Aula 7 - Clonagem de DNA

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08/05/2013 
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Clonagem de DNA 
DNA Recombinante 
MSc Eliamara Barroso Sabino 
DNA 
 
Clonagem 
Processo que permite isolar, do DNA total de uma 
célula, determinada seqüência de DNA e multiplicá-la 
indefinidamente em clones exatamente iguais 
Consiste em um processo de múltiplas etapas, 
envolvendo a inserção de fragmentos de DNA em 
moléculas especializadas de DNA (vetores), que são 
capazes de serem introduzidas, replicadas e/ou 
expressas no interior de células hospedeiras vivas 
específicas; selecionar o clone com o fragmento de 
interesse 
Clonagem 
 Um modo de se obter as inúmeras cópias de 
um fragmento de DNA é colocar o DNA de 
interesse em uma bactéria e deixar que ela 
replique o DNA 
Vetores 
 
•Moléculas que transportam fragmentos de DNA para 
dentro da célula hospedeira 
• Vetor ideal: plasmídeos  capacidade natural de 
penetrar em bactérias 
 
 
 
 
 
Plasmídeo Bacteriófagos Cosmídeo 
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Classes de Vetores de Clonagem 
 
• Vetores plasmidiais – pequenas moléculas circulares de 
DNA que replicam o seu DNA independente do DNA do 
cromossomo bacteriano – DNA de até 15 kb 
 
• Bacteriófagos vetores – mais utilizado é o bacteriófago 
l, que infecta E. coli. fragmentos de até 23 kb; transferem 
DNA exógeno para células hospedeira mais 
eficientemente 
 
 
Classes de Vetores de Clonagem 
 
• Cosmídeos vetores –clonam fragmentos de cerca de 44 
kb. 
 
 
•Vetores de expressão – quando a meta da clonagem é 
replicar o gene e expressa-lo (produzir a proteína que ele 
codifica). 
 
 
 
Vetores de Clonagem 
Vetor efetivo de clonagem - 3 características: 
 
• Origem de replicação - seqüência de DNA que garante a replicação 
do vetor dentro da célula (DNA polimerase da E. coli e outras 
proteínas necessárias para iniciar a síntese de DNA ligam-se ao ori). 
Na ausência de uma origem de replicação, o DNA inserido é 
degradado ou diluído no interior da cultura. 
 
• Marcadores selecionáveis - permitem que todas as células que 
contenham o vetor sejam selecionadas ou identificadas; genes de 
resistência aos antibióticos. 
 
 
Vetor efetivo de clonagem - 3 características: 
 
• um ou mais sítios únicos de restrição nos quais um fragmento 
de DNA possa ser inserido; os sítios de restrição usados para 
clonagem devem ser únicos. 
Vetor de clonagem 
Plasmídeo 
Região onde o 
DNA exógeno 
será inserido 
Região de Restrição 
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CLONAGEM 
 
 VETOR: 
 Molécula de DNA usada como um veículo para transportar 
seqüências de DNA alheio para uma célula hospedeira; 
 PLASMÍDIO: 
 Molécula circular de DNA encontrada em bactérias, que se duplica 
independentemente do cromossomo principal e que é transferido 
naturalmente de uma espécie à outra (utilizado como vetor) 
 - tamanho: 1000 - 200 000 pb 
- transportam genes que conferem resistência à antibióticos 
Marcadores selecionáveis 
 
• Gene de resistência a antibiótico 
• Gene LacZ – codificante para a enzima β-
galactosidase: quebra lactose para produzir glicose 
+ galactose 
 
 
PLASMÍDEOS UTILIZADOS EM CLONAGEM 
Vetores de inativação insercional 
 
• Bactérias transformadas semeadas em meio de cultura 
contendo o substrato cromatogênico X-GAL (5-bromo-4-cloro-
3-indolil-β-galactosidase) formam colônias azuis: β-galactosidase 
hidrolisa substrato X-GALproduz precipitado azul no meio de 
cultura apropriado 
 
• Inserção de DNA exógeno no sítio de policlonagem do 
plasmídeo inativa o gene Lac Z  colônias brancas 
Clonagem gênica 
http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Plasmids.png
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Clonagem gênica – etapas básicas 
A clonagem envolve 6 etapas: 
1. A obtenção e preparo do DNA: corte com enzima 
de restrição (fragmento de interesse e vetor) 
 
2. Inserção do fragmento de interesse (inserto) em 
um vetor de clonagem. 
 
3. Introdução do vetor recombinante recém formado 
em uma célula hospedeira apropriada 
 
 
Clonagem gênica – etapas básicas 
 
4. Replicação do vetor recombinante no interior de 
células hospedeiras transformadas por suas 
propagações em cultura in vitro 
 
5. Seleção e expansão de clones individuais de células 
portadoras dos recombinantes desejáveis 
 
6.Isolamento e análise dos insertos de DNA ou produtos 
protéicos expressos 
Clonagem Molecular 
• DNA alvo 
• Vetor – plasmídeo 
• Enzima de restrição 
• DNA ligase 
• Transformação bacteriana 
• Seleção de gene expresso 
• Bibliotecas de DNA 
Enzima de Restrição 
• Endonucleases: 
-Reconhecem seqüências curtas e específicas 
no DNA; 
-Clivam as duas fitas do DNA: -posições 
diferentes (extremidades coesivas);-mesma 
posição (extremidade cega); 
- Sequências palindrômicas. 
 
 
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Animação 
Aplicação médica 
transformation2.exe
transformation2.exe
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Animação 
Purificação de fragmentos de restrição 
PCR e Eletroforese 
Biblioteca de DNA e cDNA 
transformation1.exe
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