biotec 02.05.11
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biotec 02.05.11


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cresce mais um pouco e se torna o:
- Foliculo pré ovulatorio: diminui mais o complexo de golgi, membrana nuclear ondulada, corona radiata superfície da membrana oocito, espaço perivitelínico aumenta (pré maturação ou capacitação)
- Com a onda de LH vc começa o processo de maturação final \u2013 ovulação oócito maturado. A maturação é caracterizado pela maturação citoplasmática (é de forma mais predominante nessa parte). Lipídeos em grande quantidade, que dá suprimento pra formação do gameta.
- maturação final: maturação citoplasmática 
Lipídios (suprimento pós fert)
CG
Alinhamento grânulos da cortical (bloqueio da polispermia, pra não entrar mais de um SPTZ dentro do oócito)
Meiose e rompimento membrana nuclear (da vesícula germinativa, o pronúcleo vai ser liberado e o corpúsculo polar vai migrar pra periferia e vai ser \u201cdescartada\u201d)
 
- termino da meiose
- metáfase da meiose II. Para aqui, quando isso acontece, o oócito está maturado
- oócito maturado
= In vitro
- retirada do folículo 
- padrões in vivo
- a maturação demora em torno de 24 horas
Atraso dispersão grânulos da cortical 
In vivo: Os grânulos da cortical vão se alinhar ao redor da zona pelúcida, ai ocorre o rompimento desse núcleo ai tenho o núcleo parando na metáfase da meiose II. 
Já in vitro matura, mas não da mesma forma que in vivo.
Seleção dos oócitos
- Meio de maturação (pra fazer com que os folículos cresçam e se tornem aptos a serem fecundados)
	-TCM-199 (fonte protéica, antioxidantes, fatores de crescimento)
	-Gonadotrofinas
 Hj é padrão pra capacitação espermática, usar 10g de heparina, é uma glicosaminaglicana presente no útero.
Pode comprar meios prontos ou preparar seu próprio meio. 
Maturação 
Depois que vc coloca os oócitos no meio TCE199, junto com LH e FSH, vai levar pra estufa, vai deixar por 24 horas, que é o tempo pra fazer maturação. Nessa estufa vc vai ter uma temperatura controlada de 39ºC, com 5,4% de CO2 e umidade relativa de 95%.
FIV
Fecundação in vitro
	- procedimento onde oocitos maturados são cultivados junto com SPTZ
	- sêmen congelado (na maioria das vezes fazemos uso do sêmen congelado): 
			- separação de vivos e mortos
			- separação componentes do diluente
Vc pega o ejaculado do touro, e vc bota ele nas paletas de sêmen. Ex. 30ml, vamos fazer varias paletas, que cada uma cabe muito. Mas vc tem 10 milhoes de sptz, e sêmen sexado vc tem 2 milhoes.
Pra congelar o sêmen, vc tem que colocar gema de ovo, varias coisas pra nutrir e crioprotetores, pra que o sêmen agüente o congelamento
Bota em banho Maria pra descongelar, muitos dos sptz não vão sobreviver, e junto ainda vai ter todos os diluentes.
- Separação espermática:
Separar os sptz vivos dos mortos 
	- método de percoll \u2013 diferença de densidade
			Centrifugação 
			Mais caro
			Mais rápido \u2013 15min
É um método mais caro porem mais rápido. Os mortos ficam em baixo e os vivos ficam em cima.
	- método de \u201cswin up\u201d \u2013 motilidade 
Swin up: vc pega um tubinho, coloca a dose de sêmen no fundo desse tubo, depois vc acrescenta um meio em cima. Nesse liquido do meio, todos os nutrientes desse meio ficam na superfície, com isso o SPTZ nada pra cima. Quem fica em baixo é quem está morto, machucados, etc. 
Esse meio vc deixa por 1 hora a 39ºC. depois desse período de 1 hora é tempo pra decantar o que vai ser descartado e tira o sobrenadante (850 microlitros) que é onde vão estar os SPTZ vivos. 
Tendo separado os SPTZ , vou fazer a capacitação espermática
- Capacitação espermática
	Fisiologicamente ocorre dentro do trato reprodutivo da fêmea, secreções desta promovem mudanças moleculares na membrana plasmática do SPTZ tornando-os aptos a penetrarem no oócito durante a fecundação. 
	Fisiologicamente \u2013 do trato reprodutivo da fêmea 
	FIV \u2013 fora do trato genital feminino
		- heparina
Heparina
	Glicosaminoglicanas 
	Presente durante o estro
	Se liga e produz alt
A heparina vai se ligar aos receptores que estão presentes no SPTZ e quando ocorre essa ligação ocorre a ativação dos canais iônicos, com isso vc vai ter alteração do cálcio citoplasmático e o pH vai diminuir e sai o cálcio. Com isso tenho a ativação do AMP cíclico, que vai ativar a proteína quinase. Essa PTN quinase vai induzir a reação acrossômica causando a hiperativacao do SPTZ (ele vai nadar mais rápido) e essa hiperativação (o impulsionamento mecânico) vai impulsionar o sptz pra dentro da zona pelúcida, ou seja, tenho a ligação do SPTZ na zona pelúcida. E com isso ele está capacitado. 
- Concentração espermática e tempo de incubação 
	Aumenta as taxas de penetração espermática e clivagem
	Enzimas hidroeletroliticas e radicais livres \u2013 ambiente hostil
	Maior tempo em substancias toxicas
	Partenogênese (embrião produzido sem o gameta masculino) e polispermia (oócito fecundado por mais de um sptz)
- concentração espermatica e tempo de incubação 
	Altas taxas de penetração espermáticas com mínimo de fecundações anormais
	Concentração de mais ou menos 30 oócitos
	Tempo de 12 a 22 horas, depois agente avalia quantos embriões foram formados
Meio de fecundação
- placa com gotas de meio fert talp + heparina
- vamos adicionar o ovócitos e os sptz nesse meio. 
Pegamos os sptz capacitados, os ovócitos capacitados, são colocados numa placa, coloca numa estufa de 12-22h depois avalia quantos embriões foram formados 
Quando ocorre a fecundação ocorre retomada da meiose, temos a formação de uma célula 2n.
Temos o 2º corpúsculo celular.
Visualizamos pró-nucleos M e F
Cultivo in vitro (CIV)
- estufa 39ºC com 5% de CO2 durante 22h
- avaliação da formação de embriões
- troca de meio diariamente (pra que não ocorra contaminação do meio, vc vai descartando os que morreram, e os embriões produzem metabolitos, por essas razoes vc troca o meio)
- observação durante 5 \u2013 7 dias.
Cultivo embrionário
Só vamos transferir de grau 1, 2 e no máximo 3.
Considerações finais
- É importante a determinação do sexo dos produtos. 
Quando agente faz FIV, só queremos bezerras, só procura as fêmeas. Mas com a FIV se observa que tem uma produção de macho maior do que de fêmea, porque o embrião macho se desenvolve mais rápido que o embrião da fêmea. 
- rápida multiplicação de raças 
- facilidade de importação e exportação de material genético da fêmea
Agente consegue congelar o SPTZ e conseguimos congelar o oócito, mas não conseguimos congelar o embrião, por isso temos que exportar separados pra ser feito o embrião lá. 
- bancos de gametas congelados
- aumento da eficiência do sêmen congelado de alto valor genético
- controle de doenças (pois macho não tem contato com a fêmea, com isso tem controle de doenças)