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cresce mais um pouco e se torna o: - Foliculo pré ovulatorio: diminui mais o complexo de golgi, membrana nuclear ondulada, corona radiata superfície da membrana oocito, espaço perivitelínico aumenta (pré maturação ou capacitação) - Com a onda de LH vc começa o processo de maturação final – ovulação oócito maturado. A maturação é caracterizado pela maturação citoplasmática (é de forma mais predominante nessa parte). Lipídeos em grande quantidade, que dá suprimento pra formação do gameta. - maturação final: maturação citoplasmática Lipídios (suprimento pós fert) CG Alinhamento grânulos da cortical (bloqueio da polispermia, pra não entrar mais de um SPTZ dentro do oócito) Meiose e rompimento membrana nuclear (da vesícula germinativa, o pronúcleo vai ser liberado e o corpúsculo polar vai migrar pra periferia e vai ser “descartada”) - termino da meiose - metáfase da meiose II. Para aqui, quando isso acontece, o oócito está maturado - oócito maturado = In vitro - retirada do folículo - padrões in vivo - a maturação demora em torno de 24 horas Atraso dispersão grânulos da cortical In vivo: Os grânulos da cortical vão se alinhar ao redor da zona pelúcida, ai ocorre o rompimento desse núcleo ai tenho o núcleo parando na metáfase da meiose II. Já in vitro matura, mas não da mesma forma que in vivo. Seleção dos oócitos - Meio de maturação (pra fazer com que os folículos cresçam e se tornem aptos a serem fecundados) -TCM-199 (fonte protéica, antioxidantes, fatores de crescimento) -Gonadotrofinas Hj é padrão pra capacitação espermática, usar 10g de heparina, é uma glicosaminaglicana presente no útero. Pode comprar meios prontos ou preparar seu próprio meio. Maturação Depois que vc coloca os oócitos no meio TCE199, junto com LH e FSH, vai levar pra estufa, vai deixar por 24 horas, que é o tempo pra fazer maturação. Nessa estufa vc vai ter uma temperatura controlada de 39ºC, com 5,4% de CO2 e umidade relativa de 95%. FIV Fecundação in vitro - procedimento onde oocitos maturados são cultivados junto com SPTZ - sêmen congelado (na maioria das vezes fazemos uso do sêmen congelado): - separação de vivos e mortos - separação componentes do diluente Vc pega o ejaculado do touro, e vc bota ele nas paletas de sêmen. Ex. 30ml, vamos fazer varias paletas, que cada uma cabe muito. Mas vc tem 10 milhoes de sptz, e sêmen sexado vc tem 2 milhoes. Pra congelar o sêmen, vc tem que colocar gema de ovo, varias coisas pra nutrir e crioprotetores, pra que o sêmen agüente o congelamento Bota em banho Maria pra descongelar, muitos dos sptz não vão sobreviver, e junto ainda vai ter todos os diluentes. - Separação espermática: Separar os sptz vivos dos mortos - método de percoll – diferença de densidade Centrifugação Mais caro Mais rápido – 15min É um método mais caro porem mais rápido. Os mortos ficam em baixo e os vivos ficam em cima. - método de “swin up” – motilidade Swin up: vc pega um tubinho, coloca a dose de sêmen no fundo desse tubo, depois vc acrescenta um meio em cima. Nesse liquido do meio, todos os nutrientes desse meio ficam na superfície, com isso o SPTZ nada pra cima. Quem fica em baixo é quem está morto, machucados, etc. Esse meio vc deixa por 1 hora a 39ºC. depois desse período de 1 hora é tempo pra decantar o que vai ser descartado e tira o sobrenadante (850 microlitros) que é onde vão estar os SPTZ vivos. Tendo separado os SPTZ , vou fazer a capacitação espermática - Capacitação espermática Fisiologicamente ocorre dentro do trato reprodutivo da fêmea, secreções desta promovem mudanças moleculares na membrana plasmática do SPTZ tornando-os aptos a penetrarem no oócito durante a fecundação. Fisiologicamente – do trato reprodutivo da fêmea FIV – fora do trato genital feminino - heparina Heparina Glicosaminoglicanas Presente durante o estro Se liga e produz alt A heparina vai se ligar aos receptores que estão presentes no SPTZ e quando ocorre essa ligação ocorre a ativação dos canais iônicos, com isso vc vai ter alteração do cálcio citoplasmático e o pH vai diminuir e sai o cálcio. Com isso tenho a ativação do AMP cíclico, que vai ativar a proteína quinase. Essa PTN quinase vai induzir a reação acrossômica causando a hiperativacao do SPTZ (ele vai nadar mais rápido) e essa hiperativação (o impulsionamento mecânico) vai impulsionar o sptz pra dentro da zona pelúcida, ou seja, tenho a ligação do SPTZ na zona pelúcida. E com isso ele está capacitado. - Concentração espermática e tempo de incubação Aumenta as taxas de penetração espermática e clivagem Enzimas hidroeletroliticas e radicais livres – ambiente hostil Maior tempo em substancias toxicas Partenogênese (embrião produzido sem o gameta masculino) e polispermia (oócito fecundado por mais de um sptz) - concentração espermatica e tempo de incubação Altas taxas de penetração espermáticas com mínimo de fecundações anormais Concentração de mais ou menos 30 oócitos Tempo de 12 a 22 horas, depois agente avalia quantos embriões foram formados Meio de fecundação - placa com gotas de meio fert talp + heparina - vamos adicionar o ovócitos e os sptz nesse meio. Pegamos os sptz capacitados, os ovócitos capacitados, são colocados numa placa, coloca numa estufa de 12-22h depois avalia quantos embriões foram formados Quando ocorre a fecundação ocorre retomada da meiose, temos a formação de uma célula 2n. Temos o 2º corpúsculo celular. Visualizamos pró-nucleos M e F Cultivo in vitro (CIV) - estufa 39ºC com 5% de CO2 durante 22h - avaliação da formação de embriões - troca de meio diariamente (pra que não ocorra contaminação do meio, vc vai descartando os que morreram, e os embriões produzem metabolitos, por essas razoes vc troca o meio) - observação durante 5 – 7 dias. Cultivo embrionário Só vamos transferir de grau 1, 2 e no máximo 3. Considerações finais - É importante a determinação do sexo dos produtos. Quando agente faz FIV, só queremos bezerras, só procura as fêmeas. Mas com a FIV se observa que tem uma produção de macho maior do que de fêmea, porque o embrião macho se desenvolve mais rápido que o embrião da fêmea. - rápida multiplicação de raças - facilidade de importação e exportação de material genético da fêmea Agente consegue congelar o SPTZ e conseguimos congelar o oócito, mas não conseguimos congelar o embrião, por isso temos que exportar separados pra ser feito o embrião lá. - bancos de gametas congelados - aumento da eficiência do sêmen congelado de alto valor genético - controle de doenças (pois macho não tem contato com a fêmea, com isso tem controle de doenças)
