poligrafo_Bioquimica_Estrutural_2010

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PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO GRANDE DO SUL 
FACULDADE DE BIOCIÊNCIAS 
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR 
CURSO DE FARMÁCIA 
 
 
 
 
 
 
AULAS PRÁTICAS 
 
 
 
 
BIOQUÍMICA 
ESTRUTURAL 
 
 
 
PROFESSORAS: 
CARLA DENISE BONAN 
ROSANE SOUZA DA SILVA 
MAURICIO REIS BOGO 
 
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INSTRUÇÕES GERAIS E MATERIAL BÁSICO DE LABORATÓRIO 
 
A Qu ímica é uma c iên c ia expe r iment a l , po r tan to a aqu is ição do con hec imen to químico to rna -
se ma is ag radáve l , e f i c ien te e pe rmanente quando a teo r ia é a ss oc iada à p rá t i ca . A u t i l i zação de 
expe r imentos p rop ic ia ao a luno o desen vo lv imen to de a t i t udes e hab i l idade s ; a co mpreensão ma is 
c ient í f i ca dos fa tos pe rmi te esta be lece r re laçõe s com con ce i tos teó r ic os , dando- l he co nd ições pa ra 
melho r compreender os d i fe rent es p ro cessos quím icos que oco r rem ao seu redo r e no seu p róp r io 
co rp o. 
Sa l ien ta -se que , o suc esso de uma at i v idade p rá t i ca , ta mbém es tá d i re ta mente re la c i onado 
com a i n f ra -es t ru tu ra do labo ra tó r io (e qu ipamen tos , rea gen tes, v id ra r ia ) , ma s , pr inc i pa lmen te , com o 
cu idad o, o rgan ização e l impez a e mprega da na sua execução . 
Os labo ra tó r ios de quí mic a nã o p rec isam se r luga res pe r igosos de t raba lho , d esd e que ce r tas 
prec auç ões e le men ta res se jam t omad as e que cada ope rado r se cond uza com bom senso e a tenç ão, 
apesa r dos mu i tos r i scos em p otenc ia l que ne les ex is ta . 
Ac identes no l abo ra tó r i o oco r rem, mui to f reqüen temente , em v i r tu de da p ressa ex cess iva na 
obte nção de resu l t ados . Cada um que t raba lha deve te r responsab i l idade no seu t raba lho e ev i ta r 
a t i tud es impensada s de i gno rânc ia ou p ressa qu e pos sam aca r re ta r um ac idente e poss íve is danos 
pa ra s i e pa ra os dema is. Deve p res ta r a tenç ão a su a vo l t a e se p reven i r co nt ra pe r igos que possa m 
su rg i r do t raba lho d e out ros, ass im c omo do seu p róp r io . O quí mic o de l abo r a tó r io deve, po r tanto , 
adot a r s empre uma a t i t ude a tenc iosa , c u id adosa e metód ica no que faz . Deve , pa r t i cu l a rmen te , 
concen t ra r -se no t raba lho que faz e não pe rmi t i r qua lque r d is t ração enquan to t ra ba lha. D a mesma 
fo rma , n ão deve d i s t ra i r os dema is desnecessa r i amen te . 
 C uidados nece ssár i os du rante a rea l i zaçã o de exp er ime ntos: 
To dos os p rodu tos quí mic os são tó x i cos ; possuem a prop r iedade de causa r danos ou a mo r te . 
Apesa r de que a t ox idade se ja uma ca rac te r í s t i ca ine ren te a todos os compost os, a quan t idade ou 
dose de um p rodu to químico nec es sá r ia pa ra cau sa r e fe i tos espec í f ic os va r ia conside ra ve lmente . 
Parace l sus (1 943 -1541) fo i o p r ime i ro a expo r a re lação e x i s tente ent re dose e e fe i to : “Todas 
as substânc ias são venen osas ; não e x i s te nenhuma que não o se ja . A do se co r re ta d i f e renc ia u m 
veneno de u m remédio ” . 
A dose, as p rop r iedades quí micas e f í s i cas da subs tânc ia e as ca rac te r í s t i ca s f i s io lóg i cas do 
ind iv íduo exposto de te rminam o g rau de to x idade . Os e fe i tos t óx icos dos p ro dutos qu ímicos d i fe re m 
ent re espéc ies e c l as ses , ass im como também dent ro de las mesmas . 
Sem importa r c omo o p rodu to quím ic o ent ra no co rpo, te m luga r um de do i s proc essos : o 
produ to é e l iminado ou é re t id o . Os d ive rsos mecan is mos de e l imina ção (exa lação da resp i ração, 
suo r , u r in a , feze s) , em ce r to pe r íodo de te mpo, l i be r am o o rga n is mo do p rodu t o qu ímico. Pa ra a lguns 
produ tos químicos , a e l im inaçã o pode s e r co isa de d i as ou meses; pa ra ou t ros , o reg ime de 
e l im inaç ão é tão len to qu e podem pe rmanece r no co rpo po r t oda a v ida . 
Pa ra ev i ta r ac identes é p r imord ia l que o a l uno as suma uma pos tu ra cu idadosa e responsáve l du rante 
os exp e r imen tos . Ass im, a le i tu ra a tenc ios a d as no rmas aba i xo, to rna -se necessá r ia : 
 3 
 
1. Não se deve c omer , bebe r ou fumar den t ro do labo ra tó r io . 
2 . Cad a ope rado r deve usa r um aven ta l ob r iga tó r io , sapat os fechados e cabe los p res os . Nã o se rá 
pe rmi t i do ex ec uta r p rá t i ca sem o a ven ta l , que deve se r d e b r im ou a lgodão grosso e , nunca d e 
te rga l , ny lon ou out ra f ib ra s in té t ic a in f lamá ve l . Semp re que po ss íve l , usa r ócu los d e se gu rança , 
po i s cons t i t uem p ro teção ind ispens áve l pa ra os o lhos cont ra resp ingos e ex p losões . Não é 
recomendáve l o uso de len tes de conta to a o manipu la r co mpos tos t óx icos ou i r r i t an tes à pe le , 
use luvas de bo r rach a. 
3 . Não p ipe ta r p roduto a lgum co m a boca . 
4 . Não usa r p roduto a lgu m que não se ja dev id amente ro tu lado. 
5 . Não l eva r as mãos à boca nem aos o lhos quando es t i ve r manusea ndo p rodu tos . 
6 . Ver i f ic a r s ob re a tox ide z e in f lamab i l id ade dos p rod u tos u t i l i zado s. 
7 . Disc ut i r co m o p ro fes so r a respe i to do expe r imento e , em h ipó tes e a l guma rea l iz á - l o sem o seu 
con sen t imen to . 
8 . A man ipu lação de compos tos tóx icos ou i r r i tan tes , ou quando houv e r de sp rend imen to de vap o res 
ou gases, deve se r f e i ta na c ape la . 
9 . Leia com a tenção cada e xpe r ime nto an tes de in ic i á - lo . Mon te a apa re lh agem, faça u ma ú l t ima 
rev isão n o s is tema e, só então , comece o expe r imen to . 
10. Ot imi ze o seu t ra ba lho no la bo ra tó r io , d iv id indo o t raba lho en t re os co mponen tes de sua equ ipe . 
An tec ipe cada ação no labo ra tó r i o , p revendo possí ve is r i sc os pa ra você e seus v iz inhos . 
Ce r t i f ique -s e, ao acender uma chama, de que não ex i s tam so lven tes p róx imos e des tapados, 
esp ec ia lmen te aqu e le s ma is vo lá te is : é te r e t í l ico , é ter de pe t ró leo , ace ta to de e t i la . Mes mo uma 
cha pa ou man ta de aque ciment o quen tes pode m ocas iona r incênd ios qua ndo em conta to co m 
so l ve ntes como é te r ou CS2. 
11. Se ja c u idadoso se mpre que mis tu ra r do is ou ma is compos tos. Mu i tas mi stu ras são exoté rmicas 
(ex : H 2SO 4 conc. + H 2 O), ou a i nda , podem l i be ra r gases tóx ic os . M i s tu re os r eagen tes 
vag a ros amente , com ag i tação e , se necessá r io , res f r iamen to de qua lque r re f l uxo ou des t i laç ão. 
Ut i l ize ped ras de po rce lana, a f im de ev i ta r aquec imen to ex cess ivo . Ao ag i t a r l íqu idos vo lá te is 
em fun i s de decan tação , equ i l i b re a p res são do s is tema ab r indo a to rne i ra do f un i l , ou 
des tapando-o . 
12. Caso i n te r rompa a lgu ma expe r iênc ia p e la me tad e, ou tenha que gua rda r a lgum p ro duto ro tu le -o 
c la rame nte . O ró tu lo dev e con te r : nome do p rodu to , data , nome da equ ipe. 
13. Só de r rame compos tos o rgân icos l íqu ido s na p ia , d epo is de es ta r segu ro de que não sã o tó x i cos 
e de qu e nã o ha ve rá pe r igo de reações v io lentas ou desp rend imen to d e gases . De qua lque r 
modo , faça-o com ab undância d e água c o r ren te . 
14. Cad a equ ipe dev e rá , no in í c i o e no f i na l de cada au la , le va r o ma te r i a l de v id ro u t i l i zado, l impa r 
a bancada , enf im, man te r o l abo ra tó r io LIMP O . 
 
ATIVIDADE 01 
REAÇÕES DE IDEN TIF I CAÇÃO DE A MINOÁC ID OS E PROTE ÍN AS 
1. Rea ção da Ninhidr ina 
Aminoác idos que ap resen tam g rupo á -a mino l i v re , qua ndo aquec ido s em presença d e 
n ih id r ina , fo rmam um p rodu to de co lo ração pú rpu ra . A co lo ração ob t ida é p ropo rc i ona l à 
concen t ração de aminoác idos ex is ten te . Es ta reaç ão dá resu l tado pos i t i vo para aminoác idos, 
pro te ína s e out ras a minas p r imár ias. P ro l ina e h id rox ip ro l ina , po r se rem iminoác idos, dão 
co lo ração a mare la . Du ra nte a reaç ão, há f o rmaç ão de CO 2 e amôn ia . P ode-se de te rmina r a 
quan t idade de 
á -aminoác idos, med indo -se a s qu ant idades que s e p roduz em des tas dua s subs tânc ia s. Out ra 
fo rma de med i r a c onc ent ração de aminoácidos é a t ravés da i n te ns idade de co r p roduzida, 
u t i l i zando -se o método co lor imét r i co . 
 
Té cn ica 
1 . Prepara r um banho-mar ia fe rvente . 
2 . Co loca r em um t ubo de ensa io 5 mL da so lução de o voa lbu mina . 
3 . Adic iona r 0 ,5 mL de so luç ão d e n inh id r ina . 
4 . Aquece r em banho -mar ia f e rvente po r 3 m inu tos . 
5 . Ano ta r a co lo raçã o desenvo lv ida. 
 
2. Rea ção de Biur e to 
Essa reaç ão iden t i f i ca a p re sença de l igações pept íd icas na moléc u la em es tudo. O reat i vo 
de B iu re to é compos to por su l fa to de cob re   e t a r ta ra to de sód io e potáss io a lca l in izado s. A 
pos i t i v ida de da rea ção ver i f ic a -se pe lo a pa rec imento de uma c o lo raç ão q ue va r ia d o rosa a o 
v io le ta . Em meio a l ca l in o , o íon cúp r ico do rea t i vo fo rma um c omp lexo com c ompos tos que 
con tém do is g rupos ca rbami las (– CON H 2 ) un idos d i re tament e a t ravé s de um á tomo de ca rbono o u 
n i t rogê n io . O apa re c imen t o da co lo raç ão deve -se à fo rmaçã o de um c omp lexo de coo rdenação do 
íon cúp r ico com á tomos de n i t rogên io da l igação pept íd ica . E ss a reação só s erá pos i t i va q uando 
o mate r ia l ana l i sado fo r co mpos to de pe lo menos duas l igações pep t íd icas ( t r ipep t ídeos ) . As 
so l uç ões de po l ipe pt í deos ou p ro te ínas po r a p resenta rem vá r ia s l igações pept íd icas dão reação 
pos i t i va . 
 
C O C O 
 
 H N N H 
 
 H C R R C H 
 Cu2 + 
C O C O 
 
 H N N H 
 
 H C R H C R 
 
Té cn ica 
1 . Co loca r em um t ubo de ensa io 3 mL de so lução de o voa lbu mina . 
2 . Adic iona r 1 mL d o rea t i vo de B iu re to . 
3 . Ano ta r a co lo raçã o desenvo lv ida. 
 
 
 5 
 
3. Rea ção X antoproté ica 
Essa reaçã o te m co mo f i na l i dade ide nt i f i ca r a p re sença de aminoác idos que poss uem ane l 
benzên ico subs t i tu ído na mo lécu la . Rad ica i s a romát ic os re agem com o ác ido n í t r i co pa ra fo rma r 
n i t ro -de r iv ados que se to rnam a la ran jad os e m me io a lca l ino . A reação é pos i t i va quando ap a rece 
uma co lo ra ção a la ra n jada no tubo de ens a io onde oco r reu a reação . Os aminoác idos que 
resp ondem pos i t iv amen te a es te tes te sã o a t i ros ina e o t r ip to fano . Na s c ond ições em que a 
reaç ão xan top ro té i ca é rea l i zada, o benzeno da fen i la lan ina não é r eat i vo o s u f i c i en t e pa ra reag i r 
pos i t i vamen te a est e t est e . 
 
Té cn ica 
1 . Co loca r em um t ubo de ensa io 3 mL de so lução de o voa lbu mina . 
2 . Adic iona r 1 mL de ác ido n í t r ico concen t rado e ob serva r a fo rma ção de um p rec i p i tad o 
b ranco. 
3 . Aquece r co m cu idado , obs erva r o que oco r re com a co r do p rec ip i tado e ano ta r . 
4 . Esf r i a r e m água c o r ren te 
5 . Gote ja r h id róx ido de sód io a 4 0% a té o su rg imento da co r la ran ja . 
6 . Ano ta r a co lo raçã o. 
 
4. Rea ção de Mi l lon 
As p ro te í nas qu e ap res enta m am ino ác idos com grupo fenó l ic o na sua es t ru tu ra , na 
pres enç a do reat iv o de Mi l lon , dese nvo lvem co lo ra ção ve rme lha . A reação oco r re mediant e 
aquec imen to . O reag ente de Mi l lo n é p repa rado a t ra vés da d isso luç ão de me rcú r io em ác ido 
n í t r ico concen t rado. D es t a fo rma , a so lução ob t ida deve c ont e r n i t ra to merc uros o co m t raços de 
ác i do n i t roso. 
Té cn ica 
1 . Co loca r em um t ubo de ensa io 2 mL de so lução de o voa lbu mina . 
2 . Adic iona r 5 gota s de reagen te de Mi l lon . 
3 . Aquece r em banho -mar ia f e rvente du rante 2 minu tos . Ano ta r a co lo ração . 
 
5. Rea ção de Ami noáci dos Sul fur ados 
As p ro te ína s q ue ap rese ntam enxo f re na sua e st ru tu ra reagem c om ace ta to de chumbo e m 
meio bás ico , p rodu zindo um p re c i p i t ado p re to (P bS ). Es ta reação acontece med ian te 
aquec imen to . 
Té cn ica 
1 . Co loca r nu m tubo de ens a io 2 mL de so lução de ovo a lbumina , 1 mL de so lução d e 
h id róx ido de s ód io 2 ,5 N e 1 mL d e s o lução de ace ta to de chumbo . 
2 . Aquece r e obse rva r o que oco r re . 
Es ta reação ca rac te r i za -se pe la l ibe ração de H 2S de aminoá cidos e p ro te ínas que 
con tenham enxof re na sua moléc u la . 
O p rec ip i tado p re t o f o rma-se a t ravés da seg u in te reação : 
Pb + 2 + S - 2 PbS 
P ro te í nas que ap rese ntam a met ion ina na su a est ru tu ra , não dã o a reação desc r i t a . 
Exp l i ca r . 
 
 
 
 
 
 
 
 6 
 
 
ATIVIDADE 02 
 
CURVA DE NEUTRALIZAÇÃO DA GLICINA 
 
 
Fundame nto: Os aminoác idos n eut ros ap resenta m do i s g rupos ion izáve is : o  -N H 2 e o  -
COOH. A g l i c ina é o ma is s imp les de todos os a minoác idos , tendo R=H, s endo , po r ta nto , H 2 N -
CH 2 -COOH. Colocando a g l i c ina em me io con tendo HCl 0 ,1N, todos os seus g rupos f ic a m 
pro tonados : + 3 HN -C H 2 -COOH . Se à so l uç ão ác i da de g l i c i na ad ic iona -se len tamente NaOH, os 
pró tons h id rogên io (H + ) do meio vão send o neut ra l izados pe las OH - d a base . Em conseqüênc ia , 
d im inu i a concent raç ão dos p ró tons , o que é compro vad o pe lo aumen to de pH. A med ida que o pH 
da so lução se a p rox ima de 2 ,0 , o s g rupos -C OOH começam a en con t ra r fac i l i dade pa ra s e 
d is so c ia r , l i be ra ndo os seus H + pa ra o me io , os qua is são também neu t ra l i zad os pe los g rupo s OH - 
ad i c i onados . Nes tas cond içõ es , o pH da so lução so f re modi f i cações mui to pequenas , in d icando 
que os g rupos -C OOH es tão tamponando a base ad ic ionada. P róx imo a pH 2 ,3 , o p a r con jugad o 
com pode r ta mponante é  -C OOH / -C OO - : 
CH 2 - NH 3 + CH 2 - NH 3 + 
 + OH -  + H 2 O 
COOH C OO - 
 
A med ida que o pH da so luç ão va i se a fas tan do de 2 ,3 , a concent raçã o de -C OOH 
d iminu i e a base vo l ta a neut ra l iz a r os H + do me io , d im inu indo s ua co ncen t ração, o que 
nova men te pode se r c omprov ado p e lo aument o de pH. Quando o p H da so luçã o ap rox ima-se de9 ,6 , oco r re o mes mo fenômeno obse rvado em p H pró x imo a 2 ,3 , ou se ja , a len t idão na va r iação 
de p H, só que ago ra es tá na depend ênc ia do H + l i be rados pe lo g rup o -NH 3 + . Por tan to , p róx imo a 
pH 9 ,6 , o pa r con jug ado com poder tamponan te é  -NH 3 + /-NH 2 : 
 
CH 2 - NH 3 + CH 2 – NH 2 
 + OH -  + H 2 O 
COO- C OO - 
 
A med ida que o p H da so luç ão se a fas ta r de 9 ,6 , a conc ent ração dos g rupos -NH 3 + va i 
d im inu indo e a base vo l ta , novamente , a neut ra l iz a r os H+ do me io . 
O aminoá cido g l i c i na possu i , como v imos , d o is g rupos co m c apac idade tampo nant e : 
 -C OOH em pH ác ido (2 , 3) e -NH 3 + em pH a lca l in o (9 ,6 ) . 
No pH 2,3 , 50% das es t ru tu ras mo lecu la res da g l i c ina es tá co m o g ru po ca rbox i l a 
pro tonado (-COO H) e 50 % está com o g rupo ca rbox i la d is soc ia do ( - C OO - ) . Ne sta s c ond iç ões, 
pK ( - lo g K ’ , onde K ’ é a c ons tan te de d issoc iação de um á c ido ) é igu a l a pH, po i s a equação de 
Hen derson -Hass e lbac h es tabe le ce: 
 
 pH= pK + log [bas e] 
 [ác ido] 
 pH = pK + log 1 
 pH = pK + 0 
 pH = pK 
 
 7 
 
No pH 9,6 , 50% da s es t ru tu ras mo lecu la res da g l i c i na es tá com o g rupo amin o p ro t onado 
(-N H 3 + ) e 50% da s es t ru tu ras es tá com o g rupo a mino d i ss oc iado (-N H 2 ) . Ne sta s c ond ições, o 
pH ta mbém é igua l a o pK . 
No pH 5,95, eqü id is tante das duas zonas de ta mpona mento , há um g rande p redo mín io d a 
fo rma i soe lé t r i ca + 3H N – C H 2 – C OO - , sendo po r tan to , o pon to i soe lé t r i co (p I ) da g l i c ina : 
 
 p I = pK 1 + pK 2 
 2 
 
 
 
 
P roced iment o : 
1 .P ipeta r em do i s f ras cos de E r lenmey er 1 0 ml de uma so luç ão de g l i c ina 0 ,2 M. 
2 .Med i r o pH in ic ia l . 
3 .Ad i c i ona r a um do s f rascos , suc ess ivamen te , vo lumes de 0 , 5 ml de NaOH 0 ,1N, a g i tando após 
cada ad ição e med indo o pH. R ea l i za r 15 ad ições de NaOH. 
4 . Ad ic iona r ao ou t ro f rasco, com p ipeta , HCl 0 ,1N, de 0 , 5 em 0 ,5 ml , med indo e ano tand o o pH 
da so lução após cada ad iç ão. Rea l i za r 15 ad i ções de H Cl . 
5 .Exp ressa r os r esu l tados g ra f i camente , co l oc ando nas o rdenada s os va lo res de p H e nas 
abc is sas o vo lume de ác ido ou base ad ic ionados. 
6 . I nd ica r os va lo res est imados pa ra os pKs , p I e as zonas de tamponamen to . 
 
 
ATIVIDADE 03 
 
DETERMINAÇÃO DO PONTO ISOELÉTRICO 
 
A case ína é a p r i nc ipa l p ro te ína encont rada no le i te . Ap re sen ta seu ponto is oe lé t r i co n o 
pH 4 ,7 .Depen dendo d o pH do me io , u ma p ro t e ína po de ap re sen ta r ca rga e lé t r i ca pos i t i va , 
nega t iva ou nu la . As va r iaçõe s do pH na so lução in f luenc iam as ca rga s dos rad ica is dos 
aminoác idos c onst i t u in tes das p ro t e ínas . Com i ss o a próp r ia es t ru t u ra p ro té i ca se mo di f i ca , bem 
como seus fa to res de so lub i l idade (ca rga e l é t r ic a e capac idade de h id ra t ação das mo lé cu las ) . 
Em so lução , quando a s molécu las de de te rminada p ro te ína es t i ve rem ca r regadas 
pos i t i vamen te ou negat ivament e , a s o l ub i l i dad e des sa p ro te ína s e rá ma io r , po is as mo lécu las s e 
repe l i rão e nt re s i , au ment ando a in te ração co m o s o lv ent e . Ex is te um pH in te rmed iá r i o , que va r ia 
de p ro te ína pa ra p ro te ína (po is depende dos rad ic a is R do s aminoá cidos que a const i t uem), em 
que há um equ i l í b r io ent re a s ca rgas po s i t i vas e negat iv as . Es te pH é conhecido como P ONTO 
ISOE LÉ TRIC O da p ro te í na – p I . Nes se pH, a p ro te ína ap resen ta so lub i l idade mín ima , po rqu e a 
ca rg a e fe t i va da molécu la é nu la (há um ba lanço en t re ca rgas pos i t i vas e nega t ivas ) , f i cand o 
d iminu ída a repu l são en t re a s mo lé cu las e havendo in t e raç ão e le t ros tá t ica da s molécu las ent re s i . 
Como conseqüênc ia , fo rmam-se g rumo s q ue tende m a p rec ip i ta r . 
Té cn ica 
1 - D ispo r uma sé r ie de tubos de en sa io como a s egu i r : 
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 
H2O destilada (mL) 4.4 4.3 4.0 3.5 2.5 0.5 3.9 
Ác. Acético 0.1N (mL) 0.1 0.2 0.5 1.0 2.0 4.0 - 
Ac. Acético 1N (mL) - - - - - - 0.6 
 2 - P ipeta r em cada tu bo 0 ,5 mL de s o lu ção de cas eína . 
 8 
 
 3 - Ag i ta r todos os tubos po r inve rsão . 
 4 - Obse rva r a tu rb idez logo após a ag i taçã o e depo is de 10 minu tos . 
 5 - Med i r o pH do tub o qu e ap resenta maio r p rec ip i tação. 
 6 - Conc lu i r ind icando q ua l o p I d a c ase ína. 
 
REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS 
 
1. Prec ipi tação por Sa is 
 A l tas concen t rações d e sa i s p rec i p i tam p ro te ínas de suas s o lu ções . Este fenômeno é 
denominado de “sal t i ng out” ou precip i tação por sa is . Os sa i s de s id ra tam as p ro te í nas, 
a t ra ind o as mo lécu las de água d o meio , de modo a f i ca r menos água d is pon íve l pa ra as 
molécu las p ro té icas. A so lub i l idade de uma p ro te í na depende d a quan t idade de água d isponí ve l 
ao re do r de seus g rupos i ôn i cos (quan to menor f o r o número de mo lécu las de água , menor se rá a 
so l ub i l ida de ). Po r out ro l ado , ba i xas concent raçõe s de sa is podem aument ar a so l ub i l idade de 
mui tas p ro te ínas. É fenô meno conhec ido co mo “ sal t ing in” ou sol ubi l i zação por sais . I ss o 
pode se r exp l i cado a t ravés da in te ração en t re os íons sa l inos e as c a rgas i ôn icas das p ro te ínas, 
aumen tando , ass im, o número e fe t iv o de c a rgas (a tendê nc ia de ion ização dos g rupos 
d is so c iáve is das p ro te ínas) e a quan t i dade de mo lécu las de água f i xad as à ionos fe ra p ro té i ca . De 
modo ge ra l , pequenos aument os da f o rça iôn ica s o lub i l i za m me lho r as p ro te ínas, enqua nto que 
aumen tos maio res p rovoc am a p rec i p i taç ão das mesmas. 
Técn ic a: 
1) Pipet a r e m um tubo de ensa io 2 mL de o voa lbum ina . 
2) Ad ic ion a r 2 mL de s o luçã o sa tu rada de su l fa to de amôn ia . 
3 ) Mis tu ra r po r i nve rsão . Obse rva r . 
4 ) Comp le ta r o vo lu me c om á gua des t i lada . Mis tu ra r po r inve rsão e obse rva r a so lub i l idade . 
 
2. Prec ipi tação por áci dos for te s 
 A so lub i l i dade de u ma mo léc u la dep ende da i n te ração ent re os g rupos po la res dos rad ica is 
–R e as mo lécu las de água a t ravés de pontes de h i drogên io . G rande s va r iaçõ es de pH modi f i ca m 
a ion ização des tes g rupos e , po r tanto , a i n te ração da p ro te í na co m o me io . Nos se res v i vos , as 
pro te ína s estão e m con t ínua mod i f i cação de sua con fo rmação, uma v ez que as concen t rações 
loc a i s de íons , o pH e o pode r redut o r so f rem pequenas va r i aç ões , a l te ran do a in te ração dos 
vár i os g rupos reat iv os das p ro te ínas ent re s i e com o me io . Va lo res ex t remos de pH a fe tam 
brus camente es ta s in te ra çõe s, c ausando u ma mudança rad ica l na con fo rmação da p ro te ína pa ra 
um es tado confo rmac iona l b io log ic amen te ina t i vo . Quando u ma p ro te í na é modi f i ca da e m sua 
con fo rmação, de ta l modo que pe rde sua função b io l óg i ca , e l a é d i ta desnat u rad a. A 
desnatu ração é um fenômeno q ue não envo lve c l i vagem da es t ru t u ra p r imár ia da p ro te ína ( ru ptu ra 
das l i gações pept íd icas ) , ma s s im, um rompimen to das est ru tu ras secundár ia , t e rc iá r i a e 
quat e rná r ia . A desna tu raç ão é um re -a r ran jo da confo rmação p ro té ic a nu ma mane i ra não natu ra l e 
de e scassa ou nu la função b io lóg ica . Es se fenô meno pode se r ac ompanhado a t ravé s d e 
modi f i cações da s p rop r iedades f í s i co -quím icas da pro te ína , como a so l ub i l ida de: uma p ro te ína 
desnatu rada é inso lúve l em água e prec ip i ta em so lução. A lém de va lo res ex t remos de pH, a 
desnatu ração pode se r causada p o r mu i tos agen tes f ís ic os, como temp eratu ras e levadas e ra ios 
UV, e quí micos , como sa i s de meta is pesad os e so lven tes o rgân icos. Con fo rme ve remos a seg u i r , 
ác i dos fo r tes como o ác id o t r ic lo roac ét i co (TCA) , desna tu ra as p ro te ína s, p rec ip i tando -as. 
 
Técn ic a: 
1) Pipet a r e m um tubo de ensa io 1 mL de o voa lbum ina . 
2) Ad ic ion a r 0 ,5 mL de so luç ão de TCA 10%. 
3) Obs erva r o resu l tado. 
4) Ad ic ion a r 5 mL de á gua des t i lada . O bse rva r e in te rpre ta r o resu l tado. 
 9 
 
 
Rea ção de He l le r 
 Es ta reação é mui to sensíve l e segu idamen te é u t i l i zada pa ra i nv est iga r a p resença d e 
pro te ína s na u r ina ( fa zen do uma dosagem s emiquant i t a t i va ) 
1) Co loc a r 1 mL de H NO 3 (1 : 1) 50% em um tubo de ens a io . 
2 ) Jun ta r pe las pa redes do tubo , cu id adosament e , 1 mL de so lução de p ro te ína de modo que as 
so l uç ões não se mis tu rem. 
3) Na zona de sepa ração dev erá apa rece r um ane l de ovoa lbumina p rec ip i tada . 
 
3. Prec ipi tação por sai s de metais pes ados 
 Os sa is de met a is pesados (Pb, H g, Ag , Cu ) causa m a des natu ração de p ro te ínas , is to é , 
modi f i cam a sua con fo rmação na tu ra l co m a a t i v idade b io lóg ica (c onf o rmaç ão na t i va ) pa ra uma 
con fo rmação não na tu ra l b i o l og i camen te ina t i va (desnatu rada ). As molécu las p ro té i cas 
desnatu radas p rec ip i ta m. Os sa i s de me ta i s pesado s, po r tanto , p rec ip i tam a s p ro te ínas po r 
desnatu ração . 
Técn ic a: 
1) Prepara r 3 tubos de en sa io . 
2 ) Pipet a r con fo rme o quad ro aba ix o: 
Reagentes Tubos 1 Tubos 2 Tubos 3 
Ovoalbumina 2 mL 2 mL 2 mL 
HgCl2 10% 3 gotas - - 
Acetato de Chumbo - 3 gotas - 
CuSO4 10% - - 3 gotas 
 
3) Obs erva r o oco r r ido no s t rês tubos. 
 
 ATIVIDADE 04 
 
CURVA PADRÃO DE PROTEÍNAS 
 
 
Fundame nto: O mé tod o do B iu re to es tá bas eado na f o rmação, e m me io a l ca l ino , de u m 
comp lexo en t re o íon c úpr ico e as múl t ip las l iga ções pep t íd ic as das p ro te ínas . O comp lex o 
fo rma do ap resen ta co lo ração v io le ta -pú rpu ra e stáve l , cu jo ponto máximo de ab so rç ão oc o r re no 
comp r imento de onda de 545 nm ( f i l t ro ve rde ) . 
O espect ro fo tôme t ro é um apa re lho que pe rmi te a d osagem ou a de te rminação quant i ta t i v a 
de um co mpos to co rado med ian te a u t i l i zação da le i de Lamber t -Be e r. E sta le i es tabe lece que, 
dent ro de l im i tes mu i to bem d ef in i dos, a i n tens ida de da co r de uma s o lução co rada é d i re tamen te 
propo rc iona l à concent ra ção de so lu to ne sta so lução. A le i de Lambert -Bee r, ou se j a , a 
propo rc iona l idade ent re E (ext inção ) e C (conc ent ração ), pe rmi te esc rev e r : 
 
 Cd = Cp 
 Ed Ep 
 
 
Sendo , 
Cd= conc ent ração desconhec ida 
Cp= conc ent ração do pad rão 
Ed= ext inção desconhec ida 
 10 
 
Ep= ext inção do pad rão . 
 
Onde, 
 Cd = Cp x Ed 
 Ep 
 
Se fo rem co ns ide radas a s ex t inçõe s ob t id as a pa r t i r de vá r ia s concen t raç ões conh ec idas 
d i f e ren tes , pode remos ob te r uma méd ia de quocientes Cp /Ep, o qua l será d enominado d e 
quoc ien te mé dio (Qm) ou fa to r de ca l ib raç ão méd io (FCM) . A s é r i e de d ete rm ina ções fe i ta s co m 
concen t rações c rescen tes de subs tânc ia pad rão denomina -se C urva Padrão , a qu a l é mui to mais 
segu ra como pont o d e re ferên c ia do que uma de te rminação pad rã o i so lada . 
 
O bser vaç ões im por tantes : 
●A sens ib i l idade do mé todo do B iu re to est á en t re 1 ,0 e 10 mg /ml . 
●Dete rmine os quo ciente s pa rc ia is . Ca lc u le a mé dia e c ompa re o resu l tado com cad a 
quoc ie nte pa rc ia l . Desp reza r os quoc ien tes p a rc ia is que s e a fasta rem mu i to da média e reca lcu le 
o qu oc ien te méd io . 
●Ut i l i zando a ex t inção dos do is tubos com a a most ra desconhec ida, c a lcu le a 
concen t ração de p ro te í na pa ra cada um. 
●Ao cons t ru i r o g rá f i co em p ape l m i l imet rado, ob se rve que quant o ma is p róx ima de 45 f o r 
a re ta , meno res são os e r ros de le i tu ra no g rá f ic o . 
●Quan to mai s rac iona lmente você usa r o pape l m i l imet rado, ma is fac i lmen te você pode rá 
ca l cu la r a concent raçã o da amost ra des co nhec ida. 
 
Determinação de curva padrão de prote ínas pelo método do Biureto. 
 
Proced iment o : 
 
a - D is po r uma s é r i e d e t ubos con fo rme de mons t rad o aba ixo : 
Tu bos Branco Padrã o1 Padrã o 2 Padrã o 3 Padr ão 4 Am ostra 1 Am ostra 2 
H 2O (m L) 2,0 1 ,5 1 ,0 0 ,5 0 1 ,5 1 ,5 
Album ina 
0 ,8g% (m L) 
0,0 0 ,5 1 ,0 1 ,5 2 ,0 - - 
Am ostra A1 - - - - - 0 ,5 - 
Am ostra A2 - - - - - - 0 ,5 
Reagente 
Bi ure to (m L) 
5,0 5 ,0 5 ,0 5 ,0 5 ,0 5 ,0 5 ,0 
 
b - Ag i ta r fo r temen te . 
c - De i xa r todos os tubo s n o ba nho-mar ia a 30C po r 10 minu tos. 
d- Med i r no e spe ct ro fo t ômet ro em 540 nm. 
e - Desenhar a c u rv a pad rão obt ida em pape l m i l imet rado (nas abc issas , as concen t rações 
pro té ic as de cada tu bo padrão e nas o rdenada s, as abs o rbânc ias l idas no apa re lho ) . 
f - U t i l i zando a cu rva pad rão, acha r a concen t raçã o de p ro te ínas d as amos t ras A1 e A2 
pe lo mé todo g rá f ic o e mé t odo mate mát i co . 
 
 
 11 
 
ATIVIDADE 05 
 
EFEITO DA VARIAÇÃO DE TEMPERATURA NA VELOCIDADE DA REAÇÃO 
ENZIMÁTICA 
 
 A ve loc idade de qua lque r reação q uímica a umen ta , mes mo man tend o f i xa a concen t ração 
dos reagen te s, com o aumen to da tempera tu ra , po r do is mot ivos , ba s i camente : 
 - A umento dos choques ú te is en t re os reagentes ; 
 - Aumen to d o número de l ig ações i n t ramolecu lares que se t o rna m su sce t í ve i s de 
t ran sfo rmação . 
A ene rg ia necessá r i a pa ra que os reagen tes a t in j am o “es tado de t rans ição ” é a ene rg i a de 
a t i vação da reação . A p rese nça de um ca ta l i sado r d imin u i a ene rg ia l i v re de a t i vação. Em uma 
fa i xa que va r ia de ze ro a 50C, a ve loc id ade da reação va iaumen tando a t é a t ing i r um máximo e m 
to rno do s 50C (a t i vação té rmi ca ) . Apó s es te va lor a a t i v idade ca i b rus camente , oco r rendo a 
ina t i vaç ão p rog ress iva da enz ima , p o r d esnatu ra ção . 
 A ma io r ia das p ro te ínas , inc lu indo as enz imas , é sens íve l à desna tu ração q uando 
submet idas a tempera tu ra s de 40 a 50C, po r possu í rem um a l to coef i c ien te de desna tu raçã o 
té rmica . 
1 . P i peta r os tubos co nfo rme esque ma a segu i r : 
Reagen tes B ranco Tubo 1 Tu bo 2 Tubo 3 Tubo 4 
Tempe ratu ra 37C Gelo t .a . 37C 70C 
Tampã o 0 .7 mL 0 .7 mL 0 .7 mL 0 .7 mL 0 .7 mL 
MgC l 2 0 .1M 0 .1 mL 0 .1 mL 0 .1 mL 0 .1 mL 0 .1 mL 
H 2O 0 .7 mL 0 .4 mL 0 .4 mL 0 .4 mL 0 .4 mL 
PPi 0 .01M 0 .2 mL 0 .2 mL 0 .2 mL 0 .2 mL 
Enzima 0 .1 mL 0 .1 mL 0 .1 mL 0 .1 mL 
Vo lu me f ina l 1 .5 mL 1 .5 mL 1 .5 mL 1 .5 mL 1 .5 mL 
 
2. I ncuba r todo s o s tubos de aco rdo co m suas respect i vas temperat u ras du ran te 20 minu tos ; 
3 .R et i ra r os tubos d o banho e p ipe ta r em todos e les , o ma is rap idamente poss íve l , 5 . 0 mL de 
mol ibda to de a mônio 0 ,25% e m H 2SO 4 0 ,5N. 
4 . Ad ic iona r, a cada tubo, 0 .4 ml do reagen te r edut or e , apó s 7 minu tos , le r no espec t ro fo tômet ro 
e m 650 nm, u t i l i zand o o tubo b ranco pa ra a jus ta r o z ero de abso rbânc ia . 
5 .C om base nos va lo res de abso rbânc ia ob t idos , t raça r em pape l m i l imet rado, a cu rva d e 
in f luênc ia da te mpera tu ra sob re a a t iv ida de da p i ro fosfa tase. 
 
 
 
 
 
 
 
 12 
 
 
 
ATIVIDADE 06 
 
REAÇÕES DE IDENTIFICAÇÃO DE GLICÍDEOS (CARBOIDRATOS) 
 
1. Identi f ica ção Ger al de Gl ic ídeos 
1 .1 Reação com r eage nte de Mol ish (s o lução de a l fa -na f to l a 5% em ál cool ) 
É u ma reação pos i t i va pa ra todos os ca rb o id ra tos , este jam l iv res ou co mbinados . 
Sob a ação des id ra t ante do H 2SO 4 concent rado , os ca rbo id ra tos dão o r igem a o fu r fu ra l ou 
aos seus de r ivados . Esta s s ubstânc ias condensam-se com o a l fa -naf t o l p roduzindo u m compost o 
de co r v i o le ta , de compos i ção ince r ta . 
P repa ra r 3 tubos de ensa io e ad ic iona r : 
a ) tu bo no 1 – 2 mL de g l i cos e 2 g%; 
b ) tu bo no 2 – 2 mL de saca rose 2g ;% 
c ) t ubo no 3 – 2 mL de amido 1g% ; 
d ) 6 gotas do rea t i vo de Mol i sh a cad a tubo . 
e ) A d ic iona r cu idadosamen te em cad a tubo, 1 mL de H 2SO4 H 2S O4 concen t rado, 
inc l i nando-o e de ixand o o ác i do esco r re r len tament e pe las pa redes do tubo; 
f ) De ixa r o s tubos em repouso e obse rva r a fo rma ção de u m ane l de c o r v io l e ta . I n te rp re t e 
os r esu l tados . 
2. Identi f ica ção de Gl ic í deos R edutores 
Os ca rbo id ra tos , que p oss uem g rupa mento g l i cosíd i co l i v re (h id rox i la anomér ica l i v re ) , são 
capazes de reduzi r í on de Cu+ + , Ag + e B i + + . 
A r edução do Cu + + é co nsegu ida em me io a lcal ino , à quent e : 
 
Cu+ 2 qu en t e Cu+ 2 a l c a l in o Cu 2 O + H 2 O (ve rme lho ou amare lo ) 
Mas o Cu + + t ambém reage com o me io a lca l ino : 
Cu+ 2 a l c a l i n o Cu(OH) 2 CuO (pre to ) 
 
Para ev i t a r que essa reaç ão masc a re o teste de p re sença e ca rbo id ra to re duto r , o íon Cu+ + 
é mant ido em so luç ão a l ca l i na sob a fo rma de comp lexo. H á, então , vá r io s reagentes à base de 
Cu + + , que d i fe rem em re laç ão ao so lub i l i zado r , ao a lc a l in izante ou a o reagen te pa ra o Cu+ + 
fo rma do. 
 
Reagen te Cu + + So lub i l i zado r A lca l in izan te Out ros 
Fehl ing CuSO 4 2% Tar ta ra to de Na + e K + a 10 % NaOH2M - 
Bened ic t qua l i t a t i vo CuSO 4 2% Ci t ra to de Na + 20% Na 2 CO 3 2M - 
Bened ic t quan t i ta t i vo CuSO 4 2% Ci t ra to de Na + 20% Na 2 CO 3 2M KSCN 30% 
Rea t ivo de Be ned ic t – d i sso lve r 85 g de c i t r a to de sód io e 50 g de ca rbonato de sód io 
an id ro em ce rc a de 350 mL de água quente . D isso lve r , à pa r t e em 50 mL de água quen te , 0 ,5 g 
de su l fa to de cob re c r i s ta l i zado . T ransfe r i r , le n tamen te , com ag i tação cons tan te , a so lução 
cúp r ic a pa ra a p r imei ra . Co mple ta r o vo lume a 500 mL com águ a e f i l t ra r , se nec essá r io . 
2.1 Reação de Benedic t (gl ic ídeos re dutores ) 
 13 
 
Prepara r uma sé r ie de se i s t ubos de ensa io : 
a - C o loca r em c ada tubo, 3 mL do rea t i vo de B ened ic t ; 
b - Ad ic iona r  Tu bo 1 : 1 mL de á gua des t i lada , 
 Tu bo 2 : 1 mL de g l i cose 2 g%, 
 Tu bo 3 : 1 mL de f ru t ose 2 g%, 
 Tu bo 4 : 1 mL de sac a rose 2 g%, 
 Tu bo 5 : 1 mL de lac tose 2 g%, 
 Tu bo 6 : 1 mL de a mido 1 g%; 
c - M is tu ra r bem e aq uece r po r t rês min utos em banho-mar ia fe rven te ; 
d - D e ixa r es f r ia r espont anea mente ; 
e- Obse rva r a co r e a e ven tua l fo rmação de p rec ip i tado. 
O tubo 1 se rve pa ra te sta r o reat ivo . 
2.2 Reação de Bar foed (m onossacar ídeos redutores ) 
a- E m do is tubos de ensa io , a d ic iona r 5 mL do reat i vo de Ba r fo ed; 
b- Ao tubo n o 1 , j un t a r 1 mL de g l i cose 2 g% e ag i ta r ; 
c - Ao tubo n o 2 , jun ta r 1 mL de lac tose 2 g% e ag i ta r ; 
d - Leva r os do i s tubos a banho-mar ia fe rven te po r t r ês min utos . 
A redução , t rad uz ida pe lo apa rec imen to de um p re c ip i t ado ave rme lhado, ve r i f i ca -se log o 
no t ubo núme ro 1 , e só ta rd ia mente no tub o nú mero 2 . 
Exp l i cação : o r eat i vo de Bar foed , apesa r de se r mui t o ins táv e l e de se r menos se ns íve l 
que o de Benedi c t , tem a v i r tude d e ox ida r o s monossaca r ídeo s mai s rap ida ment e que os 
d is sa ca r ídeos , pe rmi t indo des sa fo rma , a d i fe renc iaç ão ent re ambos. 
Nota – so luções con tendo c lo re tos podem da r p rec i p i tado de c lo re to bás i co de cob re . 
Rea t ivo de B a rfoed 
Aceta to cúp r i co c r i s ta l iz ado . . . . . . . . . . 9 g 
Ác ido acét i co g lac i a l . . . . . . . . . . . . . . . 0 ,6 mL 
Água des t i lada q .s .p . . . . . . . . . . . . . . . 100 mL 
 
 
 
D isso lve r o ace ta t o n a água, jun ta r o ác ido a cét ic o e f i l t ra r . 
 
3. Di fer enci ação entr e Aldoses e Ce toses 
3 .1 Reação de Se l iwanof f 
O reage nte de Se l iwanof f é uma so lução que con tém 0, 05 g de reso rc ino l em 100 mL de 
HC l d i lu í do. O H Cl é ob t id o d i lu in do -se o concen t rad o c om água dest i l ada na p ropo rção de 1 : 1 . 
Es te teste p e rmi te d i fe renc ia r a ldoses de ce toses , q ue sob a aç ão des id ra tant e do HCl são 
t ran sfo rmadas em de r i va dos de f u r fu ra l , que se condensam com o reso rc in o l fo rmand o um 
comp os to ve rmelho de compos ição ince r ta . 
A reação c om cetose é ráp ida e ma is in ten sa pe la fac i l idade de fo rmação do de r ivado 
fu r fu ra l . A saca rose dá re ação pos i t i va : sua h i d ró l i se , pe l o HC l do reagen te , exp l i ca o fa to . 
Mesmo as a ldo -hex os es, se o aquec imento fo r p ro longado, dão reaç ões pos i t i vas , po is so b 
a ação ca ta l í t i ca do HC l , a g l i cose se t ran sfo rma e m f ru tose , nes tas c ond ições . 
P repa ra r os seg u in tes tubos de ens a io , con tendo ap ro x imadamente : 
a- 3 mL de S e l iw ano f f + 5 gota s de águad est i lada; 
b- 3 mL de S e l iw ano f f + 5 gota s de f ru tos e 2 g%; 
c - 3 mL de Se l iwano f f + 5 gotas de g l i cose 2 g%; 
d- 3 mL de S e l iw ano f f + 5 gota s de saca rose . 
Co loca r em banho-ma r ia fe rvente . Obse rva r de t rês em t rês minu tos , du ran t e 
ap rox imadamen te 10 m inu tos . Ex p l i ca r . 
 
 
 
 14 
 
Obras C onsul ta das 
 
(1) BRADY, James E. e HUMISTON, Gerard E. Química Geral. Rio de Janeiro: Livros Técnicos e Científicos, 
v.1, 1996. 
(2) CISTERNAS, Raul et al. Fundamentos de Bioquímica Experimental. São Paulo: Atheneu, 2 ed., 1999. 
(3) FERNANDES, Jayme. Química Orgânica Experimental. Porto Alegre: Sulina, 1987. 
(4) ROSITO, Berenice A. e outras. Experimentos em Química. Porto Alegre: Sulina, v.1, 2 e 3, 1983. 
(5) SOLOMONS, T. W. G. Química Orgânica. Rio de Janeiro: Livros Técnicos e Científicos, v.3, 1988.