diagnostico laboratorial de doenças infeciosas
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ao alvo (o sinal biológico), uma variedade de 
estratégias pode ser empregada para detectar, amplifi car e/ou quantifi car o 
complexo alvo-sonda (Fig. e14.3).
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Doenças Infecciosas
PARTE VII
Copyright © 2008, McGraw-Hill Company. Todos os direitos reservados.
Sondas para a detecção direta de patógenos em espécimens clínicos Sondas 
de ácido nucléico são usadas para a detecção de patógenos em espécimens 
clínicos sem amplifi cação da cadeia-alvo de DNA ou RNA. Tais testes de-
tectam uma se qüên cia de bases relativamente curta, específi ca para um 
determinado patógeno, presente no DNA ou no RNA de cadeia única; a 
detecção se faz pela hibridização de uma se qüên cia complementar de ba-
ses (a sonda) acoplada a um sistema \u201crepórter\u201d que sinaliza a detecção. Há 
sondas de ácido nucléico disponíveis comercialmente para detecção direta 
de vários patógenos bacterianos e parasitários, como Chlamydia trachoma-
tis, N. gonorrhoeae e Streptococcus do grupo A. Um ensaio combinado que 
detecta e diferencia os agentes de vaginite/vaginose (Gardnerella vaginalis, 
Trichomonas vaginalis e espécies de Candida) também já foi aprovado. Há 
um sortimento de sondas disponíveis para a confi rmação da identidade de 
patógenos cultivados, incluindo alguns fungos dimórfi cos, Mycobacterium 
spp. e outras bactérias (p. ex., Campylobacter spp., Streptococcus spp. e 
Staphylococcus aureus). As sondas empregadas na detecção direta de pató-
genos bacterianos são freqüentemente dirigidas para se qüên cias altamente 
conservadas de RNA ribossômico 16S, para as quais há, em uma célula bac-
teriana, muito mais cópias do que para qualquer outra se qüên cia de DNA 
genômico. A sensibilidade e a especifi cidade dos ensaios com sonda para a 
detecção direta são comparáveis às dos ensaios mais tradicionais, incluindo 
o EIA e a cultura.
Em uma outra forma de ensaio com sonda, chamado captura de híbri-
dos, uma sonda de RNA hibridiza-se com um alvo de DNA, e o resultante 
híbrido DNA/RNA é capturado sobre um suporte sólido por um anticor-
po específi co para híbridos DNA/RNA (concentração/amplifi cação) ou 
detectado por um anticorpo marcado por quimioluminescência, especí-
fi co para híbridos DNA/RNA. Há ensaios de captura de híbridos disponí-
veis para C. trachomatis, N. gonorrhoeae, citomegalovírus e papilomavírus 
humano.
Muitos laboratórios desenvolveram suas próprias sondas para patógenos; 
entretanto, a lei federal dos EUA restringe o uso de tais testes à pesquisa, a 
menos que um protocolo de validação de métodos de testes diagnósticos 
tenha sido aplicado.
Estratégias dos testes de ampli\ufb01 cação de ácidos nucléicos Em teoria, uma 
única se qüên cia-alvo de ácido nucléico pode ser amplifi cada até alcançar 
níveis detectáveis. Há várias estratégias para testes de amplifi cação de áci-
do nucléico (NAAT), incluindo a PCR, a LCR, a amplifi cação por deslo-
camento de cadeia e replicação auto-sustentável de se qüên cias. Em cada 
caso, a amplifi cação exponencial de uma se qüên cia de DNA ou de RNA 
específi ca para o patógeno depende de iniciadores que podem hibridizar-
se a se qüên cias-alvo. O ácido nucléico amplifi cado pode ser detectado de-
pois que a reação se completa ou (na detecção em tempo real) à medida 
que a amplifi cação prossegue. A PCR, o primeiro e ainda o mais comum 
dos NAAT, requer o aquecimento repetido do DNA, para separar as duas 
cadeias complementares da dupla hélice, a hibridização da se qüên cia do 
iniciador à se qüên cia-alvo apropriada, a amplifi cação do alvo empregando 
a PCR para estender a cadeia complementar, e a detecção do sinal por 
meio de uma sonda marcada. Métodos para a monitoração da PCR após 
cada ciclo de amplifi cação \u2014 através da incorporação de corantes fl uo-
rescentes ao DNA durante a primeira extensão ou do emprego de sondas 
fl uorescentes capazes de transferir energia de ressonância fl uorescente \u2014 
reduziram agora o tempo necessário para detectar um alvo específi co. A 
sensibilidade dos NAAT é muito maior que a dos métodos tradicionais, 
como a cultura. Entretanto, é importante o cuidado com que os ensaios 
são realizados, porque a contaminação cruzada do material com DNA ou 
RNA de outras fontes (mesmo em baixos níveis) pode causar resultados 
falsos positivos. Um outro NAAT emprega a amplifi cação mediada por 
transcrição, na qual uma se qüên cia-alvo de RNA é convertida em DNA, 
Resíduos
Lise
Extração
Calor
Calor
DNA/RNA
Célula intacta 
(com DNA/RNA)
ss
DNA/RNA
ssDNA/RNA ssDNA/RNA ssRNA
Sonda de DNA
Híbrido de
DNA/RNA
ssDNA/RNA
Hibridiza
Hibridiza
Hibridiza
Repórter
Hibridiza
Sonda Sonda (bDNA)
Detecção
direta
Amplificação
do alvo
Amplificação
do sinal
Captura de
híbridos
Sonda e 
repórter
Extensão
da cadeia
complementar
Detecção
DetecçãoDetecção Detecção
20 a 30 ciclos
Anticorpo de 
captura sobre um
suporte sólido
Anticorpo 
e repórter
Fig. e14.3 Estratégia para amplifi cação e/ou detecção de um complexo 
sonda-alvo. O DNA ou o RNA extraído dos mi cror ga nis mos é aquecido para criar 
um DNA/RNA de cadeia única (ss) contendo as se qüên cias-alvo apropriadas. Estas 
 se qüên cias-alvo podem ser hibridizadas diretamente (detecção direta) com son-
das ligadas a uma molécula repórter; elas podem ser ampli\ufb01 cadas por ciclos re-
petidos de extensão da cadeia complementar (reação em cadeia da polimerase) 
antes da ligação de uma sonda repórter; ou o sinal alvo-sonda original pode ser 
ampli\ufb01 cado por hibridização com uma sonda adicional contendo múltiplas cópias 
de uma se qüên cia-alvo repórter secundária (DNA de cadeia rami\ufb01 cada, ou bDNA). 
Os híbridos de DNA/RNA podem ser \u201ccapturados\u201d sobre um suporte sólido (captura 
de híbridos), por meio de anticorpos dirigidos para os híbridos de DNA/RNA usa-
dos para concentrá-los, sendo um segundo anticorpo, acoplado a uma molécula 
repórter, ligado ao híbrido capturado.
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CAPÍTULO
 e14
Diagnóstico laboratorial das doen ças infecciosas
Copyright © 2008, McGraw-Hill Company. Todos os direitos reservados.
que é então exponencialmente transcrito no próprio alvo de RNA. A van-
tagem deste método é que é necessário apenas um único passo de aqueci-
mento/hibridização para que ocorra a amplifi cação. No momento, existem 
no mercado ensaios de amplifi cação para Mycobacterium tuberculosis, N. 
gonorrhoeae, C. trachomatis, Mycoplasma hominis, Streptococcus do grupo 
B e S. aureus resistente a meticilina. Novamente, muitos laboratórios já 
usaram a taq polimerase disponível no comércio, as se qüên cias-sondas e 
reagentes específi cos para o análito (ASR) para desenvolver ensaios diag-
nósticos \u201cfeitos em casa\u201d. Questões relacionadas com o controle de qua-
lidade, interpretação dos resultados, processamento das amostras e exi-
gências legais retardaram o desenvolvimento comercial de muitos kits de 
ensaio diagnóstico.
O reconhecimento de bactérias que seriam de difícil identifi cação por 
outro modo envolve uma amplifi cação inicial, por PCR, de uma região alta-
mente conservada do rDNA 16S. O seqüenciamento automatizado de várias 
centenas de bases é então realizado e os dados da se qüên cia são confronta-
dos com os existentes em grandes bancos de dados, contendo informações 
sobre as se qüên cias de milhares de diferentes mi cror ga nis mos. Embora não 
seja tão rápido quanto os outros métodos e seja ainda relativamente caro 
para o uso de rotina no laboratório de microbiologia clínica, o seqüencia-
mento 16S está se tornando o método defi nitivo para a identifi cação de or-
ganismos raros ou de difícil cultivo.
Estratégias dos testes quantitativos de ácido nucléico Com o advento de 
novos esquemas terapêuticos para a doen ça associada ao HIV, para a infec-
ção por citomegalovírus e para as infecções pelos vírus das hepatites B e C, 
a resposta ao tratamento passou a ser monitorada pela determinação do ge-
nótipo e da \u201ccarga viral\u201d em vários momentos após o início do tratamento. 
Há NAAT quantitativos disponíveis para o HIV (PCR), para o citomegalo-
vírus (PCR) e para