ok biotec AV2 29.03.11
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ok biotec AV2 29.03.11


DisciplinaBiotecnologia da Reprodução Animal77 materiais469 seguidores
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uso esse método, é um excelente método de resfriamento.
Já o resfriamento a 5ºC, vc tem que usar o equitainer, que é um botijão. 
Equitainer: usado para resfriar, conservar o sêmen por até 48 horas após a coleta. 
Se eu quero mandar o sêmen pra um lugar que vá demorar mais de 18 horas, tem que usar o equitainer. 
Vantagens e desvantagens desses métodos:
Caixa de isopor: barato e pratico. Mas como começou a comercializar, ficou um pouco mais caro, em torno de 70 reais. Então pra isso, hoje em dia eu posso comprar um isopor, montar e usar, que é muito mais barato e vc não precisa que o proprietário te envie o isopor de volta.
Equitainer: muito mais caro, na faixa de 500 dólares. Ou um genérico, nacional, chamado bocutainer, custa em torno de 500 reais. Isso é um equipamento que se tem que devolver. Hoje em dia só usa isso quando vc não tem como usar o isopor, porque é muito incomodo, vc ter que ter sempre retornando isso. 
Porem tem cavalo que não resfria bem a 15ºC, só resfria bem a 5ºC, então ai vc é obrigado a usar o equitainer. E tem o vice-verso, ai vc tem é obrigado a usar o isopor.
Dentro de uma normalidade agente tem essas vantagens e desvantagens, mas tem um momento em que o bom senso não vai adiantar muito, porque se o meu cavalo não resfria bem a 15º, eu tenho que mandar em 5º, ou seja, tenho que mandar no equitainer pra Macaé por exemplo. 
Importância dessa temperatura
O sêmen quando ele sai de 37ºC, que é a temperatura que agente coletou ele, e chega a 15ºC, ele não faz lesão estrutural. É por isso eu posso usar uma caixa de isopor, porque posso simplesmente abrir a caixa, colocar no isopor e fechar a caixa. Posso fazer isso porque não tem lesão de membrana plasmática nem de citoesqueleto do SPTZ.
Porém pra ele sair de 15ºC pra chegar a 5º c, eu tenho que ter um controle da temperatura, porque aqui é a faixa de temperatura que ele pode fazer lesão de membrana plasmática e citoesqueleto. Então como tem que ser essa queda de temperatura: tem que cair de 0,05ºC/min até chegar a 5ºC (não precisa decorar isso). De 15ºC até 5ºC tem que ir caindo a temperatura 0,05ºC por minuto até chegar a 5ºC, por isso que eu preciso do equitainer, porque o equitainer tem uma parede que controla essa temperatura, e no isopor eu não tenho isso.
Coletei, avaliei meu sêmen, aprovei. 
Vou resfriar:
Todo resfriamento tem que ter proteção porque mesmo submetendo o SPTZ a temperaturas positivas, é frio, então eu tenho que proteger ele. Por isso eu vou lançar mão de diluidores de sêmen, esses diluidores são simples e baratos. 
O que contem um diluidor de sêmen de resfriamento: 
Protetor de membrana (pra proteger a membrana do frio), geralmente vc encontra o leite, que é o protetor de membrana mais utilizado pra resfriamento do eqüino. 
Alem disso o diluidor de sêmen tem açúcar, que serve de energia para o SPTZ. 
Substância tamponante, pra evitar variações de pH. 
Antibiótico, pra evitar o crescimento de MO. 
E o extensor é o diluente (água destilada, água miniquê, qualquer coisa pra misturar isso tudo).
Hoje em dia vc não precisa fazer porque já vem em laboratório. São práticos porque já vem pronto, tem uma serie de diluidor que já vem pronto e barato. Vem no saquinho liofilizado e o diluente, é só misturar o pó no liquido que está pronto (15-20 reais).
No 1º resfriamento vale a pena vc ter pelo menos 3 diluidores e testar com qual o cavalo fica melhor. Vc coloca um pouco de sêmen com cada diluidor.
A diluição do sêmen deve ser feita na proporção de 2:1. 2 partes de diluidor para 1 parte de sêmen. Como assim: agente tem um padrão de diluição, isso em resfriamento é um acordo entre cavalheiros, porque não existe uma lei do ministério. Então se chegou a um acordo que o ideal é uma dose de 1000x106 sptz e o volume de 10 a 50ml (x=30ml)
Pra vc chegar nessa diluição vc faz um cálculo, que vai em cima da concentração de sêmen, em cima da concentração de dose (o que muda é a concentração de dose), etc.
Se eu colocar menos que 2:1, ou seja, se eu diluir 1:1 o SPTZ compete muito pelo substrato, ai vc tem perda. Por isso que o mínimo recomendado é 2:1. Se vc quiser diluir 4:1, 3:1, vc pode, geralmente em garanhões que tem a concentração mais alta e vc pode diluir mais. Quando o garanhão tem uma concentração mais baixa vc dilui 2:1. 
Vc vai diluir esse sêmen envasando no refil de mamadeira. (Envase). O frasco coletor de sêmen de eqüino é uma mamadeira mesmo, é em mamadeira porque o volume é grande (50-250ml), já no bovino é um tubinho, mas no eqüino tem que ser mamadeira porque tem que caber no mínimo 50ml. 
Pra vc não ter muitas mamadeiras ou ter que ficar higienizando essa mamadeira, vc coloca dentro da mamadeira um saquinho de sacolé. 
Tem um saquinho americano que já é graduado e vc congela o leite no saco que também pode ser usado. 
Cuidado: o plástico tem que ser atóxico.
Depois que coloca no saco e colocou na mamadeira, vc vai resfriar. Vc coloca num buraquinho vc coloca o gelo de vacina (gelo biológico), no outro buraquinho vc coloca o saquinho dentro do buraco. 
Se vc quiser montar o isopor vc faz o seguinte: vc pega a caixa de isopor, de um lado vc coloca a fonte de frio que vc tem (ex. gelo de vacina), do outro lado vc cola um copinho (ex. meio frasco de soro, meia garrafa de água) e cola no recipiente. Ai vc coloca o saquinho dentro desse copinho. A fonte de frio tem que estar a 15cm do saco. 
Na falta do gelo biológico, pega garrafa de água 500ml congela, coloca a garrafa dentro da caixinha, prende e manda. Vc só não pode mandar o gelo.
Equitainer: é aberta, a parede é espessa, e tem um buraco no meio, um cilindro nomeio. A idéia é essas latinhas são 2, são iguais de vacina, vc coloca no congelador, na hora de resfriar vc pega as 2 latinhas e coloca no fundo. Ai vc pega o copinho dele, bota o saquinho de sêmen dentro, coloca o copinho em cima das latinhas e fecha. A parede controla a mudança de temperatura.
Congelamento do sêmen do garanhão 
1ª coisa que agente tem que pensar, o congelamento do garanhão tem uma diferença enorme pro touro. 
Diferença: no sêmen do touro agente coleta o sêmen, bota junto com o diluidor e depois congelava. 
Aqui no eqüino não, já foi provado que no plasma seminal do eqüino porque vc tem proteínas de baixa congelabilidade, ou seja, proteínas quando congeladas causam efeitos deletérios ao sêmen, mata o SPTZ. Então quando vc congela o sêmen que tem o plasma junto, essas proteínas que tem baixa congelabilidade causariam efeitos deletérios pro SPTZ, ou seja, mata o SPTZ. Então agente só vai querer o SPTZ, eu vou tirar o plasma seminal do cavalo, como faço isso: centrifugação do sêmen. 
Só que pra esse sêmen agüentar (porque vou submeter ele a um estresse) eu faço uma diluição inicial, essa diluição inicial que é com aquele diluidor que vimos, o diluidor de resfriamento (que tem leite, açúcar, etc.) só pra ele ficar contente. Eu faço uma diluição inicial e depois da diluição inicial eu vou fazer 2 centrifugações:
1ª: centrifugação lenta por 10 minutos
Desprezo o sobrenadante. Fico apenas com o precipitado. Ai faz a: 
2ª centrifugação: centrifugação rápida por 5 minutos. (tem pressão maior nele)
O que vou obter no final: no final eu tenho um tubo, e no fundo desse tubo tenho uma massa de SPTZ.
Faz a centrifugação pra retirar o plasma seminal.
Depois que vc tem a massa de SPTZ é que vc vai adicionar o diluidor para o congelamento. 
Diluidor para sêmen congelado tem algumas diferenças para o diluidor de sêmen resfriado.
1ª coisa que agente tem que pensar é que o SPTZ vai ser submetido a um congelamento de -196ºC. Então tem que ter proteção. Então todo diluidor de sêmen pra congelamento tem que ter um crioprotetor, como por ex. o glicerol. (o mesmo que se usa pra bovino se usa pra eqüino) 
Isso é o nosso maior desafio. 
Mecanismo do glicerol:
Porque o glicerol desidrata o SPTZ, puxa água do SPTZ, por que: se vc congela uma carne com água dentro, formam-se macrocristais que rompem a fibra, e o mesmo acontece com o SPTZ, se vc não usar o crioprotetor ele forma macrocristais no