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BIOTECNOLOGIA DA REPRODUÇÃO ANIMAL
Rio, 28/03/2011
Alexandra Woods
Criopreservação
A TECNOLOGIA DO SÊMEN ENVOLVE:
No eqüino, a criopreservação do sêmen envolve o resfriamento e o congelamento do sêmen. 
Como assim: quando vimos tecnologia de sêmen em bovino, só foi falado em congelamento porque a técnica de congelamento do bovino está totalmente dominada com resultados satisfatórios. 
No eqüino agente não consegue ainda fazer um congelamento adequado, um congelamento que me de uma resposta adequada, boa.
Isso acontece por vários motivos:
1º de tudo: porque a maior parte das pesquisas são em bovinos, que são animais economicamente mais fáceis de vc financiar em pesquisa.
2º ponto: em relação ao próprio tipo de célula, diferença de tipo de célula: O SPTZ do eqüino é mais sensível que o SPTZ do bovino.
3º ponto: Tipo de seleção. No bovino vc faz seleção pra fertilidade. No eqüino não tem seleção pra fertilidade. A seleção do touro é visando a fertilidade.
Agente tem uma dificuldade no congelamento, por esse motivo o resfriamento de sêmen do eqüino é muito usado. Os resultados com o uso de sêmen resfriado eqüino são muito melhores do que sêmen congelado.
Agora, o resfriamento do touro era feito na década de 60, as técnicas no bovino são muito mais evoluídas do que no eqüino.
Pra realidade do cavalo, o resfriamento é hoje.
Vantagens da tecnologia de sêmen:
Permitem a inseminação artificial de uma maneira bem mais abrangente. A partir do momento que eu consigo resfriar ou congelar o sêmen eu consigo atingir um numero maior de planteis, até mesmo em estados diferentes, países diferentes, então eu tenho uma probabilidade maior de usar a inseminação artificial.
Temos menor custo por transportes e menor risco de acidentes
As técnicas de criopreservação foram feitas para transportar o sêmen, evitando assim acidentes de matriz e reprodutor. E com isso não atrapalhar o marketing (com machucados no corpo, marcas de machucado, etc.)
Antigamente vc tinha despesas com caminhão, com a fazenda do proprietário do cavalo, estadia dos animais. 
Hoje em dia vc não transporta nem a matriz e nem o reprodutor, vc transporta apenas o sêmen. Que é muito mais pratico.
Isso levou inclusive a diminuição de transmissão de doença (não estou falando aqui de DST), estou falando aqui das próprias doenças de transito como gripe, garrotilho, são doenças que passam de um pro outro, principalmente quando vc introduz um animal novo, às vezes ele traz aquele agente. Quando começou a criopreservar isso também diminuiu.
Diminuiu custo com reprodutores. Pois não preciso comprar o garanhão, posso comprar só o sêmen. Alem de comprar o garanhão, eu não preciso gastar com a estadia desse garanhão. Então vc diminui o custo com reprodutor (alimentos, controle sanitário, vacinas, etc.)
Continuidade na estação reprodutiva 
O cavalo é um animal de esporte ou trabalho, é um animal de performance. Então reprodução e atividade esportiva são conflitantes. Como assim, tem que pensar no garanhão, vc vai colocar o garanhão pra cobrir, pra coletar o sêmen e esse mesmo garanhão vc bota pra saltar obstáculo. Ele gasta energia montando égua e gasta energia pra saltar, não tem como, o rendimento dele não consegue ser o mesmo.
Fora isso, vc tem um macho em atividade reprodutiva, o comportamento dele é afetado, porque ele fica mais agressivo, e fica muito mais estimulado com as éguas. Então se está em atividade reprodutiva e vc pega o cavalo e resolve que vai saltar com ele, ai vc entra numa pista que tem outros machos e fêmeas, com isso ele pode querer arrumar confusão com os outros machos e ele vai ficar cortejando a fêmea, com isso são atividades conflitantes. Como agente faz: se eu tenho um garanhão que é de esporte, prova, eu pego ele, paro ele e o deixo só fazendo reprodução, ex. fica 2 meses coletando o sêmen e congelo. Depois desse tempo ele volta com a atividade esportiva e eu passo a usar o sêmen dele que eu congelei. É uma opção pra vc trabalhar. 
Estocagem do sêmen de reprodutores importantes
Posso guardar o sêmen de reprodutores de alto valor.
Em relações a limitações:
A literatura cita que vc tem limitação com profissionais especializados, materiais e equipamentos. Mas o custo que vc tem com isso, é irrisório frente ao ganho que vc tem. Então esse custo é justificado, então não considero uma limitação, pois o ganho paga. Se vc pensar que não vai pagar frete, não vai pagar estadia do animal, que vc vai ter um melhoramento com o uso da inseminação artificial muito grande no seu plantel, então esse custo é mais do que justificado, então a professora não considera como uma limitação.
O que a professora acha uma limitação é:
Variabilidade da qualidade do sêmen 
O que é isso: Vc tem dificuldade com eqüino em estabelecer protocolos. 
Ex. pega 10 cavalos, e usa o mesmo protocolo de criopreservação pra todos eles. Cada um responde de uma forma diferente. Ex. tem um que vai sair da motilidade alta e continuar alto, tem um que vai sair de uma motilidade alta e ficar com quase zero. 
Com isso os nossos protocolos não são fechados, são sempre individuais.
Ex. vou fazer um resfriamento pela 1ª vez, eu levo 3, 4 diluidores diferentes de sêmen, porque vou testando qual o diluidor que esse cavalo fica melhor, se é com A, B, C ou D. qual temperatura que ele resfria melhor, ai vou testando. 
Não adianta vc ter o mesmo protocolo porque vc não vai ter o mesmo resultado pra todo mundo. É diferente do bovino que vc tem o protocolo e as centrais mantém aquilo, no caso do eqüino isso não dá. 
Técnicas de criopreservação 
1ª coisa que vc tem que fazer é:
Coleta e avaliação do sêmen
- Como é feita a coleta de sêmen: pra garanhão: o método de escolha é a vagina artificial. Vamos coletar da forma convencional, agente só procura fazer o máximo possível de critérios de higienização. É o cuidado que agente sempre tem, de lavar o pênis do garanhão com água pura, lavar a manequim pra diminuir as possibilidades de contaminação.
Avaliação do sêmen 
Coletando o sêmen, vamos avaliar o sêmen. OBS: Esse animal já passou por um exame andrológico, estamos partindo de um principio que ele foi aprovado no exame andrológico. Agora o que vamos falar é uma avaliação de rotina para criopreservação.
O que vc espera de um animal pra vc criopreservar o sêmen dele:
Volume de 50 a 250ml de sêmen. A media do garanhão é de 80ml. O volume não é desclassificatório. Não é motivo de descarte do animal nem do sêmen.
Ex. se o meu garanhão, por exemplo, ejacular 40ml eu não descarto esse sêmen, no máximo o que acontece é eu fornecer um numero menor de doses. 
Motilidade inferior a 70% e vigor inferior a 3%. Esses são descartados. Não criopreservar sêmen com uma motilidade progressiva menor que 70% e vigor inferior a 3%. Então isso é desclassificatório, vou eliminar esses animais.
Concentração: 200x106/ml. Não é desclassificado, porque vc só vai formar um numero menor de doses. Não precisa desclassificar o animal por conta disso.
Total de defeitos: abaixo de 35% de defeitos totais. Também é desclassificatório.
Isso é um ponto complicado pra gente. Mas o ideal é sermos rigorosos com isso. Porque na hora de descongelar o sêmen eu tenho perdas nessas porcentagens. Se vc tem dificuldade nos resultados, quanto mais exigente vc for, teoricamente melhor vai ser seu resultado. Mas isso é muito difícil pro eqüino, pois no garanhão o proprietário não se importa com esses parâmetros. Mas no caso do bovino eles se importam, o proprietário descarta o animal que não tiver os parâmetros.
O mais difícil é manter seu critério pra justificar o teu resultado no final.
Se o meu sêmen passou naqueles parâmetros, foi avaliado e aprovado nos parâmetros. Agora vou resfriar o meu sêmen.
Resfriamento
Existem 2 temperaturas para resfriamento do sêmen.
15 a 20ºC
5º C
Diferença entre elas: 
A temperatura de 15ºC vc resfria em caixa de isopor, é um resfriamento prático e barato. Conserva o sêmen por até 18 horas após a coleta. 
Então se eu tenho que enviar esse sêmen para distancias curtas, inferiores a 18 horas euuso esse método, é um excelente método de resfriamento.
Já o resfriamento a 5ºC, vc tem que usar o equitainer, que é um botijão. 
Equitainer: usado para resfriar, conservar o sêmen por até 48 horas após a coleta. 
Se eu quero mandar o sêmen pra um lugar que vá demorar mais de 18 horas, tem que usar o equitainer. 
Vantagens e desvantagens desses métodos:
Caixa de isopor: barato e pratico. Mas como começou a comercializar, ficou um pouco mais caro, em torno de 70 reais. Então pra isso, hoje em dia eu posso comprar um isopor, montar e usar, que é muito mais barato e vc não precisa que o proprietário te envie o isopor de volta.
Equitainer: muito mais caro, na faixa de 500 dólares. Ou um genérico, nacional, chamado bocutainer, custa em torno de 500 reais. Isso é um equipamento que se tem que devolver. Hoje em dia só usa isso quando vc não tem como usar o isopor, porque é muito incomodo, vc ter que ter sempre retornando isso. 
Porem tem cavalo que não resfria bem a 15ºC, só resfria bem a 5ºC, então ai vc é obrigado a usar o equitainer. E tem o vice-verso, ai vc tem é obrigado a usar o isopor.
Dentro de uma normalidade agente tem essas vantagens e desvantagens, mas tem um momento em que o bom senso não vai adiantar muito, porque se o meu cavalo não resfria bem a 15º, eu tenho que mandar em 5º, ou seja, tenho que mandar no equitainer pra Macaé por exemplo. 
Importância dessa temperatura
O sêmen quando ele sai de 37ºC, que é a temperatura que agente coletou ele, e chega a 15ºC, ele não faz lesão estrutural. É por isso eu posso usar uma caixa de isopor, porque posso simplesmente abrir a caixa, colocar no isopor e fechar a caixa. Posso fazer isso porque não tem lesão de membrana plasmática nem de citoesqueleto do SPTZ.
Porém pra ele sair de 15ºC pra chegar a 5º c, eu tenho que ter um controle da temperatura, porque aqui é a faixa de temperatura que ele pode fazer lesão de membrana plasmática e citoesqueleto. Então como tem que ser essa queda de temperatura: tem que cair de 0,05ºC/min até chegar a 5ºC (não precisa decorar isso). De 15ºC até 5ºC tem que ir caindo a temperatura 0,05ºC por minuto até chegar a 5ºC, por isso que eu preciso do equitainer, porque o equitainer tem uma parede que controla essa temperatura, e no isopor eu não tenho isso.
Coletei, avaliei meu sêmen, aprovei. 
Vou resfriar:
Todo resfriamento tem que ter proteção porque mesmo submetendo o SPTZ a temperaturas positivas, é frio, então eu tenho que proteger ele. Por isso eu vou lançar mão de diluidores de sêmen, esses diluidores são simples e baratos. 
O que contem um diluidor de sêmen de resfriamento: 
Protetor de membrana (pra proteger a membrana do frio), geralmente vc encontra o leite, que é o protetor de membrana mais utilizado pra resfriamento do eqüino. 
Alem disso o diluidor de sêmen tem açúcar, que serve de energia para o SPTZ. 
Substância tamponante, pra evitar variações de pH. 
Antibiótico, pra evitar o crescimento de MO. 
E o extensor é o diluente (água destilada, água miniquê, qualquer coisa pra misturar isso tudo).
Hoje em dia vc não precisa fazer porque já vem em laboratório. São práticos porque já vem pronto, tem uma serie de diluidor que já vem pronto e barato. Vem no saquinho liofilizado e o diluente, é só misturar o pó no liquido que está pronto (15-20 reais).
No 1º resfriamento vale a pena vc ter pelo menos 3 diluidores e testar com qual o cavalo fica melhor. Vc coloca um pouco de sêmen com cada diluidor.
A diluição do sêmen deve ser feita na proporção de 2:1. 2 partes de diluidor para 1 parte de sêmen. Como assim: agente tem um padrão de diluição, isso em resfriamento é um acordo entre cavalheiros, porque não existe uma lei do ministério. Então se chegou a um acordo que o ideal é uma dose de 1000x106 sptz e o volume de 10 a 50ml (x=30ml)
Pra vc chegar nessa diluição vc faz um cálculo, que vai em cima da concentração de sêmen, em cima da concentração de dose (o que muda é a concentração de dose), etc.
Se eu colocar menos que 2:1, ou seja, se eu diluir 1:1 o SPTZ compete muito pelo substrato, ai vc tem perda. Por isso que o mínimo recomendado é 2:1. Se vc quiser diluir 4:1, 3:1, vc pode, geralmente em garanhões que tem a concentração mais alta e vc pode diluir mais. Quando o garanhão tem uma concentração mais baixa vc dilui 2:1. 
Vc vai diluir esse sêmen envasando no refil de mamadeira. (Envase). O frasco coletor de sêmen de eqüino é uma mamadeira mesmo, é em mamadeira porque o volume é grande (50-250ml), já no bovino é um tubinho, mas no eqüino tem que ser mamadeira porque tem que caber no mínimo 50ml. 
Pra vc não ter muitas mamadeiras ou ter que ficar higienizando essa mamadeira, vc coloca dentro da mamadeira um saquinho de sacolé. 
Tem um saquinho americano que já é graduado e vc congela o leite no saco que também pode ser usado. 
Cuidado: o plástico tem que ser atóxico.
Depois que coloca no saco e colocou na mamadeira, vc vai resfriar. Vc coloca num buraquinho vc coloca o gelo de vacina (gelo biológico), no outro buraquinho vc coloca o saquinho dentro do buraco. 
Se vc quiser montar o isopor vc faz o seguinte: vc pega a caixa de isopor, de um lado vc coloca a fonte de frio que vc tem (ex. gelo de vacina), do outro lado vc cola um copinho (ex. meio frasco de soro, meia garrafa de água) e cola no recipiente. Ai vc coloca o saquinho dentro desse copinho. A fonte de frio tem que estar a 15cm do saco. 
Na falta do gelo biológico, pega garrafa de água 500ml congela, coloca a garrafa dentro da caixinha, prende e manda. Vc só não pode mandar o gelo.
Equitainer: é aberta, a parede é espessa, e tem um buraco no meio, um cilindro nomeio. A idéia é essas latinhas são 2, são iguais de vacina, vc coloca no congelador, na hora de resfriar vc pega as 2 latinhas e coloca no fundo. Ai vc pega o copinho dele, bota o saquinho de sêmen dentro, coloca o copinho em cima das latinhas e fecha. A parede controla a mudança de temperatura.
Congelamento do sêmen do garanhão 
1ª coisa que agente tem que pensar, o congelamento do garanhão tem uma diferença enorme pro touro. 
Diferença: no sêmen do touro agente coleta o sêmen, bota junto com o diluidor e depois congelava. 
Aqui no eqüino não, já foi provado que no plasma seminal do eqüino porque vc tem proteínas de baixa congelabilidade, ou seja, proteínas quando congeladas causam efeitos deletérios ao sêmen, mata o SPTZ. Então quando vc congela o sêmen que tem o plasma junto, essas proteínas que tem baixa congelabilidade causariam efeitos deletérios pro SPTZ, ou seja, mata o SPTZ. Então agente só vai querer o SPTZ, eu vou tirar o plasma seminal do cavalo, como faço isso: centrifugação do sêmen. 
Só que pra esse sêmen agüentar (porque vou submeter ele a um estresse) eu faço uma diluição inicial, essa diluição inicial que é com aquele diluidor que vimos, o diluidor de resfriamento (que tem leite, açúcar, etc.) só pra ele ficar contente. Eu faço uma diluição inicial e depois da diluição inicial eu vou fazer 2 centrifugações:
1ª: centrifugação lenta por 10 minutos
Desprezo o sobrenadante. Fico apenas com o precipitado. Ai faz a: 
2ª centrifugação: centrifugação rápida por 5 minutos. (tem pressão maior nele)
O que vou obter no final: no final eu tenho um tubo, e no fundo desse tubo tenho uma massa de SPTZ.
Faz a centrifugação pra retirar o plasma seminal.
Depois que vc tem a massa de SPTZ é que vc vai adicionar o diluidor para o congelamento. 
Diluidor para sêmen congelado tem algumas diferenças para o diluidor de sêmen resfriado.
1ª coisa que agente tem que pensar é que o SPTZ vai ser submetido a um congelamento de -196ºC. Então tem que ter proteção. Então todo diluidor de sêmen pra congelamento tem que ter um crioprotetor, como por ex. o glicerol. (o mesmo que se usa pra bovino se usa pra eqüino) 
Isso é o nosso maior desafio. 
Mecanismo do glicerol:
Porque o glicerol desidrata o SPTZ, puxa água do SPTZ, por que: se vc congela uma carne com água dentro, formam-se macrocristais que rompem a fibra, e o mesmo acontece com o SPTZ, se vc não usar o crioprotetor ele forma macrocristais noseu interior que rompe o SPTZ. O crioprotetor desidrata o SPTZ, tira água do SPTZ, evitando a formação de macrocristais durante o processo de congelamento. 
Esse é o nosso maior problema porque o glicerol é tóxico. (o SPTZ do bovino resiste bem a ele), e o do eqüino é mais sensível. Na hora que agente descobrir um crioprotetor que não seja tóxico pro SPTZ do eqüino, a coisa melhora. 
O sêmen de suíno não congela, porque o glicerol é muito toxico, e vc não tem nenhum que vc consiga substituí-lo.
Alem de ter que ter um crioprotetor, um protetor de membrana tem que ser usado. 
O protetor de membrana que agente usa é a gema de ovo.
Alem disso vc tem: Açúcares, tampão, antibiótico, extensor, etc. 
	(O diluidor pra sêmen congelado é muito semelhante ao diluidor de bovino.)
A grande diferença é o crioprotetor e o protetor de membrana (que tem que obrigatoriamente ter a gema do ovo, porque o leite sozinho não segura, não dá conta. Pode associar com o leite).
Diluição de sêmen
É regulamentado, ou seja, quando vc vai comercializar sêmen tem que ser:
Dose: 800x106 SPTZ
Volume: 4ml
Onde se envasa o sêmen congelado: palheta. No eqüino não é diferente do bovino, vc vai envasar em palhetas de 0,5ml ou 0,25ml.
Quantas palhetas vc de 0,5 ml vc tem pra fazer uma dose de sêmen eqüino? Então vc tem 8 palhetas. Quantas de 0,25ml? 16 palhetas.
No garanhão pra vc fazer uma dose, ou vc tem 8 palhetas de 0,5ml ou vc tem 16 palhetas de 0,25ml.
No touro vc tem 1 palheta pra 1 dose, pois vc precisa de Dose: 20x106 SPTZ. No garanhão não, vc precisa de Dose: 800x106 SPTZ. 
Então diluímos de forma a chegar nessa dose e vamos envasar em palhetas de 0,5 ou 0,25ml.
Ele vai passar agora pelo tempo de equilíbrio ou tempo de estabilização: 
O que é isso: é o tempo de ação do glicerol. (coloquei o crioprotetor, o diluidor, etc. tudo junto) tem que dar tempo pro glicerol agir, pra poder desidratar o SPTZ. 
Como faço isso: Eu coloco esse sêmen a temperatura de geladeira (comum), que é de 4-8ºC por 1h a 1:30h na geladeira, depois que ele estiver 1h a 1:30h na geladeira eu vou congelar.
Dilui -> envasei -> Depois que envasei coloco no tempo de equilíbrio que fica de 1h a 1:30h na geladeira.
Faz o congelamento
Idêntico ao sêmen de touro.
1º vc faz o vapor de nitrogênio por 10 minutos, depois imersão em nitrogênio líquido por no mínimo 5 minutos. (=ao de bovino).
A técnica de congelamento é igual, o que muda do bovino é o pré-congelamento, a preparação toda antes de vc congelar.
Inseminação artificial em eqüino 
Conceitos gerais
Definição: deposição mecânica do sêmen no sistema reprodutor da fêmea por meio manual.
Vantagens da IA:
Melhoramento. É a maior vantagem. Mesmo no eqüino ela faz melhoramento. 
Prevenção de acidentes (ex. uso de reprodutores, levar um coice, pisar em alguém, transporte, etc. facilita o manejo)
A inseminação obriga a ter um melhor controle sanitário e um melhor controle zootécnico.
Melhor controle sanitário. É obrigado a ter um melhor controle sanitário e um controle zootécnico. O custo não é alto, mas tem custo com veterinário, espermoboy, avião e do outro esmermoboy. Então é lógico que isso obriga o proprietário a fazer um melhor controle sanitário, porque o proprietário não pode investir nisso tudo e não investir no controle sanitário, porque senão não ganha dinheiro (ex. vacina, se não vacinar a égua pra herpesvírus, senão ela pode abortar). Isso tem que ter porque seu resultado tem que aparecer. Assim como o controle zootécnico, quando vc tem um veterinário direto, controlando e inseminando a sua égua, vc sabe o pai do produto, o dia que ela foi inseminada, tem previsão do parto, vc tem o histórico todo desses animais, isso é o controle zootécnico.
Padronização de rebanhos/planteis. Vc padroniza lotes, padroniza estruturas. Vc pode sincronizar todas as éguas para parir todas na mesma época, com isso vc tem controle, igualdade na idade, etc.
Vc pode usar reprodutores mortos ou deficientes (deficiência adquirida), que é um animal que vc teoricamente não poderia mais usar porque ele não consegue fazer a cópula, mas vc através da inseminação consegue usar esses animais. Em reprodutor morto vc pode fazer punção de epidídimo, mas a qualidade do sêmen não é pra ser usado indiscretamente, é pra ser usado pra laboratório.
Limitações
Consangüinidade. Pai com filha, irmão com Irma, a partir do momento que vc tem uma disponibilidade muito grande agente começa a ver umas coisas assim, os cruzamentos desaconselháveis. Existe risco de disseminação de caracteres indesejados. Mas isso só acontece quando não existe uma orientação. Mas nem sempre proprietário de cavalo aceita essa orientação, mas vc tem que sempre tentar fazer.
Disseminação de caracteres indesejáveis 
Aumento de custos com pessoal, equipamentos e instalações. Aumenta mesmo o custo, porque pra dar certo vc tem que ter uma equipe que tem que entender que tem que ter comprometimento pra sucesso da tecnologia, tem que estar bem envolvida, estar ciente dos processos, precisa da dedicação do pessoal.
A primeira coisa que eu tenho que identificar é o momento que vou inseminar. 
Quando é a hora de inseminar. 
Assim como no bovino, é importante a detecção de cio no eqüino, e isso é feito por meio da rufiação. A rufiação é importante porque além de detectar o cio da fêmea (comportamento dela), vc também aproxima o macho dela, e esse é o efeito macho que ajuda a estimular as outras fêmeas. 
A rufiação na égua deve ser feito diariamente. 
Quem é o rufião eqüino: é um garanhãozinho com bom libido e pouco valor genético econômico. A única técnica que tem pra rufião eqüino é a amputação do pênis, mas é muito cruento. O pônei é um bom rufião.
O rufião é controlado, o cavalo não fica solto no meio das éguas.
Então agente pega um cavalo comum que seja um garanhão que tenha um valor genético baixo, e esse vai rufiar as éguas, o funcionário chega com ele no cabresto e apresenta as éguas pra ele, e ai outro funcionário vai pegar a ficha e marcar quem está no cio. São necessários sempre 2 pessoas, uma segurando o garanhão e outra anotando quem está no cio.
	Não se deixa um cavalo no meio das éguas, porque a cópula é muito escandalosa. É o tipo de comportamento do animal que não deixa fazer rufiação como no bovino, tem que fazer a rufiação conduzida.
Detecção de estro na égua.
Detalhe muito importante: o peão vai detectar o cio através da rufiação, vai te dar a ficha de quem está no cio e quem não está no cio. Só que é o veterinário que determina o momento da realização da inseminação (o que difere totalmente da vaca, que quem insemina é o peão), e aqui é o veterinário que vai determinar o momento e é ele (vet) que vai inseminar, porque é o veterinário que vai determinar o momento. 
Isso acontece por que: a égua tem 7 dias de cio. A rufiação só vai me dizer se está ou não no cio, mas o momento pra inseminar é o acompanhamento reprodutivo. 
O veterinário vai receber a ficha de rufiação, vai pegar as éguas que estão no cio e vai palpar essas éguas. E também se possível fazer exame ultrassonográfico. Até que eu faca a detecção do folículo pré ovulatório (3,5cm). Quando eu encontro um folículo pré-ovulatório, eu indico quando eu vou fazer a inseminação.
A ovulação acontece 24-48 horas antes do final do cio. Então é em torno de 5, 6 a 7 dias.
Vc tem indivíduos diferentes, então tem que prestar atenção nisso, tem fêmeas que está com ovulação no 4º dia, ai como vc não inseminou no 3º dia, vc perdeu aquele cio.
(diferente da vaca que tem 18 horas de cio, se ela deu cio de manha vc insemina à tarde, não tem como errar). A égua tem 7 dias de cio, é vc que vai determinar quando vai inseminar.
Descongelamento do sêmen
Posso trabalhar com o sêmen fresco, resfriado e congelado. 
O sêmen fresco ou resfriado é só pegar e inseminar, não precisa aquecer o sêmen resfriado, o próprio trato reprodutor da égua aquece.
Sêmen congelado não, vc tem que descongelar. Vc descongela: 37ºC/1min em banho maria, pego 8 palhetas, coloco no banho Maria e deixo por 37ºC por 1 minuto.
Vamos inseminar. Temos3 técnicas pra IA.
Técnicas para realização da IA
IA no corpo uterino / IA convencional
É simples, barata e fácil de fazer. Pra fazer essa inseminação do CL, agente vai precisar de uma pipeta pra IA, que é uma pipeta plástica, descartável, barata, uma vez que vc usa, joga fora. Precisa de uma seringa (o ideal é sem embolo de borracha, porque essa borracha tem uma resina tóxica para o SPTZ. Ou então uso a seringa comum e insemino rápido, evito deixar muito tempo na seringa) e uma luva de palpação. 
Vc vai colocar o sêmen na seringa (seja qual for, fresco, resfriado ou congelado). 
O congelado está nas palhetas, só que são 8 palhetas, então vc pega as 8 palhetas, corta e vc coloca tudo na seringa.
Vc vai colocar a pipeta na palma da mão, introduz a 45º a pipeta, encontrou a cérvix, passa a pipeta em baixo do dedo, passou a pipeta, quando a pipeta tiver aproximadamente 2 cm no corpo do útero vc deposita o sêmen. 
É uma técnica convencional, estou colocando o SPTZ bem na entrada do útero. Usando o bom senso, que tipo de sêmen uso nessa técnica?
Nessa técnica eu uso fresco ou resfriado de boa qualidade. O congelado também pode ser usado, só que o seu resultado vai ser menor, porque tem outras técnicas melhores para usar o sêmen congelado.
Usando o bom senso é uma técnica pra sêmen de boa qualidade, normalmente sêmen fresco ou resfriado de boa qualidade.
IA na ponta do corno uterino
Essa inseminação visa diminuir as barreiras do SPTZ. Pra trabalhar com esse tipo de técnica eu preciso saber em qual ovário que está o folículo pré-ovulatório (por isso a importância do meu acompanhamento reprodutivo). 
Qual o meu objetivo: vou depositar o sêmen o mais próximo possível daquele ovário que tem o folículo pré-ovulatório, com isso estou diminuindo as barreiras do SPTZ. 
Uso essa técnica pro sêmen congelado ou sêmen resfriado de baixa qualidade.
Posso usar pra sêmen fresco, mas é um gasto excessivo, porque a pipeta que vc usa aqui não é a mesma pipeta que a 1ª técnica, ela é mais cara do que a pipeta usada na outra inseminação (com isso o custo é maior, a da 1ª técnica custava 2 reais, essa custa 20 reais)
Como faz aqui: essa técnica requer mais habilidade, pq vc vai passar a pipeta na cérvix, ai vc vai tirar a mão da vagina e levar a mão pelo do reto, e através do reto na massagem vc vai conduzindo essa pipeta pra ponta do corno, requer um pouco mais de pratica, mas não é nada absurdo, dá pra fazer bem tranqüilo. Vc deixa próximo do corno próximo ao ovário que vai ovular. A pipeta é mais comprida e mais flexível (pq tem que fazer uma curva).
Essa técnica serve pra sêmen congelado ou pra sêmen resfriado de baixa qualidade.
Lembrando: nenhuma técnica é proibida pra outro tipo de técnica, vc só tem que pensar custo benefício.
IA na papila da tuba uterina de éguas
Essa inseminação também é chamada de inseminação por histeroscopia (endoscópio).
Vc vai usar o endoscópio para depositar o sêmen.
Essa técnica vc coloca na cara do gol, porque vc vai botar esse sêmen na entrada da tuba uterina, exatamente em cima da papila da tuba que é a junção do útero com a tuba na égua.
É uma técnica cara. Uma prenhes dessa técnica deve estar na faixa de 2 mil.
Vc faz essa técnica pra:
Sêmen mega importante que vc não pode perder, numa égua muito importante que vc não pode falhar. 
Vc não vai usar uma técnica dessa quando vc tem por exemplo, 30 eguas pra inseminar com sêmen congelado porque é muito caro. 
Traduzindo: o exemplo claro pra ser usado: imagina que vc tem um sêmen caro com transferência para uma égua cara, um embrião que vai sair caro, vale a pena vc investir numa técnica assim.
É uma técnica pra top, diferenciada. Pois é caro. 
Ex. sêmen congelado, sêmen importado (palhetas por dose: 8 se for 0,5ml) se valer a pena vc pode dividir a dose. As vezes o sêmen do garanhão é bom, mas é congelado, e é caro, o que vc faz: vale a pena vc inseminar 2 éguas com a mesma dose ao invés de 1, então vc divide a dose, coloca 4 palhetas em uma e 4 palhetas na outra. Não daria certo se fosse uma técnica convencional ou na papila do corno. 
Ex. às vezes vc está fazendo transferência de embrião, corre risco de não vir, ai vc divide a dose pra tentar inseminar 2x, faz uma inseminação, se não conseguir vc tem outra dose pra tentar de novo. Vc só divide a dose em sêmen que vale a pena.
Sêmen de baixa qualidade, custo grande e necessidade de resultado. 
Éguas
Freqüência para inseminação: 
Depende do tipo de sêmen que vc vai trabalhar.
Sêmen fresco
Ex. estou acompanhando uma égua, e ai chego no dia 4 e encontrei um folículo pré-ovulatório de 3,5 cm com flutuação 3. O que vou fazer com essa égua: Vou inseminar essa égua com sêmen fresco. O sêmen fresco tem uma duração no trato reprodutor feminino de 48 horas. Então na hora que eu deposito o sêmen na égua, ele vai durar em media 48 horas. Se eu volto nessa fazenda no dia 5 e encontro o folículo aumentado com 4 cm, e flutuação 3, o que eu faço? Nada, eu não faço nada, eu espero, porque o sêmen dura 48 horas. Ai volto no d6, ai ele estava com 4 cm e flutuação 4, o que eu faço? Eu vou inseminar.
Com sêmen fresco, eu insemino a cada 48 horas (isso equivale a dia sim dia não).
Ex. agora imagina se eu chego no dia 6 e ela estava ovulada, o que eu faço? Nada, pois deu certo, estou dentro das minhas 48 horas.
Inseminar com sêmen resfriado
Mesmo esquema, cheguei na fazenda, acompanhei, palpei, cheguei a conclusão que ela tinha um folículo de 3,5 cm e flutuação 3. Eu vou e insemino. O sêmen resfriado dura cerca de 24 horas no trato reprodutor feminino. O que vai acontecer: vou chegar no D5, imagina que eu tenho um folículo de 4cm e flutuação 4, o que eu faço? vou inseminar de novo, porque só tem 24 horas de duração.
Tenho que inseminar diariamente.
Se eu chego e ela está ovulada é porque deu certo.
Sêmen congelado
Vc tem que inseminar no máximo 2 horas antes até no máximo 2 horas depois da ovulação, porque ele só dura de 6-8 horas no trato reprodutor feminino.
Isso significa que quando vc trabalha com o congelado vc tem que ser um veterinário residente da propriedade. Quando a égua está pra ovular, vc tem que palpar de 1 em 1 hora. 
Com o sêmen congelado vc começa palpando no mínimo 4x por dia e conforme a fêmea vai se aproximando da ovulação vc vai intensificando até vc palpar de hora em hora.
Por causa disso, agente tem uma coisa pra dar um refresco pro veterinário, tenho a sincronização da ovulação. 
Sincronização da ovulação:
O que é: serve pra facilitar a sua vida. Não interessa a técnica, o tipo de sêmen, nada. 
Vc sincroniza a ovulação e com isso só precisa ir pra fazenda 1 semana depois. 
Como vai trabalhar aqui: existem 2 hormônios para sincronizar a ovulação: o mais usado é o HCG (gonadotrofina coriônica humana), que é o beta HCG, é a gonadotrofina da gestação da mulher.
É uma gonadotrofina da gestação na mulher, mas no animal ela funciona como um LH-like, que parece com o LH (fç: estimula a ovulação), então o que vc está fazendo é estimulando a ovulação dela. 
Vc tem que ter um pré-requisito pra usar o HCG: tem que ter um folículo pré-ovulatório. (porque senão não adianta vc fornecer um estimulo pra ovulação se não pode ovular)
Agente vai trabalhar com uma dose em torno de 2.500 UI via IV dose única. Espera-se a ovulação pra cerca de 30 horas após a administração. 
Como vamos usar: (fresco ou resfriado)
No D4 eu palpo e encontro um folículo pré-ovulatório. O que vou fazer: aplico o HCG. Quando eu espero que aconteça a ovulação: eu espero que aconteça a ovulação entre o 5 e o 6, então entre o 5 e o 6 é onde eu espero que ela esteja ovulando. Quando vou inseminar ela: vou inseminar no 5 (pq eu tenho que inseminar antes da ovulação. Se eu deixar pra inseminar ela no 6, vou correr o risco de inseminar ela ovulada. 
Já com o sêmen congelado:
Com o sêmen congelado vc vai fazer o HCG, vc vai continuar palpando, mas vc vai intensificar a palpação no D5 e D6. Então ao invés de ficar 3 noites sem dormir, vc fica 1 só, fica do D5 pro D6 de hora em hora palpando.
HCG: dose: 26 reais.
Vale a pena usaro HCG, pois vc paga 26 reais ao invés de ter que pagar todo um processo de inseminação de novo (espermoboy, detecção de cio, etc.)
Outro hormônio que vc pode usar é o GnRH, que é a desororina.
Usa-se igual ao HCG. (administra na veia e vc também espera a ovulação em media de 30 horas após a administração)
2ml/IV. 
Problema: desorerina tem a vida útil mais curta, então teoricamente vc tem que aplicar de 8 em 8 horas. Com isso vc tem que aplicar mais vezes. Vc tem 2 opções que vc faz: ou vc palpa de 8 em 8, se não ovulou, vc aplica. Ou vc aplica de 8 em 8h. 
(vc aplica sempre antes de ovular)
O que vc espera com a IA, com sêmen de boa qualidade:
Vc espera 60% de prenhes com a 1ª IA. E caso essa fêmea não emprenhe, na 2ª inseminação o seu índice cai, então vc espera 40% nessa fêmea.

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