CG, HPLC, Espectrofotometria

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CG, HPLC E TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS 
 
CALIBRAÇÃO 
 
Padronização externa Padrões preparados separados da amostra 
Padronização interna 
Adc PI (quimicamente semelhante ao analito mas com sinal analítico diferente) na 
amostra, no branco e nos padrões de calibração. 
Corrige variações no sinal analítico. 
Curva é feita com razão sinal analito/sinal PI pela [ ] 
Adição de padrão 
Fortifica a amostra (vai colocando ≠ volumes de padrão em mesmo volume de amostra). 
Vê a [ ] do analito por extrapolação da curva. 
Faz quando: 
-Não dá pra ter matriz sem o analito; 
-Muita interferência da matriz, geralmente é complexa; 
-Dificuldade de encontrar PI adequado. 
 
 
INTRODUÇÃO 
 
 
 
 
Comprimento é distância entre duas cristas 
Frequência é nº de oscilações por un de tempo 
 
Com aumento do comprimento de onda tem 
diminuição da frequência (gama é de alta 
frequência com baixo comprimento de onda). 
 
 sentido crescente da frequência 
 sentido crescente de comprimento de onda 
 
 
 
 
Transmitância P/P0: o tanto que passou de radiação após interagir com a amostra. 
Absorbância -logT: o tanto que amostra absorveu de radiação em frequência específica. 
Lei Lambert-Beer 
Relação linear entre [ ] e absorbância 
Absorbância = absortividade (a) x caminho óptico (b) x concentração (c) 
 
 
ESPECTROMETRIA DE EMISSÃO ATÔMICA 
 
Se baseia na propriedade de átomos/íons de emitirem radiação (com cp de onda nas regiões UV-Vis) quando no 
estado gasoso. Aplica energia térmica ou elétrica (e não radiação). O átomo ganha energia e vai pra estado mais 
excitado, quando decai (volta) ele emite energia, e esta vai ser quantizada. 
Sistema de atomização atomiza e excita. 
*Em uso de policromador ou espectrógrafo pode fazer análise simultânea de mais de um elemento. 
 
Atomizadores 
I. Fotometria de Chama 
II. Plasma Indutivamente Acoplado (ICP-AES): plasma é o gás parcialmente ionizado a 
muito alta temperatura. Faz análise sequencial com monocromador. 
*Análise de metais e não metais, pouco suscetível a interferência química, alto custo. 
 
 
ESPECTROMETRIA DE ABSORÇÃO ATÔMICA E MOLECULAR 
 
Espectro constituído por nº pequeno de linhas ou raias (como se fossem os picos). 
Cada linha é uma transição eletrônica. 
Dá informações quali e quanti. 
 
ABSORÇÃO MOLECULAR 
 
Tem transição eletrônica, vibracional e rotacional da molécula. 
Quem absorve a radiação são as moléculas, não os átomos. 
 
ABSORÇÃO ATÔMICA 
 
Absorção por átomos neutros, não excitados e no estado gasoso. 
Técnica quali e quanti (+ aplicação quanti), usa muito em metais. 
-V: baixo LD, custo moderado, análise em até 2 minutos. 
-D: unielementar, suscetível a interferência espectral/química, normalmente precisa dissolver amostra sólida. 
 
Atomização 
por chama 
(FAAS) 
É um atomizador contínuo (pq a amostra tá sendo continuamente atomizada). 
Não usar temperatura ↑↑, pq pode formar gradiente de íons que não conseguem absorver. 
Quanto maior o grau de ionização, menor a absorbância. 
-V: Alta reprodutibilidade e precisão 
-D: Baixa eficiência de amostragem (perde qnd aspira e átomos ficam pouco tempo no 
caminho óptico). 
Atomização 
eletrotérmica 
(ETAAS) 
Atomização é discreta ou descontínua. 
-Forno de grafite (GFAAS): vai tendo um aumento da temperatura conforme as etapas de 
secagem da amostra, pirólise (remove a matriz), atomização e limpeza. 
V: maior tempo de residência do vapor no caminho óptico, pouca amostra, pode usar 
amostra sólida, mais sensível. 
Geração de Hidretos 
(HGAAS) 
Serve só pra algumas espécies (ex: Ga, As, Se, Pb). 
Reação normalmente ocorre em meio ácido com agente redutor. 
Vapor Frio (CVAAS) 
Específica para mercúrio. 
É o único elemento que forma atômica está na forma de vapor a temperatura ambiente. 
 
 
ESPECTROMETRIA UV-Vis 
 
Técnica de absorção molecular. 
Normalmente resultado da excitação de elétrons de ligação – relaciona os picos com os tipos de ligações. 
As espécies químicas coloridas absorvem na cor complementar! 
 
*Deslocamento hipsocrômico/azul: aumento da polaridade do solvente desloca cp para baixo 
*Auxocromo: não absorve no UV, mas desloca picos para cp mais altos (deslocamento batocrômico ou vermelho). 
 
 
Aplicação 
Quali: os picos são mto largos, não dá pra identificar bem um analito. 
É útil pra detectar presença de certos grupos cromóforos. 
Quanti: muito útil, pplmente para espécies orgânicas ou inorgânicas. 
Pode formar quelatos ou complexos para detectar metais. 
Absorção em 
-Espécies orgânicas (precisa de moléculas cromóforas) 
-Espécies inorgânicas 
-Abs por transferência de carga 
Fonte 
UV: lâmpada de deutério 
Vis: lâmpada de filamento de tungstênio 
 
 
 
ESPECTROMETRIA DE ABSORÇÃO NO IV 
 
Quali e quanti, mas eminentemente quali (pplmente como técnica estrutural). 
IV médio (+ útil): absorção em nº de onda de 4000 a 400cm-1 
Radiação IV altera as vibrações entre os átomos, e esses níveis de energia são quantizados. 
O espectro é de transmitância vs cp onda em micrômetro ou cm-1. 
Espécies diatômicas homonucleares (N2, O2, Cl2) não absorvem no IR. 
 
Tipos 
I. dispersivo: tipo UV-Vis, o monocromador seleciona faixa de interesse 
II. com transformada de Fourier (FTIR): usa interferômetro, modula a radiação eletromagnética para 
que passe toda a radiação e não só uma faixa (multiplex) - sem elemento de resolução. Tem maior 
razão sinal/ruído. 
II. não dispersivo: usa filtro ou gás, mais para amostras gasosas. 
Amostras 
I. Gases: células cilíndricas, com caminho óptico de até metros. 
II. Soluções líquidas: aplicação limitada, tem poucos solventes transparentes nas regiões IV úteis 
Células para líquidos são bem mais estreitas (0,01 a 1 mm). 
III. Sólidos: pode analisar por meio de técnica de: 
*Pastilhamento (com KBr principalmente) 
*Dispersão (em óleo mineral ou hidrocarboneto) 
 
 
CROMATOGRAFIA GASOSA 
 
Analisa sólidos, líquidos ou gases (volatilizáveis e estáveis termicamente). 
Separa, id e qntifica. 
Fase estacionária sólida (adsorção, menos usada) ou líquida (partição). 
*Em fase reversa: o componente menos polar é eluído por último 
*Diminuição no volume injetado aumenta a eficiência da coluna. 
 
Injetor 
Split: divide a amostra, usa quando é mto concentrada 
Splitless: não divide, usa em amostra diluída ou análise de traços 
Gás de 
Arraste 
Hélio, argônio, nitrogênio e hidrogênio (hanh?) 
-He e H para detector de condutividade térmica 
-N ou Ar para detector captura elétrons 
-H para detecção MS 
Colunas 
Recheadas: analíticas ou preparativas, tem diâmetro maior. 
Capilares: comprimento maior. 
*Espessura do filme de 0,1 a 0,53 µm 
Forno 
Isotérmico: temperatura constante na análise 
Programação de temperatura: tem um gradiente 
 
DETECTORES 
 
Universais: geram sinal pra qlqr substância. 
Seletivos: detectam substâncias com certa propriedade fq. 
Específicos: detectam substância com certo elemento ou grupo funcional (ex: quimioluminescência). 
 
Condutividade térmica 
TCD ou DCT 
Detecta variação na condutividade térmica do gás de arraste quando passa um analito. 
É universal, não destrói amostra, He ou H de gás de arraste, impurezas críticas são 
umidade e oxigênio. 
Tem baixa detectabilidade. 
Ionização em chama 
FID 
Geração de sinal a partir da combustão da amostra. 
Não produzem resposta: gases nobres, água.... 
Bom para compostos orgânicos, quase universal, alta detectabilidade, larga faixa linear. 
É destrutivo. 
Captura de elétros 
ECD 
Fluxo contínuo de elétrons entre ânodo (tem fonte de radiação de partículas β) e cátodo. 
Quando passa algo eletrofílico, tem absorção de elétrons e varia a corrente (prop a [ ]). 
Seletivo, não destrutivo. 
Sensível a HNNO (halogênios, nitrilas, nitrocomposto e organometálico). 
Termoiônico 
TID ou NPD 
Muito similar ao detector por chama. 
Seletivo, muito sensível para N e P (importante para pesticidas/herbicidas), destrutivo. 
Fotométrico de chama 
FPD 
Único espectroscópico. Faz combustão com emissão deluz. 
Filtro seleciona radiação de interesse, especialmente as que tem S e P (fedido e fósforo). 
Seletivo e destrutivo. 
MS -- 
 
Análise qualitativa 
 
Tempo morto ou tempo zero: tempo que elui componente que não interage com fase estacionária. 
Tempo de retenção ajustado é t0 - tR 
Resolução: separação entre dois picos adjacentes. 
*Usa os tempos de retenção para análise quali. 
 
Nº de pratos teóricos 
N 
1 prato é um equilíbrio de distribuição do soluto/analito entre as duas fases. 
Quanto maior o N, mais equilíbrios e melhor a separação. 
Relação com eficiência da separação. Resolução é proporcional ao número de pratos. 
H (valor da altura de um prato) = L (comprimento da coluna) / N 
Quanto menor altura de um prato, maior eficiência, pq o N vai ser maior. 
 
Análise quantitativa 
 
Relaciona a área do pico com a concentração e quantifica com a curva 
 
 
 
 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA 
 
Na cromatografia clássica, a fase móvel se desloca por gravidade, não por alta pressão. 
Substâncias com mais afinidade para FE se movem mais lentamente e saem depois, com maior tempo de retenção. 
Amostra tem que ser solúvel na FM e pode ser sólida ou líquida, iônica ou covalente, de alta ou baixa MM. 
*Comum fazer desgasificação da FM, pq interfere no desempenho (ultrassom, borbulhar He ou N). 
 
 
 
Modos de 
Operação 
Isocrática: com composição do eluente cte (pode ser mistura de solventes) 
Gradiente: útil para quando tem forte afinidade da amostra com FE 
Colunas 
*De saturação ou pré coluna: entre bomba e injetor 
Usava antigamente pra saturar a FM com a FE, pra que não arrastasse a FE na coluna. 
*De guarda ou proteção: depois do injetor, 2-5cm 
Tem mesmo diâmetro e FE que a coluna de separação 
Funciona como um filtro de impurezas, aumentando a durabilidade e desempenho da 
próxima coluna. 
*De separação ou analítica: diâmetro 2-4,6 mm, cp 5-25 cm (bem inferior a CG). 
Podem ser preparativas, só separam amostra pra estudo posterior, tem maior diâmetro. 
Fases estacionárias 
Sólida: adsorção, partículas normalmente de 5µm 
Líquida: partição, pode ser depositada no suporte sólido ou ligada quimicamente 
Tipos 
*Fase normal: FE normalmente é sílica 
Se FE líquida, tem grupo polar (CN, diol, NH2) ligado na silica. 
FE é + polar e FM + apolar (se quer tirar os muito retidos, ↑ polaridade do solvente) 
Mais indicada para separar espécies polares - ficam mais retidas. 
As substâncias apolares saem primeiro. 
*Fase reversa: é a maioria, é o contrário da normal. 
FE é + apolar (normalmente sílica + C18, cadeias carbônicas ligadas) 
FM + polar (solventes: água, metanol, acetonitrila). 
Polares saem primeiro (se quer tirar os muito retidos, ↓ polaridade do solvente). 
 
DETECTORES 
 
Índice de refração 
Vê a diferença do índice de refração do eluente e dos componentes amostra. 
É universal mas tem baixa detectabilidade (µg), não pode usar gradiente de eluição (precisa 
reequilibrar detector sempre que troca FM, pq muda o índice de refração). 
Em mistura muito complexa pode coincidir índice de refração com o eluente e não detectar. 
UV-Vis 
Mais usado, pode usar gradiente, não é afetado por mudança pqn de fluxo e temperatura. 
Configuração dos detectores: 
-Cp de onda fixo (filtro); 
-Cp de onda variável (monocromador); 
-DAD u PDA: amostra recebe radiação, chega em seletor que a "espalha" até o arranjo de 
diodos. Cada diodo pega uma faixa estreita de cp de onda, então vai varrer uma região de 
interesse bem maior. Boa detectabilidade (ng). 
Fluorescência 
Seletivos (espécie química tem que fluorescer) e de muito boa detectabilidade (pg). 
Pode ser de cp de onda fixo (filtro) ou variável (monocromador). 
Eletroquímico Transformação redox 
MS -- 
 
 
ESPECTROMETRIA DE MASSAS 
 
Gera íons gasosos a partir de átomos ou moléculas por meio de ionização 
Separa íons por razão massa/carga (m/z), detecta quali e quanti. 
O espectro é de abundância iônica por m/z (é só uma linha). 
Não envolve região específica do espectro eletromagnética, não é técnica espectroscópica! 
 
ATÔMICA 
 
A fonte de ionização antes atomiza o material (normalmente gera íons positivos com carga unitária). 
Tem alto custo, bons LDs, analise rápida e multielementar. 
 
Interferências 
Espectroscópicas: quando espécie iônica tem mesma m/z que íon do analito 
Não espectroscópicas: efeito matriz, atrapalha o sinal do analito 
Sistemas de introdução 
de amostras 
HPLC, injeção fluxo, CG, vaporização eletrotérmica (não é o atomizador nesse caso)... 
Ablação por laser (laser incide na amostra e vaporiza material [normalmente sólido, útil 
em amostras dificeis de decompor ou dissolver, vidro, pedras preciosas...]). 
Analisador 
(Ex: quadrupolo) 
Quatro barras metálicas com dispositivo eletromagnético associado. 
Os íons não ressonantes tocam nas barras e não chegam no detector, só os ressonantes. 
Faz varredura alterando corrente contínua/alternada e radiofrequência pra deixar passar 
certos íons (direto para detector). 
*Separação eficiente: altura do vale entre dois picos não é maior que normalmente 10% 
da altura do pico. 
-Mais barato, simples, pequeno, faz varredura rápida (scan), bom para análise quanti. 
-Baixa resolução (é a capacidade de diferenciar massas). 
ICP-MS 
Introdução pode ser feita por nebulizador 
Tocha de plasma de argônio é atomizador e ionizador, analisador é quadrupolo. 
Tem vários detectores (copo faraday, multiplicadora de elétrons, MCP...) 
 *Comparado com ICP-AES (ou ICP-OES) é mais simples e fácil de interpretar. 
 
 
 
MOLECULAR 
 
Fonte só ioniza material. Normalmente interfaceado com CG e HPLC. 
 
Fontes de ionização em fase gasosa 
 
Gera íons em fase gasosa a partir de moléculas sól/líq/gasosa. Podem ser no vácuo ou a pressão atmosférica. 
Amostra é vaporizada e depois ionizada. 
Impacto de elétrons ou 
ionização por elétrons 
EI 
Vapor é bombardeado por feixe de elétrons energéticos, formando fragmentos iônicos. 
Gera espectro de íon fragmento (por vezes chamada de fonte dura, gera muitos 
fragmentos - úteis pra descobrir estrutura da molécula). 
Usa em moléculas de média e baixa polaridade e baixo PM (até 500), voláteis e 
termoestáveis. Boa pra acoplar CG. 
*Íon base ou pico base: é o mais estável e abundante. O instrumento entende 
que abundância desse fragmento é 100% e aí relativiza os outros. 
*Pico do íon molecular: fragmento iônico com massa correspondente a MM do analito. 
A partir dele que determina a massa da molécula. Pode ser = o íon base. 
D: íon molecular pode ser difícil de id, muita fragmentação pode dificultar interpretação. 
Ionização química 
CI 
Bombardeia gás reagente (metano, propano, isobutano, amônia...) com elétrons, forma 
espécies protonadas que colidem com analito e geram espécie iônica. 
Técnica de ionização branda (pouca ou nenhuma fragmentação, fonte mole). 
Mesma aplicação que EI, é útil pra detectar o íon molecular (por ter pouco fragmento). 
 
 
 
Fontes de ionização do tipo dessorção 
 
Consegue trabalhar com não voláteis e/ou termicamente instáveis 
Amostras sólidas ou líquidas são diretamente convertidas em íons gasosos 
 
Ionização por elétron 
spray - ESI 
*Amostra líquida passa em capilar, começa a evaporar solvente e aumentar densidade de 
carga. As gotículas vão ficando menores, e quando chega no limite de Rayleigh, a tensão 
superficial não suporta mais a carga e ocorre a explosão Coulombica - gera goticulas 
menores ainda (pode repetir esse processo até que evapore todo o solvente), que 
resultam em molécula do analito (fragmentos iônicos) com carga (múltipla ou unitária). 
V: amostras não voláteis e polares, ionização branda (fonte mole) a pressão atm, pode 
acoplar a HPLC e EC. O espectro fica bem "limpo". 
D: não é ideal para não carregados, não básicos e de baixa polaridade, como esteróides. 
Dessorção-ionização 
por laser assistida por 
matriz - MALDI 
*Mistura amostra e matriz, evapora solvente e fica solução solido-solido depositada na 
sonda. Irradiacom laser, a matriz absorve essa radiação e evapora rapidamente, liberando 
a molécula ionizada para a fase gasosa e depois para o analisador de massas. 
V: Ionização branda, pode usar espécies sólidas, analisa polímeros e 
macromoléculas polares e não polares (bem útil para ptns). 
D: Incompatível com HPLC-MS. Usar com analisadores compatíveis com métodos 
pulsados (TOF, FT-ICR). 
 
 
 
Analisadores 
 
Quadrupolo 
Baixa resolução (resolução unitária, separa unidade de massa atômica), não pode usar para 
técnicas de ionização pulsada (MALDI), baixo limite de massa. 
Bom para analise quanti, pode acoplar entre si e com outros analisadores. 
Íon trap 
IT 
Ânions e cátions gasosos podem ser formados e aprisionados por longos períodos por meio de 
campo elétrico e magnético (são 3 "discos", no central o íon fica aprisionado). 
Baixa resolução (resolução unitária, varredura lenta consegue melhorar resolução). 
Pode fazer MS sequencial no tempo (aprisiona e fragmenta esse íon), alta sensibilidade. 
O 2D ou linear é similar ao quadrupolo (visualmente), mais sensível que o 3D e consegue 
armazenar mais. 
Tempo de voo 
TOF 
Íons da fonte de ionização são acelerados por campo elétrico. Essas partículas passam por tubo 
de deriva com ± 1m. 
Velocidade no tubo é inversamente relacionadas com massa -as mais leves chegam antes. 
É um analisador pulsado, intervalo de massas praticamente ilimitado, alta sensibilidade. 
*Linear: baixa resolução, abaixo de 1000 
*Refletor: alta resolução, sistema de reflexão que corrige imperfeiçoes do linear - os íons vão 
chegar no tubo de deriva no mesmo momento. 
 
 
ESPECTROMETRIA DE MASSA EM TANDEM OU SEQUENCIAL 
 
Usa dois estágios de MS - um isola o íon de interesse, o outro estabelece relação entre esse íon com os outros 
gerados a partir da sua decomposição. 
Tem um espectro de massa de um espectro de massa, pode fragmentar mais. 
 
Sequenciais no 
espaço 
MS/MS 
2 analisadores independentes usados em regiões diferentes do espaço (triplo quadrupolo). 
Em triplo quadrupolo, um dos quadrupolos atua como cela de colisão 
Induz fragmentação inserindo gás de colisão (argônio) que vai decompor íon precursor 
em íon produto. Controla colisão alterando energia de colisão (velocidade dos íons) e nº 
de colisões (pela pressão do gás). 
Qnt maior energia de colisão, maior a fragmentação. 
Sequenciais no 
tempo MSn 
Forma os íons em certa região espacial, expele os que não que não quer e deixa os íons 
selecionados pra analisar a massa na mesma região (íon trap). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Forma mais fácil de se regular uma interação é alterando a fase móvel (NÃO é válido pra CG, já que o gás de 
arraste serve unicamente como força mecânica) 
 Fase normal: fase estacionária é + polar que fase móvel. 
 Fase reversa: fase estacionária é + apolar que fase móvel. Elui com solventes polares.