Aula 04 - Transporte núcleo-citoplasma
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do ambiente nuclear, de\ufb01 nindo, assim, a primeira seqüência de exclusão nuclear (NES - nuclear exclusion sequence). Ainda continuam sendo assunto de investigação se a seqüência de exclusão também está presente em outras proteínas e o significado biológico dessa descoberta. Você também já deve estar curioso para saber como, com aquela morfologia do complexo do poro, as proteínas entram no núcleo. Esta também é uma dúvida dos biologistas celulares: será que as proteínas passavam mesmo pelos complexos do poro? Só por eles? Passavam com a conformação nativa ou eram desenoveladas? Se não desenovelam, os poros dilatam? Esse transporte gasta energia? Precisa de proteínas auxiliares? Calma! Uma pergunta de cada vez! Vamos lá! As proteínas nucleares passam pelos complexos do poro? A passagem de proteínas só ocorre através dos complexos do poro. Isso foi demonstrado acoplando a nucleoplasmina com partículas de ouro coloidal e observando essas células ao microscópio eletrônico de transmissão (Figura 4.8). Camila Highlight Camila Highlight BIOLOGIA CELULAR II | Transporte núcleo-citoplasma CEDERJ68 Esses experimentos responderam ainda a outras perguntas: o acoplamento com ouro coloidal impede que as proteínas mudem de conformação; assim, \ufb01 cou demonstrado que as proteínas atravessam o complexo do poro em sua conformação nativa. Aliás, se você estava imaginando como uma proteína maior do que o diâmetro do poro pode atravessá-lo, repare (Figura 4.8.a) que, no acoplamento com ouro coloidal, várias proteínas se associam a uma mesma partícula (o tamanho da partícula de ouro usada no experimento era de 10nm). Portanto, várias proteínas e mais uma partícula de 10nm passam ao mesmo tempo pelo poro! E a saída do mRNA? Para estudar o transporte de mRNA, foram realizados experimentos equivalentes aos realizados com proteínas nucleares, já esquematizados na Figura 4.8. Partículas de ouro coloidal foram acopladas a moléculas de mRNA e microinjetadas no núcleo de uma célula. Depois de alguns minutos de incubação a 37oC, a preparação foi \ufb01 xada, processada, e observada em microscópio eletrônico de transmissão. O resultado é que as moléculas de mRNA saem do núcleo exclusivamente através de complexos do poro. Figura 4.8: Em a, o experimento realizado para determinar por onde passam as proteínas que entram no núcleo; em b, o resultado em microsco- pia eletrônica de transmissão (Met), onde podemos ver que os com- plexos proteína-ouro coloidal passam apenas pelos complexos do poro, delimitados por colchetes. Note a mitocôndria (M) indi- cando de modo inconfundível o lado citoplasmático. A foto b é de Feldherr et al. J Cell Biol, 99: 216, 1984. Ouro coloidal Microinjeção Incubação a 37º met Citoplasma Caudas de nucleoplasmina (a) (b) Camila Highlight Camila Highlight CEDERJ 69 A U LA 4 M Ó D U LO 1 Entrou por uma porta, saiu pela outra? Será que existem complexos do poro só para a entrada de proteínas e outros só para saída de mRNA? Essa pergunta só pôde ser respondida quando proteínas e mRNA foram acoplados a partículas de ouro de tamanhos diferentes, às proteínas com ouro de 10nm e aos mRNA com ouro de 20nm. Os complexos proteína-ouro foram injetados no citoplasma, enquanto os complexos mRNA-ouro foram injetados no núcleo da mesma célula, que depois de processada foi observada ao microscópio. Advinha o resultado? Foram observadas partículas de 10nm entrando e partículas de 20nm saindo pelos mesmos poros! Assim foi demonstrado que os complexos do poro são competentes tanto para transportar proteína do citoplasma para o núcleo quanto mRNA do núcleo para o citoplasma, isto é, na direção oposta. Agora nós tocamos num ponto chave quando se trata do transporte entre núcleo e citoplasma: direção. A direção exclusiva é uma das principais características desse transporte: as moléculas de mRNA só saem do núcleo, enquanto as proteínas que têm a seqüência de localização nuclear só entram (por isso você vai encontrar em alguns textos que o transporte entre núcleo e citoplasma é vetorial, isto é, tem direção e sentido). Se você pensou na biogênese dos ribossomos, em que proteínas são sintetizadas no citoplasma, entram no núcleo e depois saem para o citoplasma, lembre que antes de retornar ao núcleo elas se associaram a moléculas de RNA, formando ribonucleoproteínas, que têm características de transporte especiais. O transporte entre núcleo e citoplasma consome energia? Para responder a essa pergunta, foi feito um experimento muito semelhante ao descrito na Figura 4.7, mas em vez de incubar a preparação a 37oC, a incubação foi feita a 4oC. Nessa situação, a nucleoplasmina não entrava no núcleo, ou entrava tão devagar que tornava o experimento difícil de observar. O passo seguinte foi fazer a microinjeção de nucleoplasmina em células que tinham sido depletadas de ATP (Figura 4.9). O resultado foi a retenção da proteína no envoltório nuclear. Esse experimento levou à idéia de que o transporte entre núcleo e citoplasma tem duas etapas: reconhecimento, independente DEPLETAR Diminuir, extinguir, no caso, o estoque celular de ATP. Camila Highlight Camila Highlight BIOLOGIA CELULAR II | Transporte núcleo-citoplasma CEDERJ70 Incubação na ausência de ATP (Observação por \ufb02 uorescência) Nucleoplasmina Microinjeção Acumulação ao redor do núcleo A etapa de reconhecimento das proteínas que serão transportadas para o núcleo certamente envolve receptores que reconhecem as seqüências de localização nuclear. A identidade exata dos receptores ainda não foi determinada, mas há indícios de que eles estejam localizados nas \ufb01 brilas que se projetam do anel citoplasmático do complexo do poro (Figura 4.6). Depois do reconhecimento, a acomodação da proteína na abertura do canal inicia a etapa de translocação. Não era bem assim Recentemente, novos experimentos mostraram que o nucleotídeo envolvido no transporte do núcleo para o citoplasma não é o ATP diretamente, e sim o GTP. A entrada de proteínas no núcleo, e também a saída de RNA, dependem da associação dessas moléculas com co-fatores que ligam e hidrolisam GTP. Como a recomposição do estoque citoplasmático de GTP depende da produção de ATP (e transferência do fosfato do ATP para GDP na mitocôndria, relembre na Aula 27 de Biologia Celular I), o bloqueio do transporte na ausência de ATP \ufb01 ca explicado. de ATP, e translocação, dependente de ATP. Curiosamente, a depleção de ATP não bloqueou a saída RNA do núcleo para o citoplasma, o que só foi compreendido anos depois (se os pesquisadores esperaram anos, você pode esperar um pouquinho, né?). Figura 4.9: O transporte de proteína do núcleo para o citoplasma não ocorre na ausência de ATP. A proteína se associa ao envoltório, mas não é translocada. CEDERJ 71 A U LA 4 M Ó D U LO 1 Figura 4.10: O ciclo de Ran entre o citoplasma e o núcleo. Mais personagens: vou entrar, você se importina? Outra descoberta recente é que as seqüências de localização nuclear, no citoplasma, e de exclusão nuclear, no núcleo, não são reconhecidas diretamente pelos componentes do complexo do poro e sim por receptores de transporte. O complexo formado pelas proteínas a serem transportadas (carga) mais os receptores de transporte é que é reconhecido no poro e transportado. Os receptores de transporte são proteínas chamadas, coletivamente, carioferinas ou importinas (reconhecem as NLS no citoplasma e são importadas) e exportinas (reconhecem as NES no núcleo e são exportadas). Veja na Figura 4.11 como Ran e importina funcionam em conjunto. O bichinho do Ran-ran Ran, a GTPase envolvida no transporte entre núcleo e citoplasma, pertence à mesma família de GTPases monoméricas cujo representante mais famoso é Ras, que atua na sinalização celular (Aula 14 de Biologia Celular I), e que também abriga as Rab, que trabalham no controle