biotec 23.05

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Biotecnologia da reprodução animal
		23/05/2011
Inseminação artificial em cães
Indicações: 
Pra raças que não consegue cobrir a fêmea, ex. bulldog inglês. Animal com baixa libido. Comportamental: quando a fêmea é brava.
Animais que não residem na mesma região, podemos usar o sêmen congelado ou resfriado.
Evitar estresse de viagem longa, com isso pode usar o sêmen resfriado pra evitar estresse no animal.
No resfriamento, há muitas poucas perdas, por isso é indicado o seu uso, em até 24 horas.
 
Preparo dos animais
- exame clínico geral e exame clínico reprodutivo. Saber se a cadela está pronta pra encarar uma prenhes, se está com vacinas em dia, se está vermifugada, se tem doença metabólica.
No exame clinico fazemos a anamnese, perguntamos pro proprietário como é o ciclo, qual o cio. Sangra 9 dias e depois insemina no 10º dia, 12º dia e 14º dia.
Tento pra macho quanto pra fêmea fazemos
Perguntas:
Se ele identifica o que é cio. O proprietário geralmente sabe que é quando sangra.
Ai vc pergunta quanto começou a ciclar, quantos cios já apresentou, de quanto em quanto tempo apresenta cio.
Se o proprietário não está observando o método pode estar inadequado, a cadela pode se lamber muito e ele não ver, ou a cadela vive no quintal e não vê.
Se o proprietário não consegue ver, o que agente faz: colocar um pano claro na casinha da cadela, porque qualquer gota que cair vai ficar. 
O ideal é que a cadela cicle a cada 6 meses. Sabe-se que cadelas que ciclam a cada 4 meses tem dificuldade de emprenhar.
Cadela com até 2 anos é normal ciclar a cada 2 meses, é fisiológico. Mas depois de 24 meses o cio começa a ficar mais espaçado e tende a passar a ser fértil depois de um tempo. Ela pode emprenhar com ciclo de 2 meses, mas é bem difícil. 
Como nasceram os filhotes, se morreram após o parto, se morreram depois de um tempo, se a fêmea amamenta bem, todo o período natal. 
A fêmea dominante influencia no ciclo estral das outras cadelas por conta do feromônio, as outras cadelas tentem a entrar no ciclo estral da cadela dominante.
Examinar o macho, tanto no exame externo como saber se tem os 2 testículos, se não tiver não é usado pra reprodução. vc vê sensibilidade dos testículos, se a cauda do epidídimo está aumentado, se a espessamento do cordão espermático, se consegue expor o pênis, vemos o aspecto da próstata na palpação digital., tamanho, textura, sensibilidade, mobilidade. (maciez da ponta do nariz).
Próstata: 
Jovens: cavidade pélvica, velhos: na cavidade abdominal
Ultrassom dos testículos e da próstata é bom.
Coleta o sêmen, pra avaliar as variáveis como motilidade, vigor, concentração, fazer o espermiograma, quais defeitos agente encontra no sptz, se tem leucócito no ejaculado, se tiver sg, etc. 
Prostatite aguda: vai ter dor à palpação, sg presente no ejaculado geralmente na 3ª fração do ejaculado.
Testes sorológicos: teste pra brucelose é o único que é indispensável pra reprodução. Existem outros vírus que interferem na reprodução, mas a brucelose é uma bactéria intracelular onde o controle é muito difícil. Se der positivo pra brucelose ele deve ser castrado e retirado do canil. 
Fisiologia da cadela
O ciclo estral da cadela é diferente da vaca. As biotecnologias da reprodução não funcionam tão bem na cadela
- Proestro ~ 9 dias
- Estro ~ 9 dias (época que ela permite ser coberta, onde ocorre a ovulação)
- Metaestro : período de formação do CL. Mas a cadela não tem, a formação do CL ocorre no estro.É o período da inseminação. 
- Diestro ~ 60 dias
- Anestro ~ 120 dias
Pra induzir o cio da cadela é muito difícil. No anestro os ovários não respondem a estímulos hormonais. 
No proestro começa o recrutamento dos folículos, quem comanda esse recrutamento é o relógio biológico. Cadelas de raças pequenas tendem a ciclar mais precocemente do que raças grandes. 
Os folículos começam a crescer, o FSH baixo estimula o feedback negativo, com isso o estrogênio vai aumentando e vai estimulando o FSH a aumentar os seus picos e ai os folículos vão crescendo.
No epitélio vaginal vamos encontrar antes da ação do estrógeno, vamos encontrar células do tipo para-basais que vamos encontrar tanto no anestro quanto no proestro. 
No proestro, o estrogênio está estimulando as células para-basais a entrarem em mitose, só que as células vão se afastar um pouco da lamina basal e que vão dar origem as células acima delas ch. Células intermediárias. Podemos encontrar hemácias na lamina de proestro. 
Ex. cadela que não manifesta sinais externos de cio nem sangramento, nem com o uso de toalha branca ela não tem nada. Agente recomenda citologia vaginal a cada 15 dias. 
É uma cadela que provavelmente faz cio silencioso. 
O estrogênio continua a aumentar, a fêmea começa a mostrar sinais de cio, mas ainda não está aceitando o macho.
No proestro o LH se mantém com a produção constante. O FSH vai aumentando a sua produção. 
A progesterona está em níveis basais no proestro.
No começo do estro, o FSH vai fazer a transformação das células granulosa em células luteínicas, que tem receptores pra LH. 
O LH vai começar a aumentar na fase de estro.
Quando tem pico de LH no estro, agente observa dentro do ovário nesse pico, a ovulação. Temos o pico de LH de 48 horas, que é onde ocorre a ovulação. 
A progesterona vai aumentar, sendo sintetizada pelas células luteínicas pelo estimulo do LH. Quando as céls da granulosa Tb se transformam em células luteinicas, o estrogênio abaixa.
Desde o começo do estro podemos fazer a dosagem da progesterona e vamos ver que ela vai crescendo aos poucos. Até que vamos encontrar [] maiores até 7,5ng/ml, depois de 48 de pico de LH vamos encontrar a progesterona alta. 
O LH chega ao pico maximo dele quando as cels da granulosa são transformadas em cels luteinicas. 
Todos os folículos estão se transformando em CL.
Na citologia vaginal: (estro)
Vamos ver a lamina basal e vamos ver 3 tipos de células, as para-basais, intermediárias e as cels do tipo superficiais. 
Só que pra dizer que a cadela está no estro, tem que ter mais de 80% de células superficiais na citologia. 
(as células superficiais têm células com núcleos pequenos ou até ausentes, células superficiais também são chamadas de células naviculares)
A cadela pode ovular em qlq momento do estro. Uma das ferramentas pra identificar que ela ovulou é a dosagem progesterona. Até poderia ser LH, só que a meia vida do LH é muito curta, então eu só conseguiria ver canulando a veia dessa cadela e dosando o tempo todo, então eu vou dosar a progesterona.
Faço citologias vaginais dia sim e dia não, até ela chegar no estro, e vou dosar a progesterona desde que ela entrou no estro dia sim e dia não. 
Se eu doso a progesterona na segunda, ela está com 2ng/ml, ai doso na quarta e ela está com 7,5. Eu tenho que esperar 48 horas pra inseminar. Porque quando a fêmea ovula, ela ovula uma vesícula germinal, só que agente tem que inseminar quando ela chega em metáfase II, nos cães, o oocito é ovulado em vesícula germinal e vai maturar no 
Diestro
Ovários: vamos ver CL nos ovários
Vemos neutrófilo, 50% de intermediários, 50% de células para-basais
Anestro
Vemos células para-basais
1º agente usa técnicas pra monitorar o ciclo estral:
Citologia vaginal
	Citologia esfoliativa, agente umedece o swab com solução fisiológica, ou a escovia cervical. Cadela em estação, introduz na vertical, depois agente introduz na horizontal ate chegar próximo a entrada da cérvix. O ideal é que agente tivesse um vaginoscópio, que é o espectro com iluminador, e introduzir o swab só no local onde agente quer coletar o material.
Camisinha sanitária no swab e só quando vc chegar no local onde vc quer coletar o material, fura essa camisinha e coleta o material, depois volta pra camisinha e retira da vagina.
Agente rola o swab sobre uma lamina (agente rola no mesmo sentindo) e na escovinha agente rola bastante pra poder soltar bem as células.
Cora com panotipo (5 seg em cada)
E vê no microscópio.
Através da vaginoscopia, vemos como está a vagina, o epitélio. 
Proestro: epitélio fica inchado,com muco viscoso, mais vermelho
Estro: após a ovulação, fica mais pálida e murcha
Diestro ou anestro: pálido, mais liso
Pico de LH, baseado nos níveis plasmáticos de progesterona, perguntamos ao laboratório se prefere soro ou plasma. 
Células parabasais: núcleo com citoplasma “pequeno” são proporcionais
Intermediarias: núcleo menos em proporção ao citoplasma, o citoplasma é irregular
Superficiais: parecem células dobradas, com citoplasma irregular e núcleo menor ou ausente.
Características dos estágios do ciclo estral:
- anestro:
	(slide)
- Proestro
	Slide
- Estro
	Slide
Ovulação na cadela:
- ocorre 36-50 horas após o pico de LH;
- Oócitos primários no estado de vesícula germinal
- A metáfase II (slide)
- Diestro
	Slide 
Materiais para a IA com sêmen a fresco ou resfriado:
- Panótipo
- Microscópio
- Banho Maria (pra diluir o sêmen e manter ele aquecido enquanto agente faz as analises)
- Pipetas
- Avaliação da motilidade e vigor 10 microlitros, no microscópio (10x)
- Câmara de newbower 
- Morfologia: faz o esfregaço
- Corante pra corar SPTZ: cerovisk. O panotipo não cora muito bem o SPTZ, talvez vc tenha que deixar mais tempo no panótipo pra corar.
- Placa aquecedora, lamina, lamínula, ponteiras, pipeta automática, microscópio, luvas.
Pra coleta do sêmen:
- copo coletor universal (fezes e urina):
Problemas do copo: 
Se tiver MT frio, pode ter choque térmico do SPTZ;
Se o cão é muito grande, na borda do copo coletor ele pode cortar o pênis, podendo contaminar.
- Funil:
 
Sêmen congelado
Precisa de um botijão.
Descongelar: tira do botijão, coloca no banho Maria por 37º por 30 segundos.
Massagem do pênis atrás do bulbo peniano com o dedo. 
1ª fração: só liquido prostático
2ª fração: liquido branco que é o liquido prostático com o SPTZ.
3ª fração: joga o pênis pra trás, e continua fazendo a massagem pra ele ejacular a 3ª fração, mas é bom pra descartar, 
Vc tem que ter um volume de 2-3ml. 
Se ele não ejacular a 3ª fração, agente precisa ter um diluidor.
 
Sêmen fresco pode usar ringer sem lactato na temperatura do sêmen. 
Características do sêmen canino
(slide)
Diluição 
(slide)
1ml de sêmen pra 3ml de diluidor.
Conservação do sêmen
- resfriamento
- congelamento
(slide)
Na inseminação
Introduz a pipeta na vertical, depois passa pra horizontal, e depois espera uns 10 minutos com as patas traseiras levantadas.
Inseminação artificial intra-uterina com sêmen congelado
(pra melhorar o percentual de fecundação)
A entrada da cérvix da cadela fica no teto da vagina, na maioria das cadelas. 
2 técnicas: cateter norueguês 
Tem uma bainha de silicone em volta pra entrada da cérvix.
Traz a cérvix pelo abdômen e introduz o cateter.