que as 
bactérias fiquem aderidas e as colocam em meio a outro antibiótico, que possui apenas uma 
resistência
- Com isso, essa nova placa ficará com regiões vazias, que é onde houve morte celular, e dará 
para comparar uma placa com a outra para saber em que posição se encontram as bactérias 
recombinantes
Terapia Gênica
- É a aplicação dos princípios genéticos no tratamento das doenças humanas pela introdução de 
material genético em células-alvo
Terapia Gênica Somática
- Transferencia de um gene com intuito terapêutico. Permite corrigir o fenótipo de doença de uma 
célula somática pela introdução de um material genético
- Ex Vivo
- In Vivo
- Transferencia In Situ (diretamente para o Tecido Alvo)
Transferencia de Genes Ex Vivo
1 - Células de um animal que não produz algum tipo de substancia vital são retiradas e cultivadas 
em laboratório
2 - Material genético com instruções para fabricar o “remédio” (a substância que o animal 
consegue produzir) é inserido em um vírus modificado
3 - O vírus modificado “infecta” as células do animal que estão sendo cultivadas
4 - Com a “infecção”, as células passam a produzir a substancia. Logo, as células são injetadas no 
animal
Transferencia de Genes In Vivo
- Modificação feita diretamente no paciente
Terapia Gênica de Células Somáticas
Inserções Virais
- Vetores Retrovirais, Adenovirais e Adeno-Associados
- Retrovirais: Integração aleatória no cromossomo
- Adenovirus: Extracromossomico
- AAV (Vírus Associado a Adenovírus): Ambas
Retrovirais
- Alta taxa de Transdução, ampla espectro de hospedeiro 
- Somente células em divisão
- Sistema bem conhecido
- Vantagem: Integração Estável no Genoma
- Desvantagem: Imunogênico, integração ao acaso (ativacao de proto-oncogenes), integração 
somente em células em divisão
- Requer células em divisão e existe risco de mutagênese insercional
Adenovirais
- Amplo espectro de hospedeiro 
- Células mitóticas e não mitóticas
- Altos Títulos
- Alta eficiencia de Transdução
- Genoma Viral Epissomal
- Vírus Selvagem causa doença leve
- Não envelopado
- Desvantagem: Imunogênico
- Período curto de Expressão Gênica em células em divisão
- Reversão para o tipo selvagem
- Não se integram ao hospedeiro
- Tamanho do Inserto: até 36kb
- Vírus de DNA dupla fita muito utilizado na preparação de vacinas
- Expressão transiente, reintrodução do vetor
- Provocam resposta imune
Adeno-Associados
- Amplo espectro de hospedeiro
- Nenhuma doença humana associada
- Infecta células em divisão ou paradas
- Integração dirigida é preferencial
- Desvantagem: Tem limite de empacotamento de DNA
- Integração não é sempre sítio-dirigida
- Pouca resposta imune
- Tamanho do Inserto: até 5kb
- Achados clínicos: Hemofilia B