biotec 02.05.11

Biotecnologia da reprodução animal
		02/05/2011
PIVE ou FIVE
Produção in vitro de embriões 
Quando um animal chega a uma certa idade, já começa a não conseguir gestar, levar toda uma gestação fica mais difícil. Então vc pode usar a PIVE pra esses animais, só coletar os oocitos dela que funciona. Vc consegue produzir mais animais na FIV.
Uma vaca consegue produzir 1 bezerro por semana com essa técnica. 
Vc pode usar também em vacas que eram muito boas, mas que teve uma infertilidade adquirida, vc pode usar a FIV, impede o descarte precoce da fêmea. 
Teve inicio em 1800, só que começou a ser utilizada em ampla escala em 1990. Em 1969 começou a fazer fertilização em humanos. 
Quando houve introdução da FIV até hoje, houve um crescimento super acelerado, quando comparado com as outras (TE). Hoje quem está no ano trabalha mais com a FIV do que com a TE. A TE é mais utilizado por pequenos produtores que estão começando.
O Brasil é um país de referencia na técnica de FIV
Aplicações da FIV
Maior obtenção de descendentes, produz 1 bezerro por semana ao invés de 1 por ano
Aproveitamento de fêmeas com infertilidade adquirida
Animais mortos ou finais da vida reprodutiva
Geração de grande número de embriões para pesquisas. Geralmente quando utiliza embriões para pesquisas vc utiliza os ovários de matadouros, e depois vc descarta esses embriões
Diminui intervalos de embriões, de gerações 
Aumenta a pressão de seleção 
Produtos obtidos de vacas que não respondem à superovulação. 
Vantagens da FIV
- 1 gestação por vaca por semana
- Diminui intervalos entre gerações
- Manutenção de rebanhos mestiços com grau de sangue desejado. Hj em dia se procura muito o girolando, que é bem acostumado na nossa região, antigamente não era considerada uma raça, era considerado mestiço, mas pela quantidade grande de procura virou uma raça. Pra vc fazer o girolando ou vc cruza uma vaca gir ou holandês e um touro gir ou holandês. Na FIV vc consegue pegar o oócito do animal de uma raça com o de outra raça. 
 - obtenção de respostas de controle endócrino, metabólico e molecular do desenvolvimento embrionário inicial. 
A FIV veio a auxiliar muito no estudo da embriologia, porque antes vc fazia todo o desenvolvimento dentro da vaca (ultrassom, etc.), as vezes vc tinha que matar o animal pra ver como era o desenvolvimento, etc. com a FIV não, como vc faz todo o desenvolvimento embrionário na placa de petri vc consegue ver todos os estágios.
Dificuldades
- O laboratório de FIV é muito mais complexo do que um laboratório de TE. O laboratório e equipamentos são específicos 
- Maior risco de alteração durante a gestação. Pq tudo que agente faz no laboratório, agente tenta reproduzir mais similar com o que ocorre dentro da vaca, de acordo com a fisiologia, então todos os meios que agente usa pra fazer o desenvolvimento do oócito são pra ficar parecidos com a da fisiologia da fêmea. Usa-se hormônios, um dos problemas é o desenvolvimento excessivo do bezerro, o que dificultava muito o parto da vaca, e ele ficava muito grande, é o chamado síndrome do bezerro grande.
Outra alteração que pode ocorrer: cordão umbilical grande, hérnia umbilical, mas isso não prejudica em nada.
- Baixa eficiência de congelamento: os embriões de FIV não suportam tão bem o congelamento como os embriões de TE. Vc não tem uma resposta muito boa do congelamento desses embriões 
- Síndrome do bezerro grande.
FIV é composta por varias etapas:
Começa pela captura dos oócitos, pra vc começar a fazer a FIV. Vc pode adquirir esses oócitos através da punção ovariana e aspira esses folículos ou ovários de matadouros (aspira com uma seringa normal)
Vc passa pra fase de busca e seleção de oócitos na placa de petri
(na FIV usamos mais grau I e II)
Depois vc faz a maturação desses oócitos no laboratório
Vc tem que maturar o oócito e também o SPTZ, que quando sai no ejaculado do touro também precisa ser maturado.
Depois agente faz a fecundação, que é a FIV propriamente dita.
A partir do momento que o oocito se uniu ao sptz, vai formar o embrião, e agora vc vai fazer o cultivo embrionário. Formação de 2 células, 4, 8, 16, a partir do momento que adquire 16 ou mais, é mórula, as células da mórula se compactam, vira mórula compacta, depois células vão se diferenciar, as células que vão formar a placenta é o trofloblasto, e no meio temos o liquido que vai ser a cavidade blastocélia. Quando começa a diferenciação celular começa a etapa de blastocisto.
Temos o blastocisto inicial, blastocisto, blastocisto expandido, depois vamos ter todo o material indo pra fora ....
Na TE vamos tirar o embrião pelo menos na fase de mórula.
A segunda etapa da FIV é a maturação.
Depois ocorre a fecundação 
1º vc tem os oocitos. Vc vai puncionar esses oocitos seja pela punção folicular seja pelo ovário do matadouro. 
Depois vc vai fazer a maturação desses oocitos
Depois vc vai fazer a fecundação 
É o D0 (dia da fecundação)
No D2, vc começa a fazer a avaliação da clivagem (48h após a fecundação)
Fazer a clivagem: quando começa a desenvolver o embrião 
D5 vc tem a formação da mórula
Ai vc vai avaliar, se tem ou não a mórula ali. se não tem o embrião parou de se desenvolver e morreu, se tiver lá vc deixa ele na estufa pra continuar a evolução.
D7
Avaliação do blastocisto expandido 
D9
Avaliação do blastocisto eclodido
Na verdade, na pratica é feito diariamente a avaliação. 
A partir do momento que vc faz a fecundação (D2) começa o cultivo embrionário, que dura em torno de 9 dias. 
Obtenção de oócitos
Quando vem de matadouro:
	Leva uma garrafa térmica, com soro fisiológico, antibióticos e aquecido a 35ºC.
(no dia que matou a vaca ele dá o ovário)
	Fechou a garrafa térmica, vc leva ao laboratório, esses oócitos ficam viáveis até 4 horas no ovário. 
	Chegou no laboratório, antes de vc aspirar os folículos vc vai lavar os ovários um a um. Aquece a solução fisiológica, lava, e coloca num Becker com um liquido, que fica em banho Maria para manter o liquido sempre aquecido. 
	Vc pega o ovário, um por um, seca ele. Vai com uma seringa, dentro do ovário vc vai ver vários pontinhos que são os folículos. Quando vc aspira, o que vai parar na seringa é o oócito e líquido folicular. Vc vai aspirar folículos de 2 a 8 mm. Vc aspira esses folículos, coloca dentro da seringa, uma vez que terminou de aspirar todo o ovário vc descarta o ovário e vai colocar esses oócitos num meio de manutenção, geralmente é um meio Talp, que têm nutrientes e hormônios (glicose, heparina, etc.) pra manter o oócito viável.
Uma vez que vc colocou esses oócitos no meio de manutenção vc vai classificar esses oócitos.
Outra forma de adquirir os oocitos é pela aspiração folicular mediada por sonda de punção e ultrasom. (Ovum pick up) OPU
Coloca a vaca no tronco, faz anestesia epidural, vai esperar o animal ficar anestesiado. Quando o rabo estiver mole é porque ele está anestesiado. Vc vai limpar vulva, reto, passar sabão, amarrar o rabo pra não contaminar, depois vc vai introduzir o aparelho de ultrassom no animal. O tubo que vc vai usar, também tem que usar um meio de manutenção pra esses oócitos. Vc aspira os oócitos de 2 – 8 mm. 
Cuidado com a aspiração pra não causar danos ao folículo.
Busca, classificação e seleção dos oócitos 
Tempo de espera entre a aspiração e a avaliação 
- 20 minutos após a aspiração 
- avaliar os CCO 
- lupa (4x)
Vc faz a lavagem, depois a observação com a lupa
Qualidade dos oócitos
Pra FIV vc vai utilizar oócitos que apresentem grumos com 3 ou mais camadas de células, quanto mais camadas, mais imaturo ele é. 
	Depois que agente seleciona esses oócitos agente passa pra etapa de maturação. Nosso objetivo é tornar o oócito apto pra ser fecundado pelo SPTZ. 
Maturação oocitária
	- nuclear
	- citoplasmática 
	- molecular
Vc tem que ter maturação do núcleo, do citoplasma e das moléculas desse oocito, vão ocorrer mais ou menos ao mesmo tempo
Maturação in vivo
- Folículo dominante: aumenta quantidade de lipídeos, diminuição do tamanho do complexo de golgi e reorganização dos grânulos da cortical. 
Folículo