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biotec 02.05.11

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Biotecnologia da reprodução animal
		02/05/2011
PIVE ou FIVE
Produção in vitro de embriões 
Quando um animal chega a uma certa idade, já começa a não conseguir gestar, levar toda uma gestação fica mais difícil. Então vc pode usar a PIVE pra esses animais, só coletar os oocitos dela que funciona. Vc consegue produzir mais animais na FIV.
Uma vaca consegue produzir 1 bezerro por semana com essa técnica. 
Vc pode usar também em vacas que eram muito boas, mas que teve uma infertilidade adquirida, vc pode usar a FIV, impede o descarte precoce da fêmea. 
Teve inicio em 1800, só que começou a ser utilizada em ampla escala em 1990. Em 1969 começou a fazer fertilização em humanos. 
Quando houve introdução da FIV até hoje, houve um crescimento super acelerado, quando comparado com as outras (TE). Hoje quem está no ano trabalha mais com a FIV do que com a TE. A TE é mais utilizado por pequenos produtores que estão começando.
O Brasil é um país de referencia na técnica de FIV
Aplicações da FIV
Maior obtenção de descendentes, produz 1 bezerro por semana ao invés de 1 por ano
Aproveitamento de fêmeas com infertilidade adquirida
Animais mortos ou finais da vida reprodutiva
Geração de grande número de embriões para pesquisas. Geralmente quando utiliza embriões para pesquisas vc utiliza os ovários de matadouros, e depois vc descarta esses embriões
Diminui intervalos de embriões, de gerações 
Aumenta a pressão de seleção 
Produtos obtidos de vacas que não respondem à superovulação. 
Vantagens da FIV
- 1 gestação por vaca por semana
- Diminui intervalos entre gerações
- Manutenção de rebanhos mestiços com grau de sangue desejado. Hj em dia se procura muito o girolando, que é bem acostumado na nossa região, antigamente não era considerada uma raça, era considerado mestiço, mas pela quantidade grande de procura virou uma raça. Pra vc fazer o girolando ou vc cruza uma vaca gir ou holandês e um touro gir ou holandês. Na FIV vc consegue pegar o oócito do animal de uma raça com o de outra raça. 
 - obtenção de respostas de controle endócrino, metabólico e molecular do desenvolvimento embrionário inicial. 
A FIV veio a auxiliar muito no estudo da embriologia, porque antes vc fazia todo o desenvolvimento dentro da vaca (ultrassom, etc.), as vezes vc tinha que matar o animal pra ver como era o desenvolvimento, etc. com a FIV não, como vc faz todo o desenvolvimento embrionário na placa de petri vc consegue ver todos os estágios.
Dificuldades
- O laboratório de FIV é muito mais complexo do que um laboratório de TE. O laboratório e equipamentos são específicos 
- Maior risco de alteração durante a gestação. Pq tudo que agente faz no laboratório, agente tenta reproduzir mais similar com o que ocorre dentro da vaca, de acordo com a fisiologia, então todos os meios que agente usa pra fazer o desenvolvimento do oócito são pra ficar parecidos com a da fisiologia da fêmea. Usa-se hormônios, um dos problemas é o desenvolvimento excessivo do bezerro, o que dificultava muito o parto da vaca, e ele ficava muito grande, é o chamado síndrome do bezerro grande.
Outra alteração que pode ocorrer: cordão umbilical grande, hérnia umbilical, mas isso não prejudica em nada.
- Baixa eficiência de congelamento: os embriões de FIV não suportam tão bem o congelamento como os embriões de TE. Vc não tem uma resposta muito boa do congelamento desses embriões 
- Síndrome do bezerro grande.
FIV é composta por varias etapas:
Começa pela captura dos oócitos, pra vc começar a fazer a FIV. Vc pode adquirir esses oócitos através da punção ovariana e aspira esses folículos ou ovários de matadouros (aspira com uma seringa normal)
Vc passa pra fase de busca e seleção de oócitos na placa de petri
(na FIV usamos mais grau I e II)
Depois vc faz a maturação desses oócitos no laboratório
Vc tem que maturar o oócito e também o SPTZ, que quando sai no ejaculado do touro também precisa ser maturado.
Depois agente faz a fecundação, que é a FIV propriamente dita.
A partir do momento que o oocito se uniu ao sptz, vai formar o embrião, e agora vc vai fazer o cultivo embrionário. Formação de 2 células, 4, 8, 16, a partir do momento que adquire 16 ou mais, é mórula, as células da mórula se compactam, vira mórula compacta, depois células vão se diferenciar, as células que vão formar a placenta é o trofloblasto, e no meio temos o liquido que vai ser a cavidade blastocélia. Quando começa a diferenciação celular começa a etapa de blastocisto.
Temos o blastocisto inicial, blastocisto, blastocisto expandido, depois vamos ter todo o material indo pra fora ....
Na TE vamos tirar o embrião pelo menos na fase de mórula.
A segunda etapa da FIV é a maturação.
Depois ocorre a fecundação 
1º vc tem os oocitos. Vc vai puncionar esses oocitos seja pela punção folicular seja pelo ovário do matadouro. 
Depois vc vai fazer a maturação desses oocitos
Depois vc vai fazer a fecundação 
É o D0 (dia da fecundação)
No D2, vc começa a fazer a avaliação da clivagem (48h após a fecundação)
Fazer a clivagem: quando começa a desenvolver o embrião 
D5 vc tem a formação da mórula
Ai vc vai avaliar, se tem ou não a mórula ali. se não tem o embrião parou de se desenvolver e morreu, se tiver lá vc deixa ele na estufa pra continuar a evolução.
D7
Avaliação do blastocisto expandido 
D9
Avaliação do blastocisto eclodido
Na verdade, na pratica é feito diariamente a avaliação. 
A partir do momento que vc faz a fecundação (D2) começa o cultivo embrionário, que dura em torno de 9 dias. 
Obtenção de oócitos
Quando vem de matadouro:
	Leva uma garrafa térmica, com soro fisiológico, antibióticos e aquecido a 35ºC.
(no dia que matou a vaca ele dá o ovário)
	Fechou a garrafa térmica, vc leva ao laboratório, esses oócitos ficam viáveis até 4 horas no ovário. 
	Chegou no laboratório, antes de vc aspirar os folículos vc vai lavar os ovários um a um. Aquece a solução fisiológica, lava, e coloca num Becker com um liquido, que fica em banho Maria para manter o liquido sempre aquecido. 
	Vc pega o ovário, um por um, seca ele. Vai com uma seringa, dentro do ovário vc vai ver vários pontinhos que são os folículos. Quando vc aspira, o que vai parar na seringa é o oócito e líquido folicular. Vc vai aspirar folículos de 2 a 8 mm. Vc aspira esses folículos, coloca dentro da seringa, uma vez que terminou de aspirar todo o ovário vc descarta o ovário e vai colocar esses oócitos num meio de manutenção, geralmente é um meio Talp, que têm nutrientes e hormônios (glicose, heparina, etc.) pra manter o oócito viável.
Uma vez que vc colocou esses oócitos no meio de manutenção vc vai classificar esses oócitos.
Outra forma de adquirir os oocitos é pela aspiração folicular mediada por sonda de punção e ultrasom. (Ovum pick up) OPU
Coloca a vaca no tronco, faz anestesia epidural, vai esperar o animal ficar anestesiado. Quando o rabo estiver mole é porque ele está anestesiado. Vc vai limpar vulva, reto, passar sabão, amarrar o rabo pra não contaminar, depois vc vai introduzir o aparelho de ultrassom no animal. O tubo que vc vai usar, também tem que usar um meio de manutenção pra esses oócitos. Vc aspira os oócitos de 2 – 8 mm. 
Cuidado com a aspiração pra não causar danos ao folículo.
Busca, classificação e seleção dos oócitos 
Tempo de espera entre a aspiração e a avaliação 
- 20 minutos após a aspiração 
- avaliar os CCO 
- lupa (4x)
Vc faz a lavagem, depois a observação com a lupa
Qualidade dos oócitos
Pra FIV vc vai utilizar oócitos que apresentem grumos com 3 ou mais camadas de células, quanto mais camadas, mais imaturo ele é. 
	Depois que agente seleciona esses oócitos agente passa pra etapa de maturação. Nosso objetivo é tornar o oócito apto pra ser fecundado pelo SPTZ. 
Maturação oocitária
	- nuclear
	- citoplasmática 
	- molecular
Vc tem que ter maturação do núcleo, do citoplasma e das moléculas desse oocito, vão ocorrer mais ou menos ao mesmo tempo
Maturação in vivo
- Folículo dominante: aumenta quantidade de lipídeos, diminuição do tamanho do complexo de golgi e reorganização dos grânulos da cortical. 
Folículocresce mais um pouco e se torna o:
- Foliculo pré ovulatorio: diminui mais o complexo de golgi, membrana nuclear ondulada, corona radiata superfície da membrana oocito, espaço perivitelínico aumenta (pré maturação ou capacitação)
- Com a onda de LH vc começa o processo de maturação final – ovulação oócito maturado. A maturação é caracterizado pela maturação citoplasmática (é de forma mais predominante nessa parte). Lipídeos em grande quantidade, que dá suprimento pra formação do gameta.
- maturação final: maturação citoplasmática 
Lipídios (suprimento pós fert)
CG
Alinhamento grânulos da cortical (bloqueio da polispermia, pra não entrar mais de um SPTZ dentro do oócito)
Meiose e rompimento membrana nuclear (da vesícula germinativa, o pronúcleo vai ser liberado e o corpúsculo polar vai migrar pra periferia e vai ser “descartada”)
 
- termino da meiose
- metáfase da meiose II. Para aqui, quando isso acontece, o oócito está maturado
- oócito maturado
= In vitro
- retirada do folículo 
- padrões in vivo
- a maturação demora em torno de 24 horas
Atraso dispersão grânulos da cortical 
In vivo: Os grânulos da cortical vão se alinhar ao redor da zona pelúcida, ai ocorre o rompimento desse núcleo ai tenho o núcleo parando na metáfase da meiose II. 
Já in vitro matura, mas não da mesma forma que in vivo.
Seleção dos oócitos
- Meio de maturação (pra fazer com que os folículos cresçam e se tornem aptos a serem fecundados)
	-TCM-199 (fonte protéica, antioxidantes, fatores de crescimento)
	-Gonadotrofinas
 Hj é padrão pra capacitação espermática, usar 10g de heparina, é uma glicosaminaglicana presente no útero.
Pode comprar meios prontos ou preparar seu próprio meio. 
Maturação 
Depois que vc coloca os oócitos no meio TCE199, junto com LH e FSH, vai levar pra estufa, vai deixar por 24 horas, que é o tempo pra fazer maturação. Nessa estufa vc vai ter uma temperatura controlada de 39ºC, com 5,4% de CO2 e umidade relativa de 95%.
FIV
Fecundação in vitro
	- procedimento onde oocitos maturados são cultivados junto com SPTZ
	- sêmen congelado (na maioria das vezes fazemos uso do sêmen congelado): 
			- separação de vivos e mortos
			- separação componentes do diluente
Vc pega o ejaculado do touro, e vc bota ele nas paletas de sêmen. Ex. 30ml, vamos fazer varias paletas, que cada uma cabe muito. Mas vc tem 10 milhoes de sptz, e sêmen sexado vc tem 2 milhoes.
Pra congelar o sêmen, vc tem que colocar gema de ovo, varias coisas pra nutrir e crioprotetores, pra que o sêmen agüente o congelamento
Bota em banho Maria pra descongelar, muitos dos sptz não vão sobreviver, e junto ainda vai ter todos os diluentes.
- Separação espermática:
Separar os sptz vivos dos mortos 
	- método de percoll – diferença de densidade
			Centrifugação 
			Mais caro
			Mais rápido – 15min
É um método mais caro porem mais rápido. Os mortos ficam em baixo e os vivos ficam em cima.
	- método de “swin up” – motilidade 
Swin up: vc pega um tubinho, coloca a dose de sêmen no fundo desse tubo, depois vc acrescenta um meio em cima. Nesse liquido do meio, todos os nutrientes desse meio ficam na superfície, com isso o SPTZ nada pra cima. Quem fica em baixo é quem está morto, machucados, etc. 
Esse meio vc deixa por 1 hora a 39ºC. depois desse período de 1 hora é tempo pra decantar o que vai ser descartado e tira o sobrenadante (850 microlitros) que é onde vão estar os SPTZ vivos. 
Tendo separado os SPTZ , vou fazer a capacitação espermática
- Capacitação espermática
	Fisiologicamente ocorre dentro do trato reprodutivo da fêmea, secreções desta promovem mudanças moleculares na membrana plasmática do SPTZ tornando-os aptos a penetrarem no oócito durante a fecundação. 
	Fisiologicamente – do trato reprodutivo da fêmea 
	FIV – fora do trato genital feminino
		- heparina
Heparina
	Glicosaminoglicanas 
	Presente durante o estro
	Se liga e produz alt
A heparina vai se ligar aos receptores que estão presentes no SPTZ e quando ocorre essa ligação ocorre a ativação dos canais iônicos, com isso vc vai ter alteração do cálcio citoplasmático e o pH vai diminuir e sai o cálcio. Com isso tenho a ativação do AMP cíclico, que vai ativar a proteína quinase. Essa PTN quinase vai induzir a reação acrossômica causando a hiperativacao do SPTZ (ele vai nadar mais rápido) e essa hiperativação (o impulsionamento mecânico) vai impulsionar o sptz pra dentro da zona pelúcida, ou seja, tenho a ligação do SPTZ na zona pelúcida. E com isso ele está capacitado. 
- Concentração espermática e tempo de incubação 
	Aumenta as taxas de penetração espermática e clivagem
	Enzimas hidroeletroliticas e radicais livres – ambiente hostil
	Maior tempo em substancias toxicas
	Partenogênese (embrião produzido sem o gameta masculino) e polispermia (oócito fecundado por mais de um sptz)
- concentração espermatica e tempo de incubação 
	Altas taxas de penetração espermáticas com mínimo de fecundações anormais
	Concentração de mais ou menos 30 oócitos
	Tempo de 12 a 22 horas, depois agente avalia quantos embriões foram formados
Meio de fecundação
- placa com gotas de meio fert talp + heparina
- vamos adicionar o ovócitos e os sptz nesse meio. 
Pegamos os sptz capacitados, os ovócitos capacitados, são colocados numa placa, coloca numa estufa de 12-22h depois avalia quantos embriões foram formados 
Quando ocorre a fecundação ocorre retomada da meiose, temos a formação de uma célula 2n.
Temos o 2º corpúsculo celular.
Visualizamos pró-nucleos M e F
Cultivo in vitro (CIV)
- estufa 39ºC com 5% de CO2 durante 22h
- avaliação da formação de embriões
- troca de meio diariamente (pra que não ocorra contaminação do meio, vc vai descartando os que morreram, e os embriões produzem metabolitos, por essas razoes vc troca o meio)
- observação durante 5 – 7 dias.
Cultivo embrionário
Só vamos transferir de grau 1, 2 e no máximo 3.
Considerações finais
- É importante a determinação do sexo dos produtos. 
Quando agente faz FIV, só queremos bezerras, só procura as fêmeas. Mas com a FIV se observa que tem uma produção de macho maior do que de fêmea, porque o embrião macho se desenvolve mais rápido que o embrião da fêmea. 
- rápida multiplicação de raças 
- facilidade de importação e exportação de material genético da fêmea
Agente consegue congelar o SPTZ e conseguimos congelar o oócito, mas não conseguimos congelar o embrião, por isso temos que exportar separados pra ser feito o embrião lá. 
- bancos de gametas congelados
- aumento da eficiência do sêmen congelado de alto valor genético
- controle de doenças (pois macho não tem contato com a fêmea, com isso tem controle de doenças)

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