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APLICAÇÕES DA BIOLOGIA
MOLECULAR NA ODONTOLOGIA:
CONCEITOS E TÉCNICAS
MOLECULAR BIOLOGY IN DENTISTRY: CONCEPTS AND TECHNIQUES
FABIANE BORTOLUCI DA SILVA
SIMONE MARIA GALVÃO DE SOUSA
Bióloga especialista em Ciências da Universidade do Sagrado Coração
Professora doutora da disciplina de Patologia Bucal da Faculdade de
Odontologia da Universidade do Sagrado Coração
RESUMO
A implementação e o desenvolvimento de novas terapias e
métodos baseados nos conhecimentos da biologia molecular
requerem uma reciclagem educacional intensiva dos profissio-
nais das áreas de saúde, entre eles, o cirurgião dentista. Esse
avanço biotecnológico e as mudanças conceituais já estão pro-
movendo modificações positivas na longevidade e na quali-
dade de vida dos indivíduos. Este trabalho visa abordar os
conceitos, avanços, técnicas e aplicações da biologia molecular
na área da saúde, especificamente na odontologia.
UNITERMOS: BIOLOGIA MOLECULAR – CÂNCER BUCAL – DOENÇA
PERIODONTAL.
SUMMARY
The establishment and development of new techniques and
therapies based on knowledge of molecular biology need
an intensive education of the health professionals, such
as, dental clinician. This biotechnological improvements
associated with new concepts are promoting positive
modifications in the longevity and life quality of
population. This study aims to discuss about concepts,
innovations, techniques and application of the molecular
biology in Dentistry.
UNITERMS: MOLECULAR BIOLOGY – ORAL CANCER –
PERIODONTAL DISEASE.
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INTRODUÇÃO
Os avanços na biologia molecular têm
contribuído significativamente para o enten-
dimento da etiologia das doenças humanas.
As técnicas de recombinação dos ácidos
nucléicos têm permitido aos pesquisadores
identificar os vários genes responsáveis por
doenças hereditárias, detectar agentes infec-
ciosos em material biológico, avaliar os me-
canismos de infecção dos microrganismos e
conhecer os processos que regulam a diferen-
ciação e proliferação celular (principalmente
neoplasias), entre outros. A biologia molecular
também vem apresentando aplicação bastan-
te expressiva na pesquisa de marcadores ge-
néticos úteis no diagnóstico laboratorial e na
avaliação da predisposição a inúmeras doen-
ças. Por outro lado, as diferenças nas seqüên-
cias do DNA observadas entre as espécies ou
entre os indivíduos são extremamente úteis
para a identificação de pessoas. Inegavelmen-
te, os avanços foram inúmeros, contudo, mui-
tas descobertas e importantes aplicações na
área médica ainda devem levar algum tempo
para serem desenvolvidas ou empregadas ro-
tineiramente.9,16
Na área odontológica, a biologia mole-
cular tem proporcionado o diagnóstico pre-
coce da cárie dental, da doença periodontal e
do câncer bucal. Além disso, a saliva atual-
mente está sendo usada no diagnóstico de
doenças bucais e sistêmicas, e os marcadores
genéticos, aplicados na identificação das de-
mais neoplasias presentes no complexo
maxilofacial.10
Este trabalho visa abordar os princípios
básicos da biologia molecular, seus conceitos,
avanços, técnicas e aplicações na área da saú-
de, em especial na odontologia.
DNA E RNA
AS BASES MOLECULARES DA HEREDITARIEDADE
Os cromossomos são estruturas respon-
sáveis pelo armazenamento, duplicação e
transmissão de material genético. Cada
cromossomo consiste em duas cromátides-ir-
mãs, que são formadas por uma única fita de
DNA associada a proteínas de RNA. O ser
humano possui 23 pares de cromossomos de
tamanhos e formas diferentes. Cada par de
cromossomos tem, normalmente, a mesma
seqüência de genes. Portanto, atuando sobre
cada característica genética, existem dois
genes, ou seja, dois alelos, um em certo
cromossomo e o outro na mesma localização
no seu homólogo. Os genes formam uma se-
qüência linear ao longo dos cromossomos e
são as unidades que determinam os traços
hereditários.3,9,16
ESTRUTURA DA MOLÉCULA DE DNA
O DNA é um polímero formado por
nucleotídeos. Cada nucleotídeo é composto
por um grupo fosfato, um açúcar e uma base
nitrogenada. As bases nitrogenadas podem ser
de dois tipos: pirimidínicas (citosina e timina)
e púricas (adenina e guanina). Estruturalmen-
te, sempre uma base adenina (A) se liga a uma
timina (T) e uma citosina (C) sempre apare-
ce pareada a uma guanina (G). A molécula
do DNA é muito longa e, se esticada, pode
chegar a dois metros. O DNA é formado por
porções sem função codificante, chamadas
íntrons, e porções com seqüências codi-
ficadoras, denominadas éxons. A molécula de
DNA é constituída de duas cadeias de
nucleotídeos que se enrolam, originando a
dupla hélice, e são mantidas unidas por pon-
tes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas
de nucleotídeos opostos (AT ou CG).3, 6,7,9,16,19
Para o DNA ser comprimido dentro do
núcleo celular, ele é helicoidizado em diver-
sos níveis. Primeiramente, ele se enrola ao
redor de proteínas chamadas histonas, para
formar um nucleossomo. Os nucleossomos
compõem um solenóide helicoidal. Cada vol-
ta do solenóide inclui cerca de seis nu-
cleossomos. Os solenóides são organizados em
alças de cromatina, que se ligam a um ar-
cabouço de proteína. Cada uma dessas alças
contém aproximadamente 100 mil pares de
bases do DNA. Depois de helicoidizado e
condensado, o DNA atinge cerca de 1/10.000
do comprimento que teria se fosse totalmen-
te estendido (fig. 1).3,6,16,17
ESTRUTURA DA MOLÉCULA DE RNA
O RNA é composto por uma única ca-
deia de nucleotídeos. No entanto, o açúcar
presente é a ribose e a base timina é substituí-
da no RNA pela base uracila (U). Existem
três tipos de RNA: RNA mensageiro, cuja
função é transportar uma mensagem especí-
fica do DNA até o citoplasma, RNA
ribossômico, que se liga às proteínas para
compor os ribossomos, e RNA transportador,
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que transporta no citoplasma os aminoácidos,
que se unirão para formar uma nova cadeia
polipeptídica.7,9
SÍNTESE DE PROTEÍNAS
A síntese de proteínas é ativada quando
uma proteína torna-se necessária ao metabo-
lismo celular. Para iniciar a síntese, a seqüên-
cia de DNA que contém o gene específico para
determinada proteína deve estar com as pon-
tes de hidrogênio rompidas entre as bases e a
dupla hélice desenrolada. Essa ação é coman-
dada por enzimas nucleares específicas. Es-
tando o DNA exposto, ocorrerá a transcri-
ção, ou seja, a formação de uma molécula de
RNA mensageiro (RNAm) complementar à
seqüência do DNA. O RNAm deixará o nú-
cleo indo para o citoplasma, onde se unirá aos
ribossomos. Na tradução, a cada códon de
RNAm irá se acoplar um RNA transportador
(RNAt). Os RNAts possuem uma região de
três pares de bases, denominadas anticódons,
que transportam em sua extremidade os
aminoácidos. Dessa forma, os ribossomos
promovem a ligação códon versus anticódon
e a aproximação dos aminoácidos em seqüên-
cia, que irão formar entre si, ligações
peptídicas, dando origem às proteínas.3,9,16
TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
A análise molecular é um novo método
de avaliação que busca as alterações expressas
em nível genético, ou seja, pelo DNA. O DNA
genômico é obtido de qualquer material bio-
lógico, mas as amostras mais utilizadas são san-
gue (leucócitos), tecidos biopsiados (células
residentes), fluido amniótico e vilosidade
coriônica. Para extrair o DNA do núcleo celu-
lar, são necessárias várias etapas, que compre-
endem lise celular, extração das proteínas e do
RNA, precipitação do DNA, até a purificação.
O DNA obtido será digerido por enzimas de
restrição que produzem muitos fragmentos de
DNA do gene em estudo.3 Essas enzimas de
restrição cortam a dupla hélice do DNA em
uma seqüência específica, denominada de sí-
tio derestrição, que varia de quatro a seis ba-
ses. A enzima de restrição EcoRI sempre reco-
nhece uma mesma seqüência e faz o corte entre
as bases G e A de cada cadeia.3,14 Atualmente,
já estão identificadas mais de 400 enzimas de
restrição, cada uma atuando em sítios de res-
trição diferentes. O nome da enzima refere-se
ao microrganismo em que foi identificada sua
linhagem e a ordem de descoberta. Por exem-
plo, a enzima EcoRI significa enzima de restri-
ção descoberta na Escherichia coli, linhagem R,
e foi a primeira enzima de restrição identificada
neste organismo.3,6,14
As pontes de hidrogênio podem ser rompi-
das aumentando-se a temperatura, no processo
chamado de desnaturação, e, se a temperatura
diminuir, a dupla hélice forma-se novamente.
Essa capacidade da molécula de DNA de se
renaturar, reassociando-se com sua cadeia com-
plementar para formar a dupla hélice, é utilizada
no processo da hibridização. Na hibridização, as
regras de pareamento entre A-T e C-G são
mantidas. É importante mencionar que entre
A-T existem duas pontes de hidrogênio, enquan-
to entre C-G há três. Dessa forma, uma molécu-
la de DNA rica em pares C-G requer, para sua
desnaturação, uma temperatura mais alta do que
uma molécula de DNA composta principalmente
por pares A-T.9,16
ELETROFORESE
A eletroforese em gel de agarose ou de
poliacrilamida é um método simples e rápido
que separa o DNA em fragmentos de tama-
nhos diferentes usando enzimas de restrição.
Quando submetidas a um campo elétrico
(matriz) em pH neutro, as moléculas de DNA
são atraídas para o pólo positivo e repelidas
do pólo negativo. Quando a matriz apresenta
resistência à migração das moléculas, os frag-
mentos menores podem se mover com maior
facilidade do que os maiores, havendo, então,
uma migração diferenciada dos fragmentos.
A escolha do material da matriz depende da
FIGURA 1. PADRÕES DE HELICOIDIZAÇÃO DO DNA.
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resistência necessária para a separação efetiva
dos fragmentos. Uma matriz feita de agarose
possui um tamanho de poros que permite a
separação de fragmentos que variam de 200
pb (pares de bases) a 50 kb (kilobase). A
poliacrilamida permite a separação de frag-
mentos muito pequenos, até 1.000 pb, sendo
o material ideal para géis de seqüenciamento.
No entanto, a separação de fragmentos de
DNA em tamanhos superiores a 50 kb não
pode ser realizada por esse tipo de eletroforese
convencional e exige uma variação conhecida
como eletroforese em campo pulsado (PFGE).
A PFGE permite a separação de fragmentos
que variam de 50 a 10.000 kb. Isso ocorre de-
vido à alternância de dois campos elétricos em
direções perpendiculares. De acordo com esse
método, se as moléculas de DNA forem sub-
metidas a um campo perpendicular à sua mi-
gração, elas irão se reorientar nessa nova dire-
ção e as moléculas menores serão capazes de
assumir o novo caminho mais rapidamente do
que as maiores. Assim, a separação das molé-
culas dependeria da sua capacidade de se
reorientar em resposta às mudanças de dire-
ção do campo elétrico aplicado. O nível de re-
solução depende do tempo do pulso elétrico.
A PFGE pode ser aplicada para a análise de
grandes fragmentos de DNA, o mapeamento
gênico, o estudo de cromossomos ou para
detecção de grandes deleções do DNA
genômico. Depois de separado, o DNA pode
ser corado com um corante fluorescente e
visualizado sob luz ultravioleta (UV).3,7
MÉTODOS
MÉTODO DE SOUTHERN
Depois de obtidos os fragmentos de DNA
no gel, um certo segmento do DNA que con-
tém o gene de interesse pode ser detectado pela
hibridização com uma sonda específica. Para
isso, o DNA contido no gel é transferido para
um filtro de nitrocelulose ou náilon por meio
do método de transferência chamado Southern
blotting. Quando o material presente no gel é
RNA, o método chama-se Northern blotting e,
caso seja proteína, denomina-se Western blotting.
Após ser fotografado em UV, o gel é mergulha-
do em solução de hidróxido de sódio, ocasio-
nando a desnaturação da dupla fita de DNA. O
DNA em fita simples é, então, coberto com a
membrana de transferência em um fluxo de
solução salina, onde é desprendido da matriz e
transferido para a membrana. Nela, o DNA é
fixado e hibridizado com uma sonda específica
marcada radioativamente, ligando-se a sua se-
qüência complementar. Em seguida, é retirado
o material radioativo que não se hibridizou, e a
membrana é exposta a um filme de raios-X sen-
sível à radioatividade. Como resultado, obser-
vamos na auto-radiografia um padrão com uma
ou mais bandas, indicando o número e o tama-
nho dos fragmentos de DNA complementares
à sonda. Assim, para amostra de DNA, o pa-
drão de bandas será constante, desde que o
DNA seja digerido com uma certa enzima de
restrição e hibridizado com uma determinada
sonda. Diferença no padrão normal obtido in-
dica a presença de um gene mutante.3,7
HIBRIDIZAÇÃO COM OLIGONUCLEOTÍDEOS ALELO-
ESPECÍFICOS (ASO)
Esse método consiste no reconhecimento
de um alelo particular usando-se diferentes
sondas. A sonda é uma seqüência de
oligonucleotídeos complementar ao máximo
a cada alelo possível do gene (ASO). Dessa
forma, é possível distinguir diferentes alelos de
um mesmo gene, visto que essa hibridização
somente ocorrerá se o oligonucleotídeo for
absolutamente complementar ao alelo. Esse é
um método restrito, pois é necessário conhe-
cer a seqüência de bases em cada alelo para
sintetizar o oligonucleotídeo específico para
cada gene.3
REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE (PCR)
Consiste na amplificação enzimática espe-
cífica do DNA visando à produção de milhões
de cópias dessa seqüência em um tubo de en-
saio. Uma fita simples do DNA é usada como
molde para a síntese de novas cadeias comple-
mentares sob a ação da enzima polimerase do
DNA, que adiciona os nucleotídeos presentes
na reação de acordo com a fita molde. A
polimerase do DNA precisa de um ponto de iní-
cio. Ele é fornecido por um oligonucleotídeo que
hibridiza a fita molde simples (primer). As fitas
simples iniciais precisam fornecer os primers es-
pecíficos a cada uma delas. Portanto, a região
do DNA genômico a ser sintetizado é definida
pelos primers, que se anelam às seqüências com-
plementares na fita molde, delimitando o frag-
mento de DNA a ser amplificado. No início,
usava-se a polimerase do DNA extraída da E.
coli, mas como ela era sensível a altas tempera-
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turas, passou-se a utilizar a Taq polimerase, ex-
traída da bactéria Thermus aquaticus. Usualmen-
te, os primers têm 20 pares de bases, para garan-
tir a identificação de uma única seqüência
complementar. No final do processo, o DNA
produzido pode ser observado em eletroforese
em gel de agarose ou poliacrilamida. A vanta-
gem desse método é que o resultado fica pron-
to em até 24 horas e requer quantidades muito
pequenas de DNA.3,7,9,16
A PCR tem uma ampla faixa de aplica-
ções: 1. possibilita a amplificação rápida de um
DNA molde para a coleção de mutações não
caracterizadas; 2. permite uma identificação rá-
pida de marcadores polimórficos; e 3. pode ser
utilizada para a análise de mutações conheci-
das. Essa técnica – que revolucionou o estudo
do câncer – tem sido usada para detectar mu-
tações nos oncogenes associados ao câncer, nos
genes supressores de tumores, nos linfócitos B
e T e translocações.7,16
A PCR tem algumas limitações. Embora
seja um método para aumentar a quantidade
do gene de interesse in vitro, pode haver difi-
culdades devidas ao material necessário no es-
tudo de pequenas quantidades de DNA. Além
disso, a especificidade da reação pode ser limi-
tada e depende de muitos fatores, como o ta-
manho dos oligonucleotídeos, a temperatura
de anelamento e a concentração do sal. Toda-
via, uma das maiores limitações é a susceti-
bilidade do processo à contaminação.7,16
HIBRIDIZAÇÃOIN SITU DE FLUORESCÊNCIA (FISH)
Na hibridização in situ, geralmente utili-
za-se uma preparação de cromossomos
metafásicos em lâmina, na qual o DNA
cromossômico foi desnaturado pela exposi-
ção a formamida antes da hibridização, com
uma sonda apropriada. Na técnica de FISH,
a sonda de DNA pode ser marcada direta-
mente, pela incorporação de um precursor de
nucleotídeo marcado com fluorescência, ou
indiretamente, pela incorporação de um
nucleotídeo contendo uma molécula repór-
ter (biotina ou digoxigenina). Depois de in-
corporada ao DNA, essa molécula repórter é
ligada, por afinidade, a uma molécula marcada
com fluorescência.7,16
Essa técnica fornece resultados rápidos, que
podem ser visualizados sob microscopia de
fluorescência. Nos cromossomos metafásicos, os
sinais positivos aparecem como pontos duplos,
correspondendo à hibridização da sonda em
ambas as cromátides-irmãs. As aplicações da téc-
nica são a detecção de alterações cromossômicas
numéricas e estruturais, o diagnóstico pré-natal,
o diagnóstico de doenças virais, a determinação
do sexo pré-natal, o mapeamento gênico e, na
oncologia, a detecção de doença residual míni-
ma como células tumorais em baixa freqüência e
o monitoramento de transplantes de medula ós-
sea. Sua desvantagem é que ela se limita ao seg-
mento pesquisado.7,16
APLICAÇÕES DA BIOLOGIA MOLECULAR NA
ODONTOLOGIA
O progresso da engenharia genética na
medicina terá efeitos similares na prática do
cirurgião dentista. Novos métodos serão aban-
donados em favor das técnicas da bioenge-
nharia. O avanço mais significativo será na
interação entre dentistas e pacientes, com o
desenvolvimento de novos sistemas de diag-
nóstico, prevenção e tratamento.19
A microbiologia bucal é essencial para
a identificação e caracterização de vários mi-
crorganismos envolvidos nas infecções bu-
cais. A bolsa periodontal tem cerca de 300
espécies diferentes de bactérias. Alguns mi-
crorganismos têm sido associados com a do-
ença periodontal, como Actinobacillus acti-
nomycetemcomintans (Aa), Fusobacterium
nucleatum (Fn), Porphyromonas gingivalis (Pg),
Prevotella intermédia (Pi) e Eikenella corrodens
(Ec). Muitos métodos têm sido usados na
detecção da variação fenotípica e genotípica
para a caracterização desses patógenos
periodontais, assim como na identificação de
bactérias da cavidade bucal. Por meio dessas
técnicas, o patógeno pode ser diagnosticado
antes que a doença esteja em estado avança-
do, sendo possível identificar, simultaneamen-
te, mais de um patógeno. A PCR é uma das
técnicas mais utilizadas na identificação de
patógenos associados à doença periodontal,
à placa e à carie dental.1,4,6
Com o seqüenciamento, provavelmente
será possível a modificação das bactérias que
causam doenças bucais. A determinação do
genoma bacteriano permitirá ao dentista
pesquisar e compreender melhor a função
celular desses organismos responsáveis pelo
início da cárie dental e da doença periodontal.
Na terapia endodôntica, os profissionais se-
rão capazes de desenvolver geneticamente te-
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cido pulpar dentro do canal para crescer e
preencher a câmara. Será possível, também,
a regeneração da perda de tecido ósseo
alveolar, de tecido gengival e de cemento, pro-
porcionando, assim, um ótimo nível de saúde
periodontal.19
A genética do câncer tem se desenvolvi-
do devido aos avanços nas técnicas de biolo-
gia molecular e de imunohistoquímica. O cân-
cer é causado por componentes ambientais e
alterações genéticas que ocorrem nos tecidos,
com predisposição hereditária em algumas
famílias. Câncer pode ser definido como uma
coleção de distúrbios que compartilham,
como característica afim, o crescimento celu-
lar descontrolado, formando uma massa de
células chamada neoplasia ou tumor. Os genes
do câncer são classificados em três principais
categorias: os que normalmente inibem a pro-
liferação celular (supressores tumorais), os
que ativam a proliferação (oncogenes) e os
que participam do reparo do DNA e da
apoptose.16
Os genes supressores tumorais têm a pro-
priedade de bloquear a proliferação celular
descontrolada. Uma de suas características é
a de que as mutações herdadas são alelos do-
minantes em nível de indivíduo, mas
recessivos em nível celular. Isso pode ser ex-
plicado pelo fato de que apenas uma célula
tumoral é necessária para iniciar um tumor
em um indivíduo. Os genes supressores
tumorais apresentam mutações na linhagem
germinativa que causam síndromes de cân-
cer herdado, como o retinoblastoma (Rb).16
A maioria dos oncogenes origina-se de
proto-oncogenes, genes envolvidos com os
quatros reguladores básicos do crescimento
celular. Um oncogene é o resultado de uma
mutação em um proto-oncogene. Os onco-
genes são geralmente dominantes em nível
celular, ou seja, apenas uma única cópia de
um oncogene é necessária para contribuir para
o processo de multietapas de progressão
tumoral. As mutações oncogênicas de linha-
gem germinativa raramente causam síndro-
mes de câncer herdado.16
Tem sido evidenciado que genes especí-
ficos estão alterados no câncer bucal. Muitas
das proteínas desses genes podem ser detec-
tadas por técnicas de imunohistoquímica, ser-
vindo como marcadores de lesões com alto
risco de progressão para doença maligna. A
maioria dos genes e proteínas desregulados
no câncer bucal está associada à proliferação
celular. A superexpressão das oncoproteínas
ciclina D1 e mdm2 associadas com o ciclo
celular, tanto quanto a subexpressão dos
supressores p53, p16 e p27, podem ser
marcadores tumorais importantes.8
As mutações somáticas no gene p53 são
encontradas em aproximadamente 50% de
todos os tumores humanos, tornando-o o
gene de câncer geralmente mais alterado. O
p53 é ativado em resposta a sinais de dano
celular. Esse gene codifica um fator de trans-
crição que interage com pelo menos seis ou-
tros genes. Como o gene p53 é considerado
um supressor tumoral, as mutações que nele
ocorrem podem ocasionar uma perda de fun-
ção. Entretanto, algumas mutações do p53
podem ter um efeito negativo dominante, em
que o produto protéico do alelo mutado
interage e inativa o produto protéico do alelo
normal, induzindo a transformação celular.
O gene p53 é importante por dois motivos.
Primeiro, porque sua presença geralmente
indica tumores mais agressivos, com chance
de sobrevida baixa; segundo, porque ele é im-
portante na prevenção do tumor. Alguns tes-
tes labo-ratoriais mostram que a inserção de
um gene p53 normal em células tumorais re-
sulta numa diminuição significativa da
carcinogê-nese, sendo um indicativo de for-
ma alternativa de tratamento do câncer.14,16,17
O p53 é comumente encontrado mutado
no câncer humano e, algumas vezes, também
está superexpressado em outras lesões, como
o ameloblastoma. Já a proteína mdm2 é ca-
paz de se associar com a p53 e impedir a fun-
ção de supressão da p53. Sandra et al.14 anali-
saram 34 pacientes com ameloblastoma por
meio de testes imunohistoquímicos Western
blotting e ELISA. O resultado mostrou que o
p53 não está relacionado com a atividade
proliferativa no ameloblastoma, enquanto a
proteína mdm2 causou alta atividade
proliferativa, principalmente no amelo-
blastoma de células basais.
Acredita-se que o mapeamento do
genoma e a clonagem de genes para síndromes
de câncer fornecerão informações importan-
tes a respeito dos mecanismos de carci-
nogênese e dos processos biológicos funda-
mentais. O diagnóstico pré-sintomático de
membros familiares com risco de câncer e a
possibilidade de intervenções genéticas são
outras metas importantes desses estudos.16
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Atualmente, os patologistas têm dado
maior importância à identificação da apoptose
e da mitose para poderem melhor compreen-
der a cinética e o desenvolvimento de diver-
sos processos patológicos. Aparticipação das
alterações nos proto-oncogenes, genes
supressores e genes associados com a apoptose
está relacionada ao desenvolvimento e à pro-
gressão de tumores. Os avanços referentes a
conceitos, mecanismos e técnicas de identifi-
cação são importantes na determinação da
apoptose, como auxiliar no diagnóstico e no
prognóstico dos cânceres humanos.15,18
A relação entre a apoptose e a prolifera-
ção celular em um tumor é determinada pela
participação, nesses processos, dos mesmos
genes, dos mesmos inibidores do ciclo celu-
lar e das mesmas proteinoquinases, refletin-
do, assim, a cinética celular tumoral. A
apoptose é ativada por substâncias e genes
envolvidos na homeostase das células normais,
bem como em alterações patológicas especí-
ficas, como o câncer. A apoptose pode ser re-
gulada, tanto direta como indiretamente, por
oncogenes e por genes supressores de tumor.
Os genes bcl-2, c-myc, c-fos, p53, Rb, seus
homólogos e proteínas têm sido associados
com a modulação, inibição e indução da
apoptose em vários tipos de cânceres huma-
nos, em que variações da expressão desses
genes e produtos podem contribuir, retardan-
do ou aumentando o crescimento tumoral em
resposta a fatores como radiação, hormônios,
quimioterapia citotóxica e hipertermia.15
A expressão da oncoproteína bcl-2 pode
ser encontrada no esôfago, na tireóide, na ca-
beça e pescoço e em carcinomas bucais, como
o de células escamosas da língua. Alguns es-
tudos revelaram que o gene p53 interage in-
versamente com o gene bcl-2 na regulação da
apoptose. Yao et al.18 realizaram análise
imunohistoquímica de 52 pacientes com car-
cinoma espinocelular da borda lateral da lín-
gua, em que as oncoproteínas bcl-2 e p53 fo-
ram identificadas em 50% e 60% dos
pacientes cancerosos, respectivamente.
Os carcinomas espinocelulares na cavidade
bucal constituem a maior proporção de cânceres
de cabeça e pescoço e umas das principais cau-
sas de morbidade e mortalidade mundial. Os
genes supressores p53 e Rb estão freqüentemente
associados com o carcinoma espinocelular. Tam-
bém foi evidenciado que, nesse tipo de carcino-
ma, o gene p53 apresenta a capacidade de mo-
dular a expressão de vários outros genes – como
p21, mdm2, Bax e bcl-2 – envolvidos no contro-
le do ciclo celular, parada do crescimento, su-
pervisão e reparo do DNA, diferenciação celular
e no controle da apoptose.13,15
Segundo Birchall et al.,2 uma desordem
no balanço entre proliferação e apoptose po-
dem contribuir para a carcinogênese. A
apoptose pode ocorrer na porção mais superfi-
cial do epitélio displásico. A superexpressão
do gene bcl-2 nas células B prolonga a sobre-
vivência e subseqüente malignidade das cé-
lulas. De acordo com Sandra et al.,14 há rela-
tos que evidenciam a expressão das proteínas
p53 e/ou mdm2 não só em tumores malignos
e benignos nas regiões bucais e maxilofaciais
como também em lesões odontogênicas.
Ng et al.11 estudaram a expressão das
oncoproteínas p21, p53, mdm2 e Ki-67
(MIB1) para determinar se havia uma corre-
lação entre elas na diferenciação tumoral, nos
estágios dos tumores e na terapia por radiação
em 88 amostras de 56 pacientes com carcino-
ma espinocelular. Os resultados das amostras
para p21, p53, mdm2 e MIB1 foram, respecti-
vamente, 82,4%, 67,8%, 25,95 e 98,8%. Foi
evidenciado que as oncoproteínas p21 e mdm2
predominam nas regiões suprabasal e superi-
or dos tumores e que a expressão positiva da
p21 está correlacionada à expressão da mdm2,
mas não à expressão da p53. Além disso, o ní-
vel de expressão da p21 foi maior em pacien-
tes mais velhos e em mulheres. Não foi encon-
trada uma associação significativa entre p53,
mdm2 e MIB1. A expressão da p53 foi mais
elevada nos tumores com pobre diferenciação
celular e em pacientes jovens. A terapia por
radiação não alterou a expressão de nenhuma
das oncoproteínas. Os autores concluíram que
a proteína p21 estava superexpressada nos car-
cinomas de células escamosas bucais, e que essa
superexpressão estava relacionada com a pro-
liferação celular e com a expressão da mdm2,
mas era independente da p53 alterada.
De acordo com a pesquisa de Yao et al.,18
a utilização dos marcadores para p53 e bcl2
e, especialmente, sua combinação na deter-
minação dos índices proliferativos e apo-
ptótico podem contribuir para a determina-
ção prognóstica da agressividade dos
carcinomas espinocelulares da língua. Foi ve-
rificado, ainda, que a supressão do oncogene
bcl2 na regulação da apoptose contribui para
a manutenção desse tipo tumoral.
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O leiomiossarcoma é um tumor muito
raro da cavidade bucal e que apresenta dificul-
dade de identificação histopatológica entre tu-
mor maligno e benigno. Nikitakis et al.12 reali-
zaram o diagnóstico e prognóstico de dois
pacientes por imunohistoquímica e marcadores
moleculares. Os autores concluíram que a pro-
teína p53 pode ser identificada em leio-
miossarcomas, possibilitando a distinção en-
tre os dois tipos de tumores. A expressão da
proteína p53 também pode estar associada com
a alta taxa de recorrência e com o curto perío-
do de sobrevivência. Além da proteína p53, foi
identificada a expressão do oncogene mdm2.
Ambos os casos foram imunohistoqui-
micamente positivos para quinase 4 dependen-
te da ciclina (CDK4), cuja amplificação e
superexpressão tem sido considerada como um
mecanismo alternativo para a mutação no gene
Rb e a desregulação do ciclo celular. Altera-
ções na regulação do ciclo celular envolvendo
a proteína do retinoblastoma, ciclinas e
quinases dependentes da ciclina têm sido rela-
tadas em diferentes tipos de sarcomas huma-
nos, incluindo o leiomiossarcoma.
A técnica de imunohistoquímica tem con-
tribuído para uma determinação mais precisa
no prognóstico de pacientes com neoplasias,
principalmente nos casos em que o diagnósti-
co definitivo não pode ser estabelecido pela
coloração com a hematoxilina-eosina. Primei-
ro, a técnica pode ser usada rotineiramente em
tecidos já preparados; segundo, é um sistema
muito sensível, que pode detectar antígenos que
são expressos em pequenas quantidades e, se
cuidadosamente selecionados, o complexo
antígeno-anticorpo pode ser muito específico;
terceiro, os aspectos técnicos, como baixo cus-
to dos equipamentos e pequena área labo-
ratorial, são favoráveis. A seleção dos anticorpos
para esse teste é feita com base na espe-
cificidade do tumor e se o anticorpo provavel-
mente irá reagir com o tumor sob avaliação.
Essa técnica é utilizada para o estudo dos pa-
drões gerais de expressão em nível de proteí-
nas dentro de um tecido ou outra estrutura
multicelular. Os tecidos são geralmente con-
gelados ou embebidos em parafina e cortados
em secções muito finas. O anticorpo apropria-
do é utilizado para se ligar à proteína do teci-
do, podendo produzir dados de expressão dis-
poníveis para a comparação com a coloração
histológica de cortes de tecidos vizinhos.8,16
Os avanços na área da biologia molecular
são muitos. Nesta revisão, encontramos algu-
mas técnicas utilizadas para a identificação
molecular de doenças humanas e suas aplica-
ções na odontologia.
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