diagnostico laboratorial de doenças infeciosas
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a desvantagem é o tempo necessário para a amplifi cação. Amplifi cações de 
sinais biológicos específi cas e mais rápidas podem ser obtidas por meio de 
técnicas como a reação em cadeia da polimerase (PCR) ou a reação em ca-
deia da ligase (LCR, para DNA/RNA), como os imunoensaios enzimáticos 
(EIA, para antígenos e anticorpos), e por amplifi cação eletrônica (para os 
ensaios de cromatografi a em gás e líquido), por métodos de captura de anti-
corpos (para concentração e/ou separação) e por fi ltração ou centrifugação 
seletivas. Embora haja uma variedade de métodos disponíveis para ampli-
fi cação e detecção de sinais biológicos em pesquisa, é necessário testá-los 
rigorosamente antes que possam ser validados como ensaios diagnósticos.
DETECÇÃO DIRETA
MICROSCOPIA
O campo da microbiologia foi em grande parte defi nido pelo desenvol-
vimento e uso do microscópio. O exame de espécimens por métodos mi-
croscópicos dá rapidamente origem a informações úteis para o diagnóstico. 
As técnicas de coloração permitem que os organismos sejam vistos mais 
claramente.
O método mais simples para avaliação microscópica é a preparação a 
fresco usada, por exemplo, para pesquisar a presença de Cryptococcus ne-
oformans no líquido cérebro-espinhal (CSF), empregando tinta nanquim 
como um fundo contra o qual se visualizam estas leveduras e suas grandes 
cápsulas. Preparações a fresco iluminadas em campo escuro são também 
usadas para detectar espiroquetas em lesões genitais e para revelar a pre-
sença de Borrelia ou Leptospira no sangue. Raspados da pele e amostras dos 
pêlos podem ser examinados por meio de preparações a fresco em KOH a 
10% ou pelo método do branco de calcofl uorado sob iluminação ultraviole-
ta, para detectar elementos fúngicos como estruturas fl uorescentes. A colo-
ração de preparações a fresco \u2014 por exemplo, com lactofenol azul-algodão 
para elementos fúngicos \u2014 é freqüentemente usada para a identifi cação 
morfológica. Estas técnicas aumentam a detecção do sinal e reduzem o fun-
do, tornando mais fácil identifi car as estruturas fúngicas específi cas.
COLORAÇÃO
Coloração de Gram Sem coloração, é difícil ver bactérias nos aumentos 
(400 × a 1.000 ×) empregados para a sua detecção. Embora possam ser usa-
das colorações simples de um só passo, as colorações diferenciais são as 
mais comuns. A coloração de Gram diferencia os organismos com paredes 
celulares de peptideoglicana grossas (Gram-positivas) dos que têm paredes 
celulares de peptideoglicana fi nas e membranas externas que podem ser 
dissolvidas em ál cool ou acetona (Gram-negativas). A morfologia celular e 
as características assumidas na coloração de Gram podem com fre qüên cia 
ser usadas para categorizar os organismos corados em grupos como estrep-
tococos, estafi lococos e clostrídios (Fig. e14.1).
A coloração de Gram é par ticular mente útil para examinar o escarro 
em busca de leucócitos polimorfonucleares (PMN) e bactérias. Amostras 
de escarro de pacientes imunocompetentes com \u2265 25 PMN e < 10 células 
epiteliais por campo de pequeno aumento freqüentemente fornecem infor-
mações clinicamente úteis. Entretanto, a presença nas amostras de \u201cescarro\u201d 
com > 10 células epiteliais por campo de pequeno aumento e de múltiplos 
tipos bacterianos sugere contaminação com a fl ora oral. A despeito da di-
fi culdade em discriminar entre a fl ora normal e patógenos, a coloração de 
Gram pode provar-se útil em amostras obtidas de áreas onde há grande 
fl ora residente, se houver um marcador biológico útil (sinal) disponível. A 
coloração pelo Gram de espécimens obtidos com swabs vaginais pode ser 
usada para detectar células epiteliais cobertas com bactérias Gram-positivas 
na ausência de lactobacilos e na presença de bastonetes Gram-negativos 
\u2014 um cenário tido como um sinal de vaginose bacteriana. Similarmente, 
o exame de amostras fecais coradas para leucócitos é útil como um proce-
dimento de triagem antes de pesquisar a presença da toxina do Clostridium 
diffi cile ou a existência de outros patógenos entéricos.
O exame dos líquidos cefalorraquidiano, articular, pleural ou peritonial 
com a coloração de Gram é útil para determinar a presença de bactérias e/
ou PMN. A sensibilidade permite a detecção sempre que há > 104 bactérias 
por mililitro. A centrifugação é freqüentemente realizada antes da colora-
ção para concentrar os espécimens em que se supõe existir um pequeno 
número de organismos. O sedimento é examinado depois de corado. Este 
método simples é par ticular mente útil para o exame do CSF em busca de 
bactérias e células brancas do sangue ou do escarro para detectar a presença 
de bacilos ál cool-ácido resistentes (BAAR).
O diagnóstico laboratorial de uma infecção requer a demonstração \u2014 di-
reta ou indireta \u2014 de agentes virais, bacterianos, fúngicos ou parasitários 
nos tecidos, líquidos ou excreções corporais do hospedeiro. Os laboratórios 
de microbiologia clínica são responsáveis pelo processamento destes espé-
cimens e também pela determinação da sensibilidade dos patógenos bacte-
rianos e fúngicos aos antibióticos. Tradicionalmente, a detecção de agentes 
patogênicos apóia-se em grande parte na observação microscópica dos pa-
tógenos no material clínico ou no crescimento dos mi cror ga nis mos no labo-
ratório. A identifi cação é geralmente ba sea da nas características fenotípicas, 
tais como os perfi s de fermentação das bactérias, os efeitos citopáticos dos 
agentes virais sobre as culturas de tecidos e a morfologia microscópica dos 
fungos e parasitos. Estas técnicas são confi áveis, mas, com fre qüên cia, demo-
radas. O uso de sondas de ácido nucléico está se tornando, cada vez mais, um 
método-padrão para a detecção, quantifi cação e/ou identifi cação, no labora-
tório de microbiologia clínica, e vem substituindo gradualmente a caracteri-
zação fenotípica bem como os métodos de visualização microscópica.
MÉTODOS DE DETECÇÃO
A reavaliação dos métodos empregados no laboratório de microbio-
logia clínica levou ao desenvolvimento de estratégias para a detecção de 
agentes patogênicos por meio de sistemas de detecção de sinais biológicos 
não-visuais. Grande parte dessa metodologia baseia-se no uso de sistemas 
eletrônicos de detecção, envolvendo computadores relativamente baratos, 
mas sofi sticados, ou sondas de ácido nucléico dirigidas a alvos específi cos 
no DNA ou RNA. Este capítulo discute os métodos atualmente disponíveis 
e os que ainda estão sendo desenvolvidos.
SINAIS BIOLÓGICOS
Um sinal biológico é um material que pode ser diferenciado, de modo 
reprodutível, de outras substâncias presentes no mesmo ambiente físico. 
Os pontos-chave no uso de um sinal biológico (ou eletrônico) consistem 
em distinguí-lo do ruí do de fundo e traduzi-lo em informação signifi cante. 
Exemplos de sinais biológicos aplicáveis à microbiologia cl\ufffd\ufffdnica são os com-
ponentes estruturais das bactérias, fungos e vírus; antígenos específi cos; 
produtos fi nais do metabolismo, se qüên cias específi cas de bases de DNA 
ou RNA; enzimas, toxinas e outras pro teínas; bem como polissacarídios de 
superfície.
SISTEMAS DE DETECÇÃO
Um detector é usado para sentir um sinal e para discriminar entre o sinal 
e o ruí do de fundo. Os sistemas de detecção variam desde os olhos treinados 
de um técnico que avalia variações morfológicas até sensíveis instrumentos 
eletrônicos, como aparelhos de cromatografi a em gás e líquido acoplados a 
sistemas computadorizados para a análise do sinal. A sensibilidade com que 
os sinais podem ser detectados varia amplamente. É essencial usar um siste-
ma de detecção que possa discernir pequenas quantidades do sinal mesmo 
na presença de ruí do biológico de fundo \u2014 isto é, que seja ao mesmo tempo 
sensível e específi co. Sistemas de detecção comuns incluem a imunofl uo-
rescência; a quimioluminescência para sondas de DNA/RNA; a detecção 
de ácidos graxos de cadeias curtas ou longas por ionização em chama; a 
detecção da utilização de