Calibração e Controle

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Calibração e Controle 
 
Introdução 
A calibração é um processo de comparação, na área química a comparação pode ser feita usando medições 
obtidas de um material chamado de Material de Referência Certificado (MRC) ou como conhecido por nós, 
como padrão, solução padrão, amostra padrão/calibrador único ou múltiplo, como exemplo podemos citar os 
materiais certificados internacionais (ISSO GUIDE). Consideramos que cada quantidade do material de 
referência utilizado é a mesma, pelo menos no que diz respeito às propriedades do analito. 
 Ex: Padrões Calibradores em diferentes matrizes. 
A matriz é muito importante para o padrão único ou para o calibrador.: 
 Para determinar uma concentração de glicose na amostra do paciente (soro) é necessário calibrar o 
aparelho usando uma solução aquosa de glicose, assim, será mais fácil enxergar a glicose na água do 
que no soro. Dito isso, se houver a necessidade de calibração de um aparelho para a determinação de 
amostrar em material biológico será necessário fazer a preparação do equipamento com esses mesmos 
marcadores biológicos, porém com concentração conhecida e solvidos em uma matriz semelhante 
(soro). 
 Vale ressaltar que, se for determinado algo em uma matriz, é interessante que o calibrador e o controle 
sejam constituídos na mesma matriz da amostra que será determinada. Ex: se o padrão estiver em 
matriz aquosa, será feito a determinação de amostras em matriz aquosas. 
Curva de Calibração 
A curva de calibração é uma relação funcional do sinal observado (y) dada uma certa quantidade de analito 
(x). Em geral, utilizamos a regressão linear simples para estimarmos a incerteza devido a curva de calibração 
produzida. 
Segundo o documento orientativo do INMETRO de validação de métodos (DOQ-CGCRE-008), o método é 
mais sensível quando pequenas variações de concentração resultam em maior variação na resposta, ou seja, é 
possível diferencia uma leitura da outra em pequenas variações de concentração do analito e isso é medido a 
partir do coeficiente angular, segundo a literatura o ângulo adequado para uma curva é em torno de 45° (maior 
que 45 – método mais sensível, menor do que 45 – método menos sensível). 
 Em geral, são necessários vários níveis de concentração (no mínimo cinco pontos na curva, isso porque se 
houver dois pontos é uma reta e se tiver três pontos é uma curva imperfeita) para construir a curva de calibração 
e o número de replicatas em cada nível de concentração deve ser o mais próximo possível daquele empregado 
na rotina do laboratório. Vale ressaltar que, no laboratório de análises clínicas normalmente só é repetido as 
 
determinações se o aparelho, após calibração e controle, apresentar qualquer disfuncionalidade, ou se os 
valores estiverem fora do padrão. 
Todo experimento de determinação da faixa de trabalho é iniciado pela escolha de uma preliminar, no qual a 
faixa de trabalho deve cobrir a faixa de aplicação para o qual o ensaio vai ser usado. A orientação segundo 
DOQ-CGCRE-008 é que a concentração mais esperada da amostra deve, sempre que possível, se situar no 
centro da faixa de trabalho. No limite inferior da faixa de concentração, o fator limitante é o valor do limite 
de quantificação (i.e. sensibilidade de método), já no limite superior, os fatores limitantes dependem do 
sistema de resposta do equipamento de medição (i.e. linearidade do método). 
Hoje em dia a curva de calibração quase não é feita nos novos equipamentos porque eles são muito sensíveis 
e precisos. Os calibradores e controles chegam com valor médio e intervalo de confiança (+/- 95%), assim, se 
o resultado estiver dentro do intervalo de confiança o equipamento pode ser utilizado. Dito isso, durante as 
corridas analítica é feito a passagem do controle (amostra de valor conhecido) e se o equipamento estiver 
gerando o mesmo valor de dias anteriores, o aparelho estará adequado para continuar sendo utilizado na rotina. 
Aplicação da Curva de Calibração 
A maioria das aplicações da curva de calibração é que na prática, temos interesse em predizer o valor de X 
(i.e: concentração) dado uma observação Y (i.e.: sinal “absorbância” – em comprimento de onda fixo em nm). 
Observação: mesmo que haja um mesmo produto, as moléculas utilizadas para determinação são diferentes, 
ou seja, moléculas diferentes podem ser determinadas em um único comprimento de onda, porém as reações 
serão individualizas. 
Os equipamentos usam reações monoreagentes, bireagentes ou trireagentes. Existem reações que se for feito 
a mistura de todos esses componentes, será perdido a estabilidade e assim, ao longo do tempo os valores 
determinados serão reduzidos e haverá uma perda de dinheiro pois no final do dia terá que ser jogado muito 
reagente fora por não estar mais estável. Ou seja, não se pode fazer a mistura dos diferentes tipos de reagentes 
desde que o equipamento é ligado, eles têm que ser misturados no momento da reação para que haja um 
aumento da estabilidade. 
 
Um equipamento terá uma cubeta composta por um monoreagente (se for uma reação de agente único) ou terá 
duas ou três cubetas de reagentes (se for bi ou tri, respectivamente), além disso, terá separadamente uma cubeta 
com a amostra do paciente e uma cubeta de reação. Na cubeta de reação, vão ser desprezados os reagentes no 
momento da reação, esses reagentes (monoreagentes, bireagentes, trireagentes) são armazenados no 
equipamento de forma isolada e só serão misturados na hora da reação para manter a estabilidade ao longo do 
tempo. Vale ressaltar que, o local de armazenamento dos reagentes é refrigerado e a cubeta que será aquecida 
a aproximadamente 37°C. 
Análise da Curva de Calibração 
Quanto maior a concentração de glicose, mais intensa a cor. O fato de a intensidade da cor ser diretamente 
proporcional a concentração, dará um leque de possibilidades absurdas para detecção. 
Exemplo, determinação da glicose: 
 Na imagem é possível observar que a amostra do paciente está mais concentrada que o padrão. 
 O branco é o reagente da glicose com tudo dentro para que a reação aconteça, porém sem a amostra. 
O padrão ou calibrador é uma solução da amostra de concentração conhecida. O controle é uma 
amostra do dia anterior do laboratório com concentração conhecida ou oriunda de uma compra de uma 
instituição credenciada ou locais de proficiência. 
 Ao observar a curva é perceptível ver que, nos três últimos pontos, ela está perdendo a linearidade, ou 
seja, mesmo que a absorvância esteja aumentando a concentração não aumenta, pois o método não 
consegue fazer a detecção. Assim, a linearidade da glicose está em torno de 500 mg/dL. Dito isso, o 
teste está ótimo pois a curva cobriu as faixas de interesse clínico. 
 Nos dias de hoje não é feito muito o uso da curva, já que existe a regra de três. Em contrapartida, toda 
vez que o analito que for determinado não seguir a lei de Beer, terá que fazer a construção da curva, 
essa curva dará uma maior precisão da determinação. 
 
A depender da matriz, ex: água pura, água com etanol 10%, água com etanol 50%, as curvas vão ser diferentes 
em relação ao ângulo. Na imagem é perceptível que entre as três curvas, o método mais sensível foi o padrão 
água com etanol 10% pois foi o que o possuiu um maior coeficiente angular, o menos sensível foi o padrão 
água com etanol 50%. Vale ressaltar que, se o método for muito sensível, a reação será tão rápida que não será 
possível enxerga-la, isso ocorre em algumas reações enzimáticas, para mudar isso terá que feito um trabalho 
em cima do comprimento de onda (tem que achar um que gere um ângulo em torno de 45°). 
Se for realizada determinação em uma matriz, é necessário que o calibrador e o controle sejam constituídos 
na mesma matriz da amostra que será determinada. Isso impede o efeito de matriz e faz com que haja uma 
mesma sensibilidade e menor erros entre os envolvidos. 
 
Efeitos da Matriz 
A matriz é o meio físico-químicono qual o analito está disperso. Uma solução de Cloreto de sódio em água 
pode ser considerada como consistindo de um analito (Na+) em uma matriz de Cl- e água. 
Quando um sistema analítico apresenta diferentes resposta (resultados estaticamente diferentes) para a mesma 
quantidade de analito presente em materiais processados (controles e calibradores proteicos) e em amostras 
humanas frescas, esta diferença é denominada efeito da matriz. Ex: se houver a necessidade de calibrar o 
aparelho para encontrar a concentração de glicose em amostras de soro humano, o calibrador e o controle 
utilizados terão que ser reconstituídos em soro humano ou animal, ou seja, é necessário que haja uma 
constituição proteica semelhante no meio utilizado para determinação da amostra. 
Estes efeitos (bias) introduzem problemas analíticos porque a resposta obtida com materiais processados e 
utilizados como calibradores, devido à diferença das respostas, não pode ser usada com confiança em 
procedimentos de calibração ou para avaliar a exatidão de um método usado rotineiramente. 
Água como reagente 
A água é o suprimento de laboratório mais barato. Talvez, por este motivo, sua qualidade seja tão 
negligenciada, apesar de ser um reagente importante e o mais largamente utilizado. A água utilizada no 
laboratório deve ser pura e este termo pode significar coisas diferentes, dependendo da situação. 
Antigamente era utilizado água destilada (tipo III), mas para isso se perdia uma grande quantidade de água. 
Um destilador ligado superaquece a água para que ela evapore e posteriormente condense, mas para isso 
acontecer litros de água são jogados fora (para cada litro de água destilada são necessários, aproximadamente, 
20 litros de água). 
A água purificada feita a partir da osmose reversa (tipo II), gera uma perda de água só que menor que a 
destilação (em média para cada 1 litro de água é gasto de 3 a 4 litros de água). Geralmente, no laboratório de 
bioquímica, por utilizar bastante reações de oxirredução, os fatores mais importantes a ser analisado no tipo 
da água são partículas em suspensão, resistência e condutividade, ou seja, se a resistência e a condutividade 
estiverem elevadas a reação não vai acontecer. Dito isso, água requisita no laboratório de bioquímica clínica 
tem que ser tipo II. 
A água tipo I é ultrapura, muito usada no laboratório de toxicologia. 
 
Reações 
As reações correspondem ao resultado da atuação de um ou mais reagentes sobre o analito para formar o 
produto. Existem vários modelos de reação e aquele a ser escolhido para determinado sistema analítico irá 
depender dos reagentes a serem utilizados ou disponíveis e das facilidades instrumentais. 
Reações colorimétricas são aquelas em que os produtos formados têm uma cor e as intensidades das cores 
(proporcionais às concentrações dos produtos formados, respeitando a faixa de linearidade) são medida na 
faixa visível do espectro (aproximadamente 390-700nm). 
Reações ultravioleta são reações cujos produtos formados absorvem energia radiante (luz) na porção do 
ultravioleta próximo, mais especificamente em 340 ou 360 nm (aproximadamente 100 a 390 nm). São reações 
que não são visíveis a olho nu. Nessas reações serão medidas as coenzimas reduzidas ou oxidadas, em reações 
crescentes (aumento da produção de redução – reação diretamente proporcional) ou decrescentes (aumento 
das coenzimas oxidadas – reação inversamente proporcional). 
 
A reações colorimétricas ou ultravioleta podem ser utilizadas em vários modelos, como reações de ponto final 
e reações cinéticas. A figura abaixo mostra graficamente uma reação de ponto final; a divisão em três etapas 
mostra o início e o incremento na formação do produto, a etapa de estabilidade, e o decaimento do produto 
por perda da estabilidade. 
 Uma reação de ponto final é uma reação que há um tubo de ensaio, nesse tubo de ensaio a amostra do 
paciente é pipetada dentro da solução de reação. Essa solução de reação leva um tempo (fase 
logarítmica). Em resumo a reação de ponto final é uma reação que ao ser começada, o tempo é marcado 
e no final desse tempo será feito a quantificação.