Aula 04 - Transporte núcleo-citoplasma
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Aula 04 - Transporte núcleo-citoplasma

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do ambiente nuclear, defi nindo, assim, a primeira seqüência de

exclusão nuclear (NES - nuclear exclusion sequence). Ainda continuam

sendo assunto de investigação se a seqüência de exclusão também

está presente em outras proteínas e o significado biológico dessa

descoberta.

Você também já deve estar curioso para saber como, com aquela

morfologia do complexo do poro, as proteínas entram no núcleo. Esta

também é uma dúvida dos biologistas celulares: será que as proteínas

passavam mesmo pelos complexos do poro? Só por eles? Passavam com

a conformação nativa ou eram desenoveladas? Se não desenovelam,

os poros dilatam? Esse transporte gasta energia? Precisa de proteínas

auxiliares? Calma! Uma pergunta de cada vez! Vamos lá!

As proteínas nucleares passam pelos complexos do poro?

A passagem de proteínas só ocorre através dos complexos do

poro. Isso foi demonstrado acoplando a nucleoplasmina com partículas

de ouro coloidal e observando essas células ao microscópio eletrônico

de transmissão (Figura 4.8).

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Esses experimentos responderam ainda a outras perguntas:

o acoplamento com ouro coloidal impede que as proteínas mudem de

conformação; assim, fi cou demonstrado que as proteínas atravessam

o complexo do poro em sua conformação nativa. Aliás, se você estava

imaginando como uma proteína maior do que o diâmetro do poro

pode atravessá-lo, repare (Figura 4.8.a) que, no acoplamento com

ouro coloidal, várias proteínas se associam a uma mesma partícula

(o tamanho da partícula de ouro usada no experimento era

de 10nm). Portanto, várias proteínas e mais uma partícula de

10nm passam ao mesmo tempo pelo poro!

E a saída do mRNA?

Para estudar o transporte de mRNA, foram realizados experimentos

equivalentes aos realizados com proteínas nucleares, já esquematizados na

Figura 4.8. Partículas de ouro coloidal foram acopladas a moléculas de

mRNA e microinjetadas no núcleo de uma célula. Depois de alguns minutos

de incubação a 37oC, a preparação foi fi xada, processada, e observada em

microscópio eletrônico de transmissão. O resultado é que as moléculas de

mRNA saem do núcleo exclusivamente através de complexos do poro.

Figura 4.8: Em a, o experimento

realizado para determinar por onde

passam as proteínas que entram

no núcleo; em b, o resultado em microsco-

pia eletrônica de transmissão (Met),

onde podemos ver que os com-

plexos proteína-ouro coloidal

passam apenas pelos complexos

do poro, delimitados por colchetes.

Note a mitocôndria (M) indi-

cando de modo inconfundível o

lado citoplasmático. A foto b é de

Feldherr et al. J Cell Biol, 99: 216, 1984.

Ouro coloidal

Microinjeção

Incubação a 37º

met

Citoplasma

Caudas de
nucleoplasmina

(a) (b)

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Entrou por uma porta, saiu pela outra?

Será que existem complexos do poro só para a entrada de

proteínas e outros só para saída de mRNA? Essa pergunta só pôde

ser respondida quando proteínas e mRNA foram acoplados a

partículas de ouro de tamanhos diferentes, às proteínas com ouro de

10nm e aos mRNA com ouro de 20nm. Os complexos proteína-ouro

foram injetados no citoplasma, enquanto os complexos

mRNA-ouro foram injetados no núcleo da mesma célula, que depois

de processada foi observada ao microscópio. Advinha o resultado?

Foram observadas partículas de 10nm entrando e partículas de

20nm saindo pelos mesmos poros! Assim foi demonstrado que os

complexos do poro são competentes tanto para transportar proteína

do citoplasma para o núcleo quanto mRNA do núcleo para o citoplasma,

isto é, na direção oposta.

Agora nós tocamos num ponto chave quando se trata do

transporte entre núcleo e citoplasma: direção. A direção exclusiva é

uma das principais características desse transporte: as moléculas de

mRNA só saem do núcleo, enquanto as proteínas que têm a seqüência

de localização nuclear só entram (por isso você vai encontrar em alguns

textos que o transporte entre núcleo e citoplasma é vetorial, isto é, tem

direção e sentido). Se você pensou na biogênese dos ribossomos, em que

proteínas são sintetizadas no citoplasma, entram no núcleo e depois

saem para o citoplasma, lembre que antes de retornar ao núcleo elas

se associaram a moléculas de RNA, formando ribonucleoproteínas,

que têm características de transporte especiais.

O transporte entre núcleo e citoplasma consome energia?

Para responder a essa pergunta, foi feito um experimento

muito semelhante ao descrito na Figura 4.7, mas em vez de incubar

a preparação a 37oC, a incubação foi feita a 4oC. Nessa situação, a

nucleoplasmina não entrava no núcleo, ou entrava tão devagar que

tornava o experimento difícil de observar. O passo seguinte foi fazer a

microinjeção de nucleoplasmina em células que tinham sido depletadas

de ATP (Figura 4.9). O resultado foi a retenção da proteína no envoltório

nuclear. Esse experimento levou à idéia de que o transporte entre

núcleo e citoplasma tem duas etapas: reconhecimento, independente

DEPLETAR

Diminuir,
extinguir, no caso,

o estoque celular
de ATP.

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Incubação na ausência de ATP

(Observação por fl uorescência)

Nucleoplasmina

Microinjeção

Acumulação ao

redor do núcleo

A etapa de reconhecimento das proteínas que serão transportadas

para o núcleo certamente envolve receptores que reconhecem as

seqüências de localização nuclear. A identidade exata dos receptores

ainda não foi determinada, mas há indícios de que eles estejam localizados

nas fi brilas que se projetam do anel citoplasmático do complexo do poro

(Figura 4.6). Depois do reconhecimento, a acomodação da proteína na

abertura do canal inicia a etapa de translocação.

Não era bem assim

Recentemente, novos experimentos mostraram que o

nucleotídeo envolvido no transporte do núcleo para o citoplasma não

é o ATP diretamente, e sim o GTP. A entrada de proteínas no núcleo,

e também a saída de RNA, dependem da associação dessas moléculas

com co-fatores que ligam e hidrolisam GTP. Como a recomposição

do estoque citoplasmático de GTP depende da produção de ATP

(e transferência do fosfato do ATP para GDP na mitocôndria,

relembre na Aula 27 de Biologia Celular I), o bloqueio do transporte

na ausência de ATP fi ca explicado.

de ATP, e translocação, dependente de ATP. Curiosamente,

a depleção de ATP não bloqueou a saída RNA do núcleo

para o citoplasma, o que só foi compreendido anos depois

(se os pesquisadores esperaram anos, você pode esperar

um pouquinho, né?).

Figura 4.9: O transporte de proteína do núcleo para o citoplasma não ocorre na

ausência de ATP. A proteína se associa ao envoltório, mas não é translocada.

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Figura 4.10: O ciclo de Ran

entre o citoplasma e o núcleo.

Mais personagens: vou entrar, você se importina?

Outra descoberta recente é que as seqüências de localização

nuclear, no citoplasma, e de exclusão nuclear, no núcleo, não são

reconhecidas diretamente pelos componentes do complexo do poro e

sim por receptores de transporte. O complexo formado pelas proteínas

a serem transportadas (carga) mais os receptores de transporte

é que é reconhecido no poro e transportado. Os receptores de

transporte são proteínas chamadas, coletivamente, carioferinas ou

importinas (reconhecem as NLS no citoplasma e são importadas)

e exportinas (reconhecem as NES no núcleo e são exportadas).

Veja na Figura 4.11 como Ran e importina funcionam em conjunto.

O bichinho do Ran-ran

Ran, a GTPase envolvida no transporte entre núcleo e citoplasma,

pertence à mesma família de GTPases monoméricas cujo representante

mais famoso é Ras, que atua na sinalização celular (Aula 14 de Biologia

Celular I), e que também abriga as Rab, que trabalham no controle