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16/09/2011 1 Transcrição e Processamento do DNA MSc Eliamara Barroso Sabino Visão geral Replicação do DNA Transcrição EXPRESSÃO GÊNICA Tradução em proteína específica 16/09/2011 2 Período de Interfase 16/09/2011 3 RNA – ponte entre gene e proteína Características •unifilamentar •uracil no lugar da timina •açucar – ribose •pode apresentar ação catalítica A medida que é sintetizado adquire conformações dadas por pareamento de bases, fundamentais para seu funcionamento 16/09/2011 4 TRANSCRIÇÃO Processo de síntese de uma molécula de RNA utilizando uma das fitas de DNA como molde. Processo de leitura da informação contida no DNA com o objetivo de expressá-la em forma de proteína. - Diferentes taxas de expressão: Transcrição Síntese de RNA a partir de um molde de DNA Ocorre união de nucleotídeos específicos de RNA, formados a partir da complementariedade da fita de DNA ligação fosfodiéster entre carbono 5 da ribose de um nucleotídeo e o carbono 3 da ribose do nucleotídeo seguinte 16/09/2011 5 TRANSCRIÇÃO Características da síntese de RNAs: Polimerização orientada e seqüencial dos nucleotídeos trifosfato de ribose (ATP, GTP, CTP e UTP). Enzima responsável: RNA polimerases, Molde: seqüências nucleotídicas das cadeias de DNA. A transcrição se dá apenas na fita de DNA 3’ 5’ RNA é sintetizado a partir da extremidade 5’ e progride para 3’ ETAPAS DA TRANSCRIÇÃO Fatores de transcrição ativam o promotor Promotor se une a RNA polimerase Interação enzima-DNA no local de início da transcrição leva a abertura da bolha de transcrição por ação da RNA polimerase Fatores de alongamento SII e SIII auxiliam a RNA polimerase Término da transcrição ocorre quando é alcançado a sequência de terminação na extremidade 3’ RNA formado recebe o nome de TRANSCRITO PRIMÁRIO 16/09/2011 6 TRANSCRIÇÃO 16/09/2011 7 A Transcrição resulta sempre em uma molécula de RNA fita simples, complementar ao DNA; ETAPAS: - Abertura e desespirilação de pequena porção de DNA dupla fita; - RNA polimerases atuam na síntese complementar ao DNA molde; - A enzima não exige a presença de primers iniciadores; - A síntese ocorre no sentido 5ʼ 3ʼ; - A cada adição nucleotídica: RNA se desloca; o DNA se reassocia; - mantêm estável o híbrido DNA:RNA na região de síntese; - renaturam o DNA na região imediatamente posterior à da síntese; - A síntese é limitada a pequenas regiões de DNA por vez; EM PROCARIONTES Sinais no DNA indicam o começo e início da síntese; - A subunidade Fator da RNA polimerase lê na sequência do DNA onde começar a transcrição; 1. Reconhecimento do promotor 2. Abertura da dupla hélice de DNA 3. Início da transcrição 4. Transcrição mais acelerada 5. Extensão da síntese 6. Reconhecimento do terminador 7. Liberação da fita sintetizada 16/09/2011 8 Etapas da transcrição (procariontes) Iniciação A RNA-polimerase reconhece e liga-se ao promotor; abre um curto segmento da dupla fita de DNA, expondo os nucleotídeos a sua frente e inicia a síntese de uma fita de RNA complementar a uma das fitas de DNA. Em bactérias uma subunidade da RNA-polimerase, denominada de fator sigma (s) é responsável pelo reconhecimento do promotor 16/09/2011 9 TRANSCRIÇÃO EM PROCARITOS 16/09/2011 10 PROCESSO DE TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS As RNA polimerases eucarióticas sempre necessitam de proteínas auxiliares, denominadas fatores de transcrição. Os promotores são inicialmente reconhecidos por fatores de transcrição que, ligados ao DNA, interagem com outros fatores, formando um complexo ao qual as RNA polimerases se associam. Ao contrário do que ocorre em procariotos, a transcrição e tradução não são acopladas em eucariotos. Os RNAs são processados e devem ser transportados através da membrana nuclear para serem traduzidos no citoplasma. EM EUCARIONTES A Transcrição é feita por muitos tipos de RNA polimerase 16/09/2011 11 EM EUCARIOTOS EXISTEM QUATRO TIPOS DE RNA POLIMERASE RNA polimerase I – produz grandes RNAs ribossomais – RNAr 45S; RNA polimerase II – sintetiza os RNAs que serão traduzidos em proteínas (RNAm), e a maioria dos pequenos RNAs; RNA polimerase III – produz uma variedade de RNAs estáveis, muito pequenos – incluindo o pequeno RNA ribossomal 5S e os RNAs de transferência (RNAt). RNA polimerase IV - transcrição dos genes do DNA mitocondrial. •Os diferentes RNAs sintetizados no processo de transcrição são chamados de transcritos primários. •O processamento de RNA ocorre tanto em procariotos, como em eucariotos. PROCESSAMENTO DE RNA 16/09/2011 12 RNA polimerase exige a presença de fatores de transcrição para: - Reconhecimento do iniciador; - Distorção do DNA; - Abertura da hélice; - Fosforilação da enzima; - Início da transcrição; - Liberação dos Fatores. EM EUCARIONTES A Transcrição depende de várias proteínas As moléculas de RNAm recém sintetizadas pela RNA polimerase II são conhecidas como transcritos primários, RNA precursor ou, ainda pré- RNAm. O conjunto de transcritos primário dos RNAm é conhecidos como RNA nuclear heterogêneo (RNAhn). Os RNAhn são moléculas grandes e instáveis que se encontram associados a proteínas, formando as ribonucleoproteínas nucleares heterogêneas (RNPhn). O processamento do RNAm compreende a remoção dos íntrons e a adição de duas estruturas, chamadas cap ou quepe e poli-A. Também são metiladas algumas de suas adeninas. PROCESSAMENTO DE RNAm 16/09/2011 13 Formação do CAP na molécula de RNAm A transcrição em eucariotos está ligada ao processamento do RNA. - Modificações no pré mRNA recém sintetizado: 1. O Capeamento da extremidade 5’ recém sintetizada; 2. O Splicing remove íntrons de pré-mRNAs recém-transcritos; 3. A Geração da Extremidade 3’ do mRNA em eucariotos: poliadenização. EM EUCARIONTES 16/09/2011 14 RNA polimerases transcrevem “aos saltos” associadas a fatores de extensão EM EUCARIONTES E PROCARIONTES Maiores diferenças entre passos de células procariótica e eucariótica para expressar genes: PROCESSAMENTO DE RNAm 16/09/2011 15 O transcrito primário de RNA é uma cópia fiel de gene, contendo tanto seqüências de éxons como de íntrons. As seqüências de íntrons são então removidas da região interna do transcrito de RNA, para produzir uma molécula de RNAm que codifica diretamente uma proteína. As seqüências de RNA codificantes, presentes de cada lado de um íntron, são unidas entre si após a remoção dos mesmos, num processo chamado de splicing de RNA. O splicing (junção, emenda) de RNA ocorre no núcleo da célula, fora de alcance dos ribossomos. O RNA é exportado para o citoplasma somente quando o processamento foi completado. splicing de RNA 1-Liga uma ponta do íntron a adenina interna conservada 2-Libera o laço e une os dois éxons adjacentes As etapas 1 e 2 são reações de transesterificação entre os nucleotídeos conservados 16/09/2011 16 A retirada de íntrons da molécula de RNAhn ocorre após duas reações de transesterificação (transferência do fosfato de um açúcar a outro – transferência da ligação fosfodiéster) para unir os éxons, liberando o íntron na forma de um laço. Esse processo é mediado por estruturas complexas chamadas de spliceossomos Os spliceossomos são constituídos pela associação de pequenas ribonucleoproteínas nucleares (RNPpn) e outras proteínas. As RNPpn são formadas por 6-10 proteínas associadas a pequenos RNA nucleares. Cada RNPpn associa-se de diferentes maneiras em diferentes locais do intron, para que o splicing ocorra. Após sofrerem splicing, as moléculas de RNAm, sãoreconhecidas por proteínas receptoras, localizadas próximas ao complexo de poro nuclear, que ativamente transportam-o para o citoplasma. 16/09/2011 17 16/09/2011 18 GENE DA HEMOGLOBINA Os RNAs eucarióticos maduros são seletivamente exportados do núcleo: - No meio de muitas moléculas de RNAs (pedaços, não maduros, danificados...) somente uma pequena parte (mRNA maduro) é exportado do núcleo ao citoplasma: Ação garantida pelo Complexo do poro nuclear e por um conjunto de proteínas ligadas ao RNA maduro; 16/09/2011 19 O Nucléolo: - Onde ocorre o processamento dos rRNA e sua montagem; - É um agregado de macromoléculas (genes de rRNA, precursor rRNA, rRNA maduro, enzimas processadoras; snoRNPs, proteinas ribossomais,...) 16/09/2011 20 O Nucléolo: - Síntese de ribossomos e de ribonucleoproteínas;
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